寧霄，謝宏洋，楊茜，崔粲，黃圣南

［1.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050； 2.?？诤ｊP(guān)技術(shù)中心，?？?570311；3.三耀精細(xì)化工品銷售（北京）有限公司，北京 100022］

限進(jìn)介質(zhì)色譜的特點(diǎn)在于可以排除蛋白等大分子的影響直接對(duì)目標(biāo)小分子進(jìn)行檢測(cè)，而存在大分子干擾問(wèn)題的不僅僅存在于生物樣品分析檢測(cè)中，在食品的液相色譜、液相色譜-質(zhì)譜分析領(lǐng)域同樣存在嚴(yán)重的基質(zhì)干擾問(wèn)題，特別是動(dòng)物源性食品分析。在檢測(cè)過(guò)程中，通常為了排除這一類基質(zhì)的影響，必須選擇復(fù)雜的樣品預(yù)處理方法，如液液萃取(LLE)法[8]、固 相 萃 取(SPE)法[9-12]、“QuChERS 原則”[13-14]等，或多種方法組合使用，通常需要耗費(fèi)較高耗材成本和大量分析時(shí)間。

對(duì)乙酰氨基酚是臨床常用的解熱鎮(zhèn)痛類藥物，同樣可作為獸藥使用。人體在過(guò)量攝取對(duì)乙酰氨基酚時(shí)有可能導(dǎo)致藥物性肝損傷或急性肝衰竭[15]，因此在現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，要求對(duì)動(dòng)物源性食品中的對(duì)乙酰氨基酚殘留量進(jìn)行檢測(cè)[16]。

筆者將應(yīng)用于血藥分析領(lǐng)域的限進(jìn)介質(zhì)色譜法引入食品分析領(lǐng)域，簡(jiǎn)化了樣品處理過(guò)程，在保證測(cè)量精確度的前提下，提高了分析效率。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：半微柱高效液相色譜儀Nanospace系統(tǒng)，配備二元高壓泵、紫外檢測(cè)器，日本大阪曹達(dá)株式會(huì)社。

電子天平：ML204/02 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

離心機(jī)：GL-16C型，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3.2 不良反應(yīng)評(píng)價(jià) 根據(jù)1998年WHO抗癌藥物不良反應(yīng)表現(xiàn)及分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估各組患者化療過(guò)程中的不良反應(yīng)，分為0～Ⅳ度，無(wú)毒性：0度；輕度毒性：Ⅰ～Ⅱ度；嚴(yán)重毒性：Ⅲ～Ⅳ度。

超純水機(jī)：Milli-Q UltrapUre Ⅰon-ExTM型，美國(guó)MⅠLLⅠPORE公司。

震蕩混懸器：MT-31型，日本YAMATO公司。固相萃取柱：PEP 30 mg/1 mL，美國(guó)艾杰爾-飛諾美公司。

乙腈、乙酸、乙酸銨：色譜純，北京百靈威科技有限公司。

乙酸乙酯：色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品：批號(hào)為C12328510，上海麥克林生化科技股份有限公司。

動(dòng)物源性食品樣品：豬肉，羊肉，牛肉：市售。

1.2 液相色譜條件

限進(jìn)介質(zhì)色譜柱：CAPCELL PAK MF Ph-1 柱[150 mm×2.0 mm，5 μm，三耀精細(xì)化工品銷售(北京)有限公司]；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：0.1%乙酸-0.05 mol/L乙酸銨溶液-乙腈(體積比為95∶5)，等度洗脫，流量為0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶液制備

乙酸銨溶液：50 mmol/L，精密稱取3.85 g 乙酸銨，精密量取1 mL乙酸溶液，用水定容至1 000 mL，經(jīng)0.22 μm水膜過(guò)濾。

乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：1 mg/mL，精密稱取對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品10 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至標(biāo)線。

系列乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：精密量取乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用流動(dòng)相稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為10、25、50、100、200、400、800、1 600 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 樣品處理

將動(dòng)物源性食品樣品用研磨機(jī)充分粉碎，攪拌均勻，稱取5 g 于具塞離心管中，加入20 mL 乙酸乙酯，超聲10 min后渦旋2 min，然后以12 000 r/min離心10 min。取上清液至另一干凈的離心管中，殘?jiān)尤?0 mL 乙酸乙酯重復(fù)提取一次，再次離心后取上清液，合并上清液，于45 ℃水浴氮?dú)獯蹈?，? mL流動(dòng)相復(fù)溶后，以12 000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜，作為樣品溶液。

1.3.3 樣品測(cè)定

試樣液經(jīng)限進(jìn)介質(zhì)色譜柱高效液相色譜儀分析，測(cè)得峰面積，采用外標(biāo)法通過(guò)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

首先嘗試使用GB 29683—2013[16]使用的常規(guī)反相C18色譜柱。結(jié)果表明，因其不具有在線排除大分子蛋白及油脂的功能，故在不進(jìn)行SPE 凈化時(shí)，容易出現(xiàn)蛋白堵塞色譜柱的問(wèn)題。隨后進(jìn)行了不同鍵合相類型的限進(jìn)介質(zhì)色譜柱比較，鍵合相類型包括苯基鍵合、C8鍵合和磺酸基陽(yáng)離子鍵合。由于目標(biāo)物對(duì)乙酰氨基酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)可帶正電荷，理論上通過(guò)反相機(jī)理或陽(yáng)離子交換機(jī)理均可實(shí)現(xiàn)保留分離，但在實(shí)際試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，C8鍵合型限進(jìn)介質(zhì)色譜柱對(duì)基質(zhì)分離效果較差，樣品中雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)物存在干擾(圖1)；磺酸基陽(yáng)離子鍵合型限進(jìn)介質(zhì)色譜柱對(duì)目標(biāo)物的保留時(shí)間較短，樣品中雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)物存在干擾(圖2)；苯基鍵合型限進(jìn)介質(zhì)色譜柱對(duì)目標(biāo)物的分離相對(duì)較好，且目標(biāo)物保留時(shí)間理想(圖3)。綜合考慮分離和保留效果，最終選擇苯基鍵合型限進(jìn)介質(zhì)色譜柱。

圖1 使用C8鍵合型限進(jìn)介質(zhì)色譜柱的色譜圖

圖2 使用磺酸基鍵合型限進(jìn)介質(zhì)柱的色譜圖

圖3 使用苯基鍵合型限進(jìn)介質(zhì)柱的色譜圖

2.2 流動(dòng)相的確定

GB 29683—2013使用C18色譜柱分析動(dòng)物源性食品中的對(duì)乙酰氨基酚，流動(dòng)相為0.05 mol/L 乙酸銨溶液-乙腈(體積比為8∶2)。換用限進(jìn)介質(zhì)色譜柱后，研究發(fā)現(xiàn)，增大水相比例有利于提高對(duì)乙酰氨基酚的分離度，并獲得更大的響應(yīng)值，當(dāng)兩相體積比為95∶5時(shí)效果最佳。此外，向流動(dòng)相中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的乙酸后，在目標(biāo)物響應(yīng)值未變的基礎(chǔ)上，獲得了更穩(wěn)定的保留時(shí)間。

選擇10 μg/kg的加標(biāo)樣品，連續(xù)測(cè)定3天，每天重復(fù)分析3 次，計(jì)算色譜峰面積均值及保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。不同流動(dòng)相種類及比例對(duì)目標(biāo)物分析結(jié)果的影響如圖4所示。

圖4 使用不同流動(dòng)相時(shí)乙酰氨基酚的色譜響應(yīng)值

2.3 樣品處理方法

GB 29683—2013中樣品處理方法包括提取、除脂、凈化3 個(gè)步驟，操作步驟繁多復(fù)雜，對(duì)乙酰氨基酚的回收率不高(回收率下限要求僅為70%)。提取過(guò)程是用于將動(dòng)物源性食品中的對(duì)乙酰氨基酚提取釋放，該過(guò)程不能省略，可考慮省略除脂、凈化步驟。

筆者建立的方法省略了除脂、凈化兩個(gè)步驟，分別采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法和該方法對(duì)添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 μg/kg 的豬肉樣品進(jìn)行處理后測(cè)定，6 次平行試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果表明，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)乙酰氨基酚的平均回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為78.2%、8.9%，該方法對(duì)乙酰氨基酚的平均回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差則分別為99.3%、5.4%，明顯優(yōu)于國(guó)標(biāo)方法。該樣品處理方法不僅提高了乙酰氨基酚回收率，還節(jié)省了試劑耗材，大幅降低了樣品處理成本，減少了分析時(shí)間。

2.4 色譜柱適用性考察

使用限進(jìn)介質(zhì)色譜柱對(duì)僅進(jìn)行了液液提取的樣品分析，考察色譜柱的壽命，結(jié)果表明，分析200份樣品后色譜柱理論塔板數(shù)未見(jiàn)明顯變化，表明該色譜柱可長(zhǎng)期穩(wěn)定使用。

2.5 線性范圍、檢出限和定量限

精密吸取系列乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各20 μL，注入液相色譜儀測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程。結(jié)果顯示，乙酰氨基酚質(zhì)量濃度在10～1 000 μg/L范圍內(nèi)線性方程為y=189.808x-259.144，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，表明線性關(guān)系良好。

以3倍信噪比對(duì)應(yīng)的加標(biāo)樣品中乙酰氨基酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為方法檢出限，以10倍信噪比對(duì)應(yīng)的加標(biāo)樣品中乙酰氨基酚的質(zhì)量濃度作為方法定量限。樣品中對(duì)乙酰氨基酚的檢出限和定量限分別為0.6、2 μg/kg，優(yōu)于現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法(檢出限和定量限分別為3、10 μg/kg)。

2.6 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)

對(duì)豬肉陰性樣品進(jìn)行低、中、高3個(gè)濃度水平加標(biāo)：將豬肉陰性樣品分別使用研磨機(jī)充分粉碎并攪拌均勻后，分別稱取樣品5 g 于3 只具塞離心管中，分別加入0.1 μg/mL乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.5、1 mL，再分別加入19.9、19.5、19 mL 乙酸乙酯，超聲10 min后渦旋2 min，以12 000 r/min離心10 min，取上清液至另一干凈的離心管中，殘?jiān)尤?0 mL 乙酸乙酯重復(fù)提取一次，再次離心后取上清液，合并上清液，于45 ℃水浴氮?dú)獯蹈桑? mL 流動(dòng)相復(fù)溶，以12 000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜，進(jìn)樣測(cè)定。添加水平分別為2、10、20 μg/kg，每個(gè)添加水平進(jìn)行6 次平行試驗(yàn)，加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

由表1 可知，3 種樣品的平均加標(biāo)回收率為85.3%～105.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5.9%，表明該方法具有較好的回收率和重現(xiàn)性。豬肉、牛肉、羊肉加標(biāo)樣品色譜圖如圖5所示。

圖5 加標(biāo)樣品色譜圖

3 結(jié)語(yǔ)

將限進(jìn)介質(zhì)色譜法引入食品分析領(lǐng)域，可大幅簡(jiǎn)化樣品前處理過(guò)程，大幅降低實(shí)驗(yàn)人員的時(shí)間成本和試劑耗材成本。該方法操作簡(jiǎn)單便捷，專屬性強(qiáng)，靈敏度高。