榮輝，鄧建朝，陳勝軍，楊賢慶，艾紅，閆帥，江睿，章麗萍

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點實驗室，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣州 510300）

二十二碳六烯酸(DHA)是人體必需而又不能直接合成的多不飽和脂肪酸(PUFA)，在促進嬰幼兒視、腦神經(jīng)發(fā)育，防治老年癡呆，改善人腦記憶及抗氧化，抗腫瘤等方面具有重要的生理調(diào)節(jié)功能[1-2]。DHA傳統(tǒng)的商業(yè)來源主要為深海魚油，由于漁業(yè)資源的日益緊張，加之魚油提純工藝復(fù)雜且產(chǎn)品大多具有難以根除的魚腥味等，迫使人們漸漸把目光轉(zhuǎn)向新的DHA 來源——微藻[3]。目前已發(fā)現(xiàn)多種微藻中富含PUFA[4-5]，如裂壺藻、隱甲藻等。微藻是海洋食物鏈中PUFA 的最初生產(chǎn)者，有些藻細胞中DHA 含量較高，其相對含量可達細胞干重的5%～6%[6-7]，而且所含的PUFA 種類比較單純，進行單一成分的分離提純相對容易一些，因而利用微藻生產(chǎn)多不飽和脂肪酸是一個非常有前景的商業(yè)領(lǐng)域[8]。

國外大多采用尿包法結(jié)合高效液相色譜法制備高純度的DHA[9]，該方法消耗較多的有機溶劑，提取工藝復(fù)雜，回收率低且成本過高。目前市場上高純度的DHA標準樣品主要來源于美國Sigma公司，不僅購貨時間長，而且價格昂貴。因此急需開發(fā)一種簡單有效，相對低廉的提取方法以滿足人們對高純度DHA 日益增長的需求。上世紀80 年代初，美國Ⅰto 教授[10]發(fā)明了高速逆流色譜(HSCCC)，其流動相和固定相均為液體，很快被應(yīng)用在醫(yī)藥學(xué)、生物化工、海洋生物學(xué)、食品科學(xué)、材料學(xué)等眾多研究領(lǐng)域。近年來HSCCC 技術(shù)不斷改進和提升，已被廣泛應(yīng)用在各種大分子物質(zhì)的分離純化研究中[11-13]，如蛋白質(zhì)、色素和脂肪酸等。Cao等[14]利用HSCCC分離葡萄籽油中的亞油酸，其純度達到99%；孫磊等[15]利用HSCCC 法分離共軛亞油酸及其異構(gòu)體，最終得到的共軛亞油酸及其異構(gòu)體的純度分別可達97.05%和97.73%。由此可知，利用HSCCC 技術(shù)分離純化油脂中的不飽和脂肪酸是可行的。近年來，我國對不飽和脂肪酸類物質(zhì)的應(yīng)用開發(fā)成為熱點[16]，每年出口大量的不飽和脂肪酸產(chǎn)品，在國際市場上占有重要地位。但是，由于缺乏標樣與標準，國產(chǎn)脂肪酸類物質(zhì)多以化工原料出口，而科學(xué)研究、檢測、藥用標準品一直依賴國外進口，嚴重制約了與脂肪酸類物質(zhì)相關(guān)的科學(xué)研究與醫(yī)藥產(chǎn)品的開發(fā)。

針對國內(nèi)科研、生產(chǎn)對DHA 標準樣品的需求，筆者依據(jù)GB/T 15000.3—2008 標準樣品工作導(dǎo)則[17]，利用HSCCC技術(shù)研制了DHA標準樣品，可為含有DHA 相關(guān)產(chǎn)品的含量檢測分析及質(zhì)量控制提供技術(shù)保障。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高速逆流色譜儀：TBE-300B型，上海同田生物技術(shù)有限公司。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：GCMS-QP2010 Plus型，日本島津公司。

高效液相色譜(HPLC)儀：LC-20AD 型，日本島津公司。

紫外可見分光光度計：UⅤ 2550 型，日本島津公司。

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：Agilent 7900 型，美國安捷倫科技有限公司。

卡式水分儀：915Ti-touch型，瑞士萬通公司。

紅外光譜儀：FT-ⅠR NⅠCOLET 6700 型，美國熱電公司。

離子淌度-Q-TOF 高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀：Synapt G2-Si型，美國沃特世公司。

核磁共振波譜儀：Bruker AⅤANCE Ш HD 600型，德國布魯克公司。

高效離心機：Avanti J-26XP 型，美國貝克曼庫爾特有限公司。

冷凍干燥機：Alpha1-4型，德國Christ有限公司。

裂壺藻粉：利用松花粉垂釣法分離純化獲得的裂壺藻經(jīng)28 ℃、180 r/min發(fā)酵培養(yǎng)96 h后，在4 ℃、轉(zhuǎn) 速8 000 r/min 的 條 件 下 離 心 收 集 藻 泥，再 經(jīng)-45 ℃真空冷凍干燥24 h后獲得[18]。

細菌中性蛋白酶樣品：(1) 1 600 U/g，Protex 7 L；(2) 580 000 U/g，Protex 6 L，杰能科(中國)生物工程有限公司。

DHA原料樣品：純度為99%，美國Sigma公司。

乙腈、甲醇、正己烷：色譜純，廣州華嶼欣實驗器材有限公司。實驗所用其它試劑為分析純。實驗用水為一級水。

1.2 實驗方法

1.2.1 裂壺藻油的提取和皂化

稱取20 g 裂壺藻粉，以料液比(質(zhì)量∶體積)1∶7的比例加入濃度為0.1 mol/L、pH 4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，勻漿均質(zhì)處理5次后；再將藻液利用高通量組織研磨儀在55 Hz的條件下研磨150 s；調(diào)pH至9.5，在60 ℃恒溫水槽中，勻速攪拌下堿提2 h；利用檸檬酸鈉調(diào)反應(yīng)體系pH至6.5，加入藻粉質(zhì)量7%的中性蛋白酶，45 ℃恒溫水浴條件下酶解3 h，再利用NaOH 調(diào)pH 至9.4，加入藻粉質(zhì)量10%的堿性蛋白酶，68 ℃恒溫水浴條件下酶解6 h；將酶解液在轉(zhuǎn)速4 800 r/min條件下離心10 min后，靜置分層，取上層游離油，放入真空干燥箱中在80 ℃條件下干燥2 h，冷卻后稱量。

稱取500 mg裂壺藻油，加入0.5 mol/L的氫氧化鉀-甲醇溶液25 mL，充分搖勻后在70 ℃恒溫水浴條件下反應(yīng)1.5 h，用20%硫酸水溶液調(diào)pH 至3；再用等量體積的乙醚萃取3次，靜置分層，合并收集乙醚相，再通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醚后，用HSCCC 兩相溶劑體系正庚烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶1∶15∶1，體積比，下同)的上下相各10 mL 溶解，得到裂壺藻脂肪酸粗樣品，待利用HSCCC進行下一步的分離純化。

1.2.2 HSCCC兩相溶劑體系的選擇

利用HPLC 測定DHA 原料樣品在不同兩相溶劑體系中的分配系數(shù)(K值)，根據(jù)測得的K值選擇最適的兩相溶劑體系。先取適量的兩相溶劑體系溶解DHA 標準品，再分別取上相和下相以HPLC 法檢測，DHA在上相和下相中的色譜峰面積比值即為K值。HSCCC 兩步分離法的兩相溶劑體系分別為正庚烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶1∶15∶1)和正庚烷-甲醇-水(5∶6∶1，體積比，下同)。

1.2.3 HSCCC法分離純化DHA

先以10 mL/min的流量將兩相容積體系的上相泵入儀器螺線管中，待充滿后，將逆流色譜儀設(shè)為正轉(zhuǎn)方式，轉(zhuǎn)速為900 r/min，分離溫度為13 ℃，再以3 mL/min的流量泵入兩相容積體系的下相，以下相為流動相，待充分平衡后，取少量DHA 原料樣品溶于流動相后進樣分析，于210 nm 波長下進行紫外檢測，以確定DHA的色譜保留時間。將皂化處理后獲得的裂壺藻脂肪酸粗樣，在同樣的高速逆流色譜條件下進行兩步法分離，對照DHA色譜保留時間收集相對應(yīng)的組分并用HPLC 法進行純度檢測，最終將收集獲得的DHA 高純度樣品通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機溶劑后，再經(jīng)真空冷凍干燥，即為高純度DHA 樣品，該樣品充氮氣后密封保藏在-20 ℃冰箱。

1.2.4 純度分析

(1) HPLC 法。收集分離純化后的DHA 樣品配制成質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL 的甲醇溶液，采用HPLC面積歸一法測定其純度。HPLC檢測條件：進樣體積為20 μL，色譜柱為C18(4.6 mm×250 mm，5μm，美國安捷倫科技有限公司)分析色譜柱，柱溫為35 ℃，紫外檢測器，檢測波長為210 nm，流動相A為含0.05%(體積比)甲酸的超純水，流動相B 為乙腈，恒定流量為1 mL/min。

(2)氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法。氣相色譜條件：進樣口溫度為230 ℃，進樣體積為1 μL；色譜柱為DB-5MS 色譜柱(0.25 mm×30 m，0.25 μm，美國安捷倫科技有限公司)；采用程序升溫，先于110 ℃保留4 min，再以10 ℃/min的速度升溫至160 ℃，保留1 min，最后以5 ℃/min 的速度升溫至240 ℃，保留15 min，載氣為氦氣，流量為1.52 mL/min，進樣分流比為1∶30。

質(zhì)譜條件：質(zhì)量掃描范圍為m/z40～550，電子能量為70 eⅤ，離子源溫度為200 ℃，切除溶劑保留時間為3 min。

1.2.5 雜質(zhì)分析

(1)水分分析。采用卡式水分儀利用卡爾費休庫侖滴定直接進樣法[19]測定DHA 樣品中的水分含量，精確稱取高純度DHA 樣品10.0 mg，測定3 次，取平均值。

(2)無機元素分析。將DHA 樣品配成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的甲醇溶液。利用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ⅠCP-MS)法[20]測定Li、Be、B、Na、Mg、Al、Si 等無機元素的含量，測定3次，取平均值。

1.2.6 結(jié)構(gòu)確認

采用紫外光譜(UⅤ)、紅外光譜(ⅠR)、質(zhì)譜(MS)和核磁共振波譜(NMR)等技術(shù)對制備獲得的DHA 樣品進行結(jié)構(gòu)確認和表征，具體分析條件分別為：(1)紫外光譜采用紫外可見分光光度計對樣品進行掃描，掃描范圍為200～400 nm；(2)紅外光譜采用液體樣品制片法，掃描波數(shù)為450～4 000 cm-1；(3)質(zhì)譜為電噴霧離子源，電子能量為70 eⅤ，離子源溫度為200 ℃，掃描范圍為100～1 000；(4)核磁共振以氘代甲醇為溶劑。

1.2.7 分裝與儲存

將制備的DHA 樣品分裝在2 mL 棕色樣品瓶中，分裝是在超凈工作臺中進行的，以每瓶10 mg分裝，共分裝100 瓶。將分裝好的樣品置于一個可以密封的塑料盒中，放置在-20 ℃冰箱中保存。

1.2.8 均勻性分析

按照標準樣品工作導(dǎo)則要求，隨機抽取10瓶分裝后的DHA樣品，每瓶樣品平行測定3次。先用少量甲醇溶解DHA樣品，最終配制成質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL的DHA甲醇溶液，采用HPLC面積歸一法測定DHA樣品純度，利用方差分析法對純度分析結(jié)果進行統(tǒng)計檢驗。

1.2.9 穩(wěn)定性分析

短期穩(wěn)定性：考察制備的DHA樣品在4 ℃儲存條件下放置9 天內(nèi)的穩(wěn)定性。每3 天取3 個平行樣品采用HPLC 面積歸一法測定其純度，每個樣品均測定3 次，取平均值，樣品純度的最終檢測結(jié)果為3個平行樣品的平均值。

長期穩(wěn)定性：考察制備的DHA樣品在-20 ℃儲存條件下放置2 年內(nèi)的穩(wěn)定性。每6 個月取3 個平行樣品采用HPLC 面積歸一法測定其純度，檢測方法同上。

1.2.10 定值

根據(jù)GB/T 15000.3—2008 標準及JJF 1006—1994《一級標準物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》[21]相關(guān)規(guī)定和要求，最終選取8 家實驗室對DHA 樣品的純度進行聯(lián)合定值。從分裝好的100 瓶DHA 樣品中隨機抽取24瓶，向每家實驗室隨機寄送3瓶，各實驗室收到樣品后先將其配制成質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL 的甲醇溶液，再采用HPLC面積歸一法對其進行純度定值，每個樣品平行測定2 次，取平均值并計算標準偏差和擴展不確定度。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離純化

對所提裂壺藻油脂進行皂化處理后，在流動相流量為3 mL/min、高速逆流轉(zhuǎn)速為910 r/min、分離溫度為13 ℃的條件下利用HSCCC技術(shù)進行兩步分離純化，第一步的兩相溶劑體系為：正庚烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶1∶15∶1)，測定K值為0.84；第二步的兩相溶劑體系為：正庚烷-甲醇-水(5∶6∶1)，測定K值為0.88。最終分離結(jié)果見圖1，可獲得高純的DHA樣品。

圖1 HSCCC分離DHA色譜圖

2.2 純度分析

2.2.1 高效液相色譜法

利用HSCCC技術(shù)分離獲得的DHA樣品按20%流動相A 和80%流動相B 以恒定流量1 mL/min 進行HPLC等度洗脫40 min，色譜圖見圖2?？鄢軇┥V峰以后，未發(fā)現(xiàn)明顯雜質(zhì)峰，以面積歸一法定量，最終分離獲得的DHA樣品經(jīng)高效液相色譜法測得的HPLC純度為99.12%。

圖2 DHA樣品的HPLC純度分析色譜圖

2.2.2 GC-MS法

將制備的DHA 樣品先經(jīng)甲酯化后再進行GCMS 法純度分析，以正己烷經(jīng)同樣甲酯化后作為空白對照，所測得的總離子流色譜圖見圖3，采用面積歸一法定量，測定其純度為99.18%。

圖3 DHA樣品的GC-MS總離子流色譜圖

2.2.3 水分分析

采用卡爾費休庫倫電位滴定法直接測定DHA標準樣品中的水分含量，測量3 次水分質(zhì)量分數(shù)的平均值為(0.241±0.012)%。

2.2.4 無機元素分析

將DHA 樣品配成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的甲醇溶液。利用ⅠCP-MS 法測定Li、Be、B、Na、Mg、Al、Si 等無機元素的含量，3 次測定的平均結(jié)果為：Li、Be、B、Na、Mg、Al、Si、S、Cl、K，Ca、Sc、Ti、Ⅴ、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、Ge、As、Se、Br、Kr、Rb、Sr、Y、Zr、Nb、Mo、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、Ⅰn、Sn、Sb、Te、Ⅰ、Cs、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Hf、Ta、W、Re、Os、Ⅰr、Pt、Au、Hg、Tl、Pb、Bi、Th 和U的含量和為(0.000 032 4±0.000 000 5)%。

2.3 結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 紫外光譜分析

通過紫外可見分光光度計掃描，可知制備的DHA 標準樣品的最大吸收波長在200 nm 處左右，由于處于紫外吸收波長臨界端，可能影響結(jié)果的穩(wěn)定性，因此實際檢測選取吸收值較最大處稍低的210 nm，DHA樣品的紫外光譜圖見圖4。

圖4 DHA樣品的紫外光譜圖

2.3.2 紅外光譜分析

先將制備的DHA樣品進行液膜壓片處理，再利用紅外光譜儀對其進行掃描，掃描波長范圍為450～4 000 nm。結(jié)果顯示，711 cm-1為順式烯烴上C—H的變形振動，1 711 cm-1為羧基的C＝O 伸縮振動，2 965 cm-1為烷烴的C—H伸縮振動，3 014 cm-1為烯烴的C＝C 雙鍵伸縮振動，這些均為DHA 的特征峰。樣品的紅外光譜吸收波長數(shù)據(jù)均存在這些特征基團，并與DHA文獻數(shù)據(jù)相符[22]。

2.3.3 高分辨質(zhì)譜分析

采用電噴霧電離源(ESⅠ)負離子模式和Resolution分析模式，質(zhì)量掃描范圍為m/z50～1 000，獲得豐度最大的離子峰為327.232 7[M-H]-，推斷DHA 的相對分子質(zhì)量為328.232 7。

2.3.4 核磁共振分析

以氘代甲醇為溶劑，DHA 樣品1H-NMR 和13CNMR數(shù)據(jù)見表1。

表1 DHA樣品的核磁共振波譜數(shù)據(jù)(氘代試劑：氘代甲醇)

根據(jù)1H-NMR 譜顯示由化學(xué)位移可以確認有5個CH2分別位于5 個烯鍵中間，另有1 個—CH2—CH2—分子片段與—C＝O相連。根據(jù)13C-NMR譜，確定有7 個不飽和度，由12 個烯碳CH (6 個不飽和度)和1 個羰基碳C (1 個不飽和度)組成。分子中除去C＝O，—CH2—CH3和6個—CH＝CH—的分子結(jié)構(gòu)片段，還有7個亞甲基。綜上所述，樣品的核磁共振譜圖所給出的結(jié)構(gòu)信息與化合物DHA 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式相符[23-24]，故鑒定為DHA。

2.4 均勻性分析

DHA 標準樣品的HPLC 純度分析結(jié)果經(jīng)F檢驗，以確定樣品的均勻性數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，結(jié)果見表2和表3。

表2 DHA標準樣品均勻性分析結(jié)果

表3 DHA標準樣品純度方差分析結(jié)果

樣品瓶間方差：sbb2=1.086 7×10-5，樣品瓶間標準偏差：sbb=0.003 3，重復(fù)性標準偏差：sr=0.007 5，均勻性檢驗的不確定度ubb=sbb=0.003 3。查F界值表可知F0.05(9，20)=2.94，而根據(jù)DHA 樣品數(shù)據(jù)計算所得F=1.57＜F0.05(9，20)，則說明該DHA標準樣品是均勻的。

2.5 穩(wěn)定性分析

2.5.1 短期穩(wěn)定性

考察DHA 樣品短期穩(wěn)定性的數(shù)據(jù)見表4。由表4 可知，所測DHA 樣品純度平均值結(jié)果，統(tǒng)計分析差異不顯著，測得的純度平均值在所測時間內(nèi)均未隨時間的改變而明顯升高或降低，表明該樣品在4 ℃儲存條件下9天時間內(nèi)是穩(wěn)定的。

表4 短期穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.5.2 長期穩(wěn)定性

DHA 樣品長期穩(wěn)定性考察數(shù)據(jù)見表5。從表5可看出，所測得的樣品純度平均值在所測時間內(nèi)均未隨時間的變化而顯著升高或降低，純度測定值保持在(98.84±0.02)%的范圍內(nèi)，表明該樣品在-20 ℃儲存條件下2年時間內(nèi)是穩(wěn)定的。

表5 長期穩(wěn)定性試驗結(jié)果

采用t檢驗法統(tǒng)計分析DHA 樣品的純度數(shù)據(jù)，利用直線作經(jīng)驗?zāi)Ｐ?，根?jù)直線斜率變化是否顯著，預(yù)測樣品的穩(wěn)定性。計算結(jié)果為：截距b0=98.84，直線斜率b1=0.000 3，斜率標準偏差s(b1)=0.000 274。當自由度為n-2=3和P=0.95 (95%置信水平)時經(jīng)查表可知，t(0.95，3)=3.18，而|b1|=0.000 3＜t(0.95，3)×s(b1)=0.000 87，說明直線斜率變化不顯著，因此樣品在-20 ℃儲存條件下2年時間內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 定值

由8家實驗室采用HPLC面積歸一法對DHA樣品純度進行聯(lián)合定值，對定值的統(tǒng)計分析結(jié)果見表6。

表6 DHA樣品HPLC純度定值的統(tǒng)計分析結(jié)果

根據(jù)標準樣品工作導(dǎo)則規(guī)定及研制報告要求，由8家實驗室聯(lián)合定值試驗引入的標準不確定度為總平均值的不確定度：u(--x)=0.08；由樣品均勻性引入的標準不確定度為：ubb=sbb=0.003 3，由樣品穩(wěn)定性引入的標準不確定度為：ults=2×s(b1)×t=0.013 2，則DHA樣品定值引入的擴展不確定度為：

DHA樣品的HPLC純度測定值為99.19%，扣除水分和無機元素含量，最終DHA樣品純度的定值結(jié)果為98.95%，擴展不確定度為0.17% (k=2，P=0.95)。

3 結(jié)語

采用HSCCC技術(shù)制備獲得高純度的DHA樣品并根據(jù)GB/T 15000.3—2008《標準樣品工作導(dǎo)則》規(guī)定及要求研制DHA標準樣品并進行純度定值，定值結(jié)果為98.95%，置信度95%的擴展不確定度為0.17% (k=2，P=0.95)。研制的DHA標準樣品可用于含有DHA相關(guān)產(chǎn)品的含量檢測分析和質(zhì)量控制等。