李敏，竇傳浩，張秋紅

（1.濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，濟(jì)南 250102； 2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355）

喘舒片由升華硫、大黃粉、鹽酸雙氯醇胺和黃芩提取物組成，具有溫腎納氣，化痰定喘的功效，適用于慢性支氣管炎，支氣管哮喘，肺氣腫，特別是喘息性氣管炎的治療[1-2]。升華硫，是由硫磺氣化后冷卻復(fù)凝結(jié)而成的固體，外用可解毒殺蟲療瘡止癢，內(nèi)服可祛痰、發(fā)汗[3-4]。

《中國藥典》2020 年版中，采用燃燒-中和法測定升華硫中硫的含量，采用中和法測定硫黃中硫的含量[5-6]，但兩種方法均有一定的局限性[7]?，F(xiàn)代研究中硫含量的測定方法主要有紫外-可見分光光度法[8]、高效液相色譜法[9]等。文獻(xiàn)報(bào)道中采用高效液相色譜法測定了喘舒片中鹽酸雙氯醇胺、黃芩苷、大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、黃芩素、漢黃芩素、蘆薈大黃素等成分含量[1-2,10-11]，但未見使用高效液相色譜法測定喘舒片原料升華硫中硫含量的報(bào)道。筆者借鑒了農(nóng)藥中及藥用橡膠制品中硫的液相色譜測定方法[8，12]，并加以改進(jìn)，建立了測定喘舒片原料升華硫中硫含量的液相色譜測定方法，對(duì)喘舒片中的硫含量進(jìn)行質(zhì)量控制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC-20A型，附二極管陣列檢測器，日本島津公司。

電子天平：MS204TS 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器公司。

超聲波清洗器：KQ-600GDⅤ型，昆山市超聲儀器有限公司。

高純硫?qū)φ掌罚杭兌葹?00%，批號(hào)為E1921242，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

甲醇：色譜純，美國天地有限公司。

磷酸：色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

喘舒片樣品：2022年度山東省藥品質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測任務(wù)中收集的樣品，共44批，涉及3家生產(chǎn)企業(yè)，編號(hào)為S1～S44，其中S1 來自A 企業(yè)，S2～S5 來自B企業(yè)，S6～S44來自C企業(yè)，均為糖衣片。實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析級(jí)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent 5 TC-C18（2）柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液（體積比為85∶15，下同）；流動(dòng)相流量：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；檢測波長：262 nm。

1.3 溶液制備

硫?qū)φ掌啡芤海?.103 3 mg/mL，取高純硫?qū)φ掌愤m量，精密稱定，用乙醇溶解、稀釋、定容。

喘舒片樣品溶液：取喘舒片樣品20 片，除去糖衣，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，精密加入乙醇100 mL，稱定，超聲處理60 min（功率250 W，頻率50 kHz），放冷，再次稱定，加入乙醇以補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

陰性樣品溶液：取按處方比例制備不含升華硫的陰性樣品,按上述喘舒片樣品溶液制備方法制得。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

分別取硫?qū)φ掌啡芤杭按嫫瑯悠啡芤?，?.2色譜條件分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得線性方程，利用儀器自帶LC Solution軟件處理色譜圖，根據(jù)保留時(shí)間及光譜圖進(jìn)行定性分析，利用外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

取硫?qū)φ掌啡芤海肈AD 檢測器進(jìn)行掃描，提取紫外吸收光譜圖如圖1 所示，硫?qū)φ掌贩謩e在202、262 nm波長處有較強(qiáng)吸收，考慮到流動(dòng)相在較短波長下有吸收，故選擇檢測波長為262 nm。

圖1 硫?qū)φ掌纷贤夤庾V

2.2 色譜條件優(yōu)化

分別考察了甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸和甲醇-0.1%乙酸三種流動(dòng)相的使用效果，結(jié)果表明，使用甲醇-0.1%磷酸為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰基線平穩(wěn)，峰形較好，故采用甲醇-0.1%磷酸為流動(dòng)相。

2.3 提取條件優(yōu)化

對(duì)喘舒片樣品溶液的提取采取不同的處理方式（超聲和加熱回流）、不同提取溶劑（甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇、水）、不同提取時(shí)間（30、45、60 min）、不同提取溶劑體積（50、100、150 mL）等進(jìn)行考察，結(jié)果以100 mL乙醇超聲60 min所得的效果較好，故選擇此方法提取喘舒片樣品。

2.4 專屬性試驗(yàn)

取硫?qū)φ掌啡芤?、喘舒片樣品溶液、陰性樣品溶液?0 μL，按照1.2 色譜條件進(jìn)樣分析，色譜圖如圖2 所示。結(jié)果表明，陰性樣品溶液色譜圖中在與硫?qū)φ掌啡芤荷V相同保留時(shí)間處無干擾峰，表明該方法專屬性良好。

圖2 硫?qū)φ掌啡芤?、喘舒片樣品溶液、陰性?duì)照品溶液色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取硫?qū)φ掌啡芤?、5、10、15、20、25 μL，按1.2色譜條件分別注入液相色譜儀，測定色譜峰面積。以硫質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算得硫含量的線性方程為y=153 396x-3 938.5,相關(guān)系數(shù)為0.999 9，線性范圍為0.309 9～2.582 5 μg。將硫?qū)φ掌啡芤阂砸掖贾鸺?jí)稀釋，在1.2 色譜條件下測定，以3 倍信噪比對(duì)應(yīng)的硫質(zhì)量作為檢出限，以10倍的信噪比對(duì)應(yīng)的硫質(zhì)量作為定量限，結(jié)果表明，方法檢出限為0.002 4 μg，定量限為0.007 2 μg。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批喘舒片樣品（S10）6 份，按1.3 方法制備喘舒片樣品溶液，在1.2色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算硫的質(zhì)量及測定結(jié)果的相對(duì)平均偏差，結(jié)果見表1。由表1 可知，測定結(jié)果的相對(duì)平均偏差為0.32%（n=6），表明該方法的重復(fù)性良好。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取喘舒片樣品（S10）溶液，分別于溶液制備后1、3、5、7、12、24 h，按1.2色譜條件進(jìn)行測定，測定值見表2。由表2可知，硫質(zhì)量測定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.14%，表明喘舒片樣品溶液在室溫24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取喘舒片樣品（S10）6 份，研細(xì)，取約0.05 g，加入硫?qū)φ掌芳s23.665 mg，精密稱定，按照1.3方法制備溶液，按照1.2色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表3。由表3可知，硫的平均加標(biāo)回收率為97.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.28%，表明該方法的準(zhǔn)確度較高。

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測定

取44 批喘舒片樣品，按照1.3 方法制備樣品溶液，按照1.2色譜條件進(jìn)樣分析，測定樣品中硫的含量,測定結(jié)果見表4。由表4 可知，44 批喘舒片樣品中，硫含量為204.47～255.93 mg/片，不同廠家、不同批號(hào)的喘舒片樣品中硫含量存在一定差異。

表4 44批喘舒片樣品中硫含量測定結(jié)果 mg/片

3 質(zhì)量分析

聚類分析常被用于衡量不同數(shù)據(jù)源間的相似性，以及把數(shù)據(jù)源分類到不同的簇中，是一種被廣泛用于液相色譜的質(zhì)量分析手段[13-14]。使用SPSS 21.0 版軟件，以硫含量為變量，采用組間聯(lián)接法，以平方歐式距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)3個(gè)廠家的44批喘舒片樣品采用系統(tǒng)聚類分析法進(jìn)行模式識(shí)別分析，結(jié)果見圖3。當(dāng)距離刻度為5時(shí)，44批喘舒片樣品可聚為4 類，其中S36、S41 聚為一類，均為C 企業(yè)產(chǎn)品；S6、S7、S11、S15、S21、S30、S32、S43等8批樣品聚為一類，均為C企業(yè)產(chǎn)品；S1、S10、S12、S13、S23、S24、S34、S37、S38、S39等10 批樣品聚為一類，為A 企業(yè)及C 企業(yè)產(chǎn)品；其余24 批樣品聚為一類，為B 企業(yè)及C 企業(yè)產(chǎn)品。以上表明，不同廠家中喘舒片樣品的硫含量存在一定的差異，C 企業(yè)不同批次的喘舒片樣品中硫含量的穩(wěn)定性存在差異。

圖3 44批喘舒片硫含量聚類分析樹狀圖

4 結(jié)語

建立的測定喘舒片中硫含量的高效液相色譜法準(zhǔn)確度高、操作簡單、專屬性強(qiáng)，可快速檢測喘舒片中的硫含量，彌補(bǔ)了中西復(fù)方制劑喘舒片缺少升華硫的含量測定，為喘舒片的質(zhì)量分析提供借鑒。

由聚類分析結(jié)果可知，不同廠家的喘舒片樣品中硫含量存在一定差異，經(jīng)調(diào)研，可能是由不同廠家的生產(chǎn)工藝不同導(dǎo)致的；C 企業(yè)不同批次喘舒片樣品中硫含量批間差異較大，說明不同批次升華硫原料的質(zhì)量可能存在較大差異，或是與該品種生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性、產(chǎn)品的儲(chǔ)存等因素有關(guān)。因此，建立硫的含量測定項(xiàng)，設(shè)置合理的限度范圍，對(duì)確保藥品的有效性、安全性及批間均衡性有重要意義。