袁偉寧, 魏玉紅, 郭建國, 郭致杰

(甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所,甘肅 蘭州 730070)

赤眼蜂(Trichogramma)是目前市場化程度最高的一類寄生性天敵昆蟲,已被普遍應(yīng)用于多種農(nóng)業(yè)害蟲的綜合治理,如稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocismedinalis)、亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)、松毛蟲(Dendrolimus)和棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)等[1-4]。在防治應(yīng)用過程中,不同環(huán)境因子對赤眼蜂生物學(xué)特性、適應(yīng)性和寄生率等諸多方面有顯著影響[5-7],因此需要對赤眼蜂進(jìn)行抗逆性篩選,以使其適應(yīng)本地小氣候環(huán)境。赤眼蜂對逆境的適應(yīng)不僅僅表現(xiàn)為功能基因的表達(dá)和體內(nèi)物質(zhì)調(diào)節(jié),其內(nèi)共生菌群落和功能也極大地影響著宿主對環(huán)境因子的適應(yīng)性[8]。內(nèi)共生菌與宿主昆蟲的趨利關(guān)系是雙向的,昆蟲內(nèi)環(huán)境及特殊組織在為共生菌提供優(yōu)越生存條件的同時,共生菌也為宿主反饋諸多益處[9]。例如,抵御外源有害生物侵入及非生物脅迫[10-11],提高昆蟲對化學(xué)農(nóng)藥的抗性[12-13],增強(qiáng)宿主對寄主植物的適應(yīng)性[14],調(diào)控宿主營養(yǎng)代謝與生殖代謝等[15-16]?？梢?內(nèi)共生菌對昆蟲生物學(xué)特性及環(huán)境適應(yīng)等多方面的調(diào)控發(fā)揮著重要作用。內(nèi)共生菌主要分布在昆蟲中腸[17]、卵巢以及特殊細(xì)胞或組織中[18],通常以變形菌門(Proteobacteria)細(xì)菌豐度最高,其次為擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinomycetes)、衣原體門(Chlamydiae)和厚壁菌門(Firmicute)等[19]。與宿主關(guān)聯(lián)最為密切的內(nèi)共生菌主要有α-變形菌、β-變形菌、γ-變形菌、擬桿菌門,以及厚壁菌門乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、放線菌屬(Actinomyces)、螺旋菌屬(Heliobacillus)等[20],這些內(nèi)共生菌在營養(yǎng)供應(yīng)及消化方面起著關(guān)鍵作用,可提升昆蟲對攝食營養(yǎng)的吸收,促進(jìn)生長發(fā)育[21-24],尤其以合成并供給氨基酸和膽固醇等功能最為重要[25]。另外,內(nèi)共生菌還對調(diào)節(jié)昆蟲內(nèi)環(huán)境有積極作用,例如宿主通過中腸上皮細(xì)胞感知細(xì)菌信號,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)提升,此過程主要依賴細(xì)菌與腸道上皮細(xì)胞交互接觸進(jìn)行調(diào)節(jié),或者通過擴(kuò)散性分子與代謝物進(jìn)行調(diào)節(jié)[26-28]。除此之外,內(nèi)共生菌還可以激活多種昆蟲的免疫致敏效應(yīng),提升宿主對病原物的抵抗力。例如大腸埃希菌(Escherichiacoli)等能夠有效激活昆蟲的Toll和Imd免疫通路,誘導(dǎo)抗菌肽在宿主內(nèi)環(huán)境中表達(dá),從而快速清除異源致病菌[29-30]。另外在昆蟲耐熱性和抗藥性等方面,內(nèi)共生菌也有突出貢獻(xiàn),可以在一定范圍內(nèi)調(diào)節(jié)宿主昆蟲的抗逆性,從而增強(qiáng)對環(huán)境的適合度[31-32]。昆蟲內(nèi)共生菌除了影響宿主的機(jī)體免疫功能、內(nèi)環(huán)境調(diào)節(jié)、營養(yǎng)平衡和生長發(fā)育外,還影響昆蟲的生殖與性別。例如腸桿菌科殺雄菌屬(Arsenophnus)[33-34],能通過抑制宿主中心體的形成使有絲分裂期紡錘體功能缺失[35],最終迫使雄性被消除;類似具有殺雄作用的還有沃爾巴克氏菌(Wolbachia),其能引起宿主細(xì)胞質(zhì)不相容,使雄蟲(攜帶沃爾巴克氏體)與雌蟲交配產(chǎn)生的受精卵發(fā)生胚胎期死亡,甚至可以使雄性個體喪失基因型特征,進(jìn)而致使雄性個體消亡[36-37]。綜上所述,昆蟲內(nèi)共生微生物直接或間接對宿主發(fā)揮著多方面的重要作用,因此對昆蟲內(nèi)共生菌的研究,有利于從這一特殊生物群體出發(fā)而獲得對特殊條件具有耐性的天敵昆蟲。赤眼蜂作為一種重要的天敵,目前國內(nèi)工廠化繁殖技術(shù)主要依賴于“大卵繁殖”方式,即利用非自然寄主柞蠶(Antereaeapernyi)、蓖麻蠶(Philosamiacynthia)等鱗翅目昆蟲的大型卵進(jìn)行擴(kuò)繁?！按舐选弊鳛槌嘌鄯涞氖澄?其中內(nèi)共生菌平行傳遞對赤眼蜂生理生化等各方面有重要影響。因此,為了探明柞蠶卵與赤眼蜂內(nèi)共生菌的相互聯(lián)系,本研究對柞蠶卵和赤眼蜂的內(nèi)共生菌進(jìn)行了測定,并進(jìn)行了生物群落功能分析,以期為赤眼蜂擴(kuò)繁實(shí)踐提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本提取 ①柞蠶卵:柞蠶(Antheraeapernyi)購自大連龍祥絲棉有限責(zé)任公司(遼寧莊河)。將初羽化的柞蠶雌蛾腹部剖開,取出柞蠶卵置于滅菌的蒸餾水中進(jìn)行多次清洗,直至柞蠶卵表面無黏液、無雜質(zhì)。濾出柞蠶卵后用4% NaCl溶液沖洗1次,沖洗后的卵浸泡在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的次氯酸鈉溶液中1 min,后轉(zhuǎn)入70%酒精中1 min,然后用5%硫代硫酸鹽清洗3 min,再用蒸餾水沖洗1次,最后在無菌條件下濾出晾干,剔除未成熟或破損的卵。共剖取約100 mL卵備用。通過“圓錐四分法”從中隨機(jī)取10 mL供提取DNA,-80 ℃保存;剩余90 mL用于接種松毛蟲赤眼蜂備用。②赤眼蜂:松毛蟲赤眼蜂(Trichogrammadendrolimi)蜂種由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。將備用的柞蠶卵按照蜂卵比1∶10進(jìn)行接蜂,接蜂24 h后篩去種蜂,將接蜂后的卵裝在培養(yǎng)盒內(nèi),置于(25±1) ℃、相對濕度為75%、24 h全暗的人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng),培養(yǎng)第8天后12 h剖卵觀察赤眼蜂發(fā)育進(jìn)程,在蛹初羽化未咬破柞蠶卵卵殼時置于-20 ℃終止發(fā)育。通過“圓錐四分法”隨機(jī)從終止發(fā)育的柞蠶卵中提取出赤眼蜂3 mL,用4% NaCl溶液沖洗1次,沖洗后的卵浸泡在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的次氯酸鈉溶液中1 min,轉(zhuǎn)入70%酒精中1 min,然后用5%硫代硫酸鹽清洗3 min,再用蒸餾水沖洗1次,最后在無菌條件下濾出晾干,置于-80 ℃下保存?zhèn)溆?。③DNA提取:將保存?zhèn)溆玫某嘌鄯浜妥跣Q卵樣本30 mg,置于滅菌的1.5 mL的離心管中進(jìn)行DNA混合提取。用研磨棒于液氮冷凍條件下將樣品研磨成粉末狀,按照血液/組織、細(xì)胞基因組提取試劑盒(DP304)說明書提取總DNA,總DNA溶解于50 μL TE緩沖液中,用NanoDrop微量分光光度計(jì)測定OD260/280值,當(dāng)比值為1.8～2.5時則為合格,-80 ℃保存,送至百邁克生物公司(http:// www. biomarker. com.cn/)進(jìn)行建庫測序。

1.1.2 主要試劑與儀器設(shè)備 血液/組織,細(xì)胞基因組提取試劑盒(DP304,天根生化科技(北京)有限公司),4%NaCl,1%次氯酸鈉,75%酒精,5%硫代硫酸鹽。智能人工氣候箱(RXZ-500D-LED,寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠);高速離心機(jī)(3K15,博勱行儀器有限公司);漩渦儀(X-HC,國旺實(shí)驗(yàn)儀器廠);數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4,金壇市佳美儀器有限公司);NanoDrop微量分光光度計(jì)(NanoDrop 2000c,賽默飛世爾科技(中國)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 建庫測序 提取樣品總DNA后,以混合樣品為模板,利用16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,所選引物:16S-F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,16S-R:5′-GGTTACCTTGTTACG-ACTT-3′,目標(biāo)片段約為1 500 bp。反應(yīng)條件:94 ℃變性5 min,94 ℃ 30 s,56 ℃退火1 min,72 ℃ 1 min,35個循環(huán),72 ℃延伸7 min。反應(yīng)體系:10×PCR Buffer 3 μL;10 mmol/L dNTPs 1 μL;50 mmol/L MgCl21 μL;Platinum TMTaqDNA polymerase (Thermo Fisher Scientific) 0.5 μL;引物各0.5 μL;DNA模板1 μL;ddH2O補(bǔ)足至30 μL。對其產(chǎn)物進(jìn)行純化和定量,使形成測序文庫,建好的文庫先進(jìn)行文庫質(zhì)檢,OD260/280大于1.8時為合格。文庫用Illumina HiSeq 2500平臺進(jìn)行測序,高通量測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識別分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列(Sequenced Reads)。高通量測序及數(shù)據(jù)處理部分均由百邁克生物公司(http://www.biomarker.com.cn/)完成。

1.2.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理 根據(jù)PE reads之間的Overlap關(guān)系,將Hiseq測序得到的雙端序列數(shù)據(jù)拼接成一條序列Tags,同時對Reads的質(zhì)量和拼接效果進(jìn)行質(zhì)控過濾。主要有以下三個步驟:①PE reads拼接:使用 FLASH v1.2.7軟件,通過overlap對每個樣品的 reads 進(jìn)行拼接,得到的拼接序列即原始 Tags 數(shù)據(jù)(Raw Tags);②Tags過濾:使用Trimmomatic v0.33軟件,對拼接得到的 Raw Tags進(jìn)行過濾,得到高質(zhì)量的Tags 數(shù)據(jù)(Clean Tags);③去除嵌合體:使用UCHIME v4.2軟件,鑒定并去除嵌合體序列,得到最終有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)。

1.2.3 OTU分析 根據(jù)不同的相似度水平,對所有序列進(jìn)行OTU劃分,如果序列之間的相似性高于97%就可以把它定義為一個分類操作單元(OTU),每個OTU對應(yīng)于一種代表序列。使用QIIME(version 1.8.0)軟件中的 UCLUST對Tags在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類、獲得OTU,并基于Silva和UNITE分類學(xué)數(shù)據(jù)庫對OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋。

1.2.4 Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì) 使用Mothur(version v.1.30)軟件,對樣品Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行評估。

1.2.5 Shannon指數(shù)曲線 利用 Mothur 軟件和R語言工具依據(jù)各樣品的測序量在不同測序深度時的Shannon指數(shù)(反映樣品中微生物多樣性的指數(shù))繪制Shannon多樣性指數(shù)稀釋曲線,以此反映各樣本在不同測序數(shù)量時的微生物多樣性。

1.2.6 系統(tǒng)進(jìn)化分析 用QIIME軟件挑選出屬分類學(xué)水平上豐度最高的OTU的序列作為代表序列,進(jìn)行多重序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,然后通過Python語言工具繪制圖形。進(jìn)化樹中每個分支代表一個物種,分支長度為兩個物種間的進(jìn)化距離,即物種的差異程度。

1.2.7 16S功能基因預(yù)測分析 使用PICRUSt軟件通過比對16S測序數(shù)據(jù)獲得的物種組成信息,推測樣本中的功能基因組成,從而分析不同樣本間在功能上的差異。首先對生成的OTU-table進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化;然后通過每個OTU對應(yīng)的Greenge-ne ID獲得OTU對應(yīng)的KEGG和COG家族信息,從而計(jì)算該KEGG和COG的豐度。在屬水平對不同樣本間的物種豐度使用STAMP中的G-TEST(大樣本:注釋到的功能基因數(shù)目大于20)和Fisher(小樣本:注釋到的功能基因數(shù)目小于20)檢驗(yàn)方法進(jìn)行樣本間的顯著性差異檢驗(yàn),對組間進(jìn)行T-test檢驗(yàn),P-value閾值為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果與質(zhì)量評估

樣品測序結(jié)果如表1所示,共獲得柞蠶卵共生微生物原始序列33 504條;赤眼蜂共生微生物原始序列140 147條,過濾后的優(yōu)化序列數(shù)分別為31 697和132 853。獲得柞蠶卵有效序列數(shù)30 571個,平均序列長度417 bp;獲得赤眼蜂有效序列數(shù)130 719個,平均序列長度411 bp,二者有效序列數(shù)分別占原始總序列數(shù)的91.26%和93.29%。根據(jù)樣品稀釋性曲線(圖1)和香農(nóng)指數(shù)曲線(圖2),二者均較早達(dá)到了平臺期,因此樣本量繼續(xù)增加不會引起內(nèi)共生菌物種數(shù)量的增加,樣品序列充分,可以進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

圖1 多樣本稀釋曲線 Fig.1 Multi-sample rarefaction curves

圖2 多樣本香農(nóng)曲線 Fig.2 Multi-sample shannon curves

表1 柞蠶卵和赤眼蜂樣品高通量測序基本信息Table 1 Basic information of high-throughput sequencing of tussah egg and Trichogramma sample

2.2 OTU分析

對Tags在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類,獲得赤眼蜂和柞蠶卵內(nèi)共生菌的OTU個數(shù)。由圖3可知,赤眼蜂內(nèi)共生菌聚類獲得185個OTU,柞蠶卵內(nèi)共生菌聚類獲得259個OTU,混合共有373個OTU,因此二者共同享有 71個OTU,其中赤眼蜂特有114個OTU,柞蠶卵特有188個OTU。

圖3 OTU數(shù)分布 Fig.3 OTU numbers distribution在97%的相似度水平下,通過聚類tags獲得OTU數(shù)OTUs were obtained by clustering tags at 97% similarity level

2.3 內(nèi)共生菌物種分類與多樣性分析

對OTU進(jìn)行去低含量篩除,得到最終的OTU,并統(tǒng)計(jì)出各分類單元下注釋物種的tags數(shù)(表2)。在屬分類階元下,柞蠶卵有22 855 tags被鑒定,赤眼蜂有116 143 tags被鑒定。柞蠶卵內(nèi)共生菌被鑒定的物種數(shù)量在各級分類單元上均高于赤眼蜂,分別隸屬于17門,35綱,62目,109科,186屬;赤眼蜂內(nèi)共生菌分別隸屬于11門,20綱,48目,84科,133屬。

表2 聚類結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 2 Clustering results statistics

對屬分類水平上豐度前15的共生菌進(jìn)行相對豐度分析(圖4)。赤眼蜂相對豐度大于1%的內(nèi)共生菌主要為葡萄球菌屬(Staphylococcus)、沙雷氏菌屬(Serratia)、芽胞桿菌屬、腸桿菌屬(Enterobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、泛菌屬(Pantoea)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingobium)、埃希氏桿菌-志賀氏菌屬(EscherichiaShigella)和中生根瘤菌屬(Mesorhizobium),其中葡萄球菌所占比例最大,相對豐度為61.18%;柞蠶卵相對豐度大于1%的內(nèi)共生菌主要為不動桿菌屬(Acinetobacter)、假單胞菌屬、副球菌屬(Paracoccus)、腸桿菌屬、微小桿菌屬(Exiguobacterium)、鞘氨醇單胞菌屬、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、微桿菌屬(Microbacterium)、埃希氏桿菌-志賀氏菌屬、芽胞桿菌屬、短桿菌屬(Brevibacterium) 和泛菌屬,其中不動桿菌屬所占比例最大,相對豐度為12.72%。二者共有菌群為腸桿菌屬、假單胞菌屬、泛菌屬、埃希氏桿菌-志賀氏菌屬、芽胞桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬,除芽胞桿菌屬分布在厚壁菌門外,其他均分布在變形菌門γ-變形菌綱。Alpha多樣性分析表明柞蠶卵內(nèi)共生菌數(shù)量和物種豐富度均高于赤眼蜂(表3),同時Shannon指數(shù)表明,柞蠶卵的內(nèi)共生菌均勻度較赤眼蜂高。由于赤眼蜂內(nèi)共生菌均勻度較低,導(dǎo)致群落多樣性也相對較低?？傮w來看,赤眼蜂和柞蠶卵OTU覆蓋率趨近于1,表明統(tǒng)計(jì)結(jié)果真實(shí)反應(yīng)了樣本中微生物的分布情況。

圖4 屬水平的物種分布Fig.4 Distribution of species at genus level在屬分類單元上對赤眼蜂和柞蠶卵內(nèi)豐度前15的共有內(nèi)共生菌進(jìn)行分析,統(tǒng)計(jì)時剔除未分類的物種Endosymbiotic bacteria of top 15 shared within Trichogramma and Tussah-egg were analyzed on genus category,the unclassified species was discarded when it was for statistics

表3 Alpha多樣性指數(shù)Table 3 Alpha diversity index

2.4 物種系統(tǒng)進(jìn)化分析

對內(nèi)共生菌進(jìn)行不同分類階元下的物種分析表明(圖5),豐度比例高于0.1%的物種主要分布在變形菌門、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門、放線菌門、螺旋體菌門(Saccharibacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)和異常球菌門(Deinococcus)。其中變形菌門物種多樣性較其他門分類階元下的物種多樣性高,但是厚壁菌門的物種豐度最高,以葡萄球菌屬占據(jù)主要豐度。總體來看,屬分類階元下,厚壁菌門內(nèi)共生菌主要分布在赤眼蜂體內(nèi),其他門下內(nèi)共生菌主要分布在柞蠶卵內(nèi)。豐度分析表明,赤眼蜂體內(nèi)葡萄球菌屬分布量最高,而柞蠶卵內(nèi)不動桿菌屬分布量最高。

圖5 屬水平GraPhlAn樹Fig.5 GraPhlAn tree under genera cluster level對屬分類水平上豐度大于0.1%的OTU序列進(jìn)行多重序列比對,并構(gòu)建GraPhlAn系統(tǒng)進(jìn)化樹。進(jìn)化樹中每種顏色的區(qū)域代表一個門,每條樹枝代表一個物種,樹枝長度為兩個物種間的進(jìn)化距離,樹枝上的節(jié)點(diǎn)大小代表物種在該分類介元下的相對豐度,節(jié)點(diǎn)越大相對豐度越高。進(jìn)化樹外每個環(huán)代表一個樣品組,環(huán)上的柱代表一種內(nèi)共生菌在屬分類介元上兩個樣本間相對豐度的高低,紅色代表該物種在兩個樣本間的相對豐度較高,藍(lán)色相反。環(huán)外面不同顏色的柱代表屬分類水平下一個物種在總物種中的豐度,并注釋了豐度大于1%的物種Multiple sequence alignments were performed for OTU sequences with abundance greater than 0.1% at the genus level, and then the GraPhlAn tree was constructed. In the evolutionary tree, each color region represents a Phylum, each branch represents a species, the length of branch is the evolutionary distance between two species, and the size of a node on a branch represents the relative abundance of a species under each classification element, the bigger node, the higher relative abundance. Each circle in the evolutionary tree represents a sample, and the column on the outside circle represents the relative abundance of endosymbiotic bacteria between two samples. Red represents the higher relative abundance of sample, while blue represents the opposite. Different colored columns represent the abundance of endosymbiotic bacteria at the genus level in the total species; finally annotate species with the abundance greater than 1%

系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,放線菌門豐度高于1%的白桿菌屬(Leucobacter)和微桿菌屬遺傳距離較近;厚壁菌門豐度高于1%的三種內(nèi)共生菌遺傳距離相同,分別為芽胞桿菌屬、微小桿菌屬和葡萄球菌屬;擬桿菌門豐度高于1%的內(nèi)共生菌中彎桿菌屬(Flectobacillus)和噬纖維細(xì)菌科(Cytophagaceae)的一種不可培養(yǎng)的內(nèi)共生菌遺傳距離較近,此兩種內(nèi)共生菌與黃桿菌屬(Flavobacterium)和擬桿菌科的一種不可培養(yǎng)的內(nèi)共生菌遺傳距離較遠(yuǎn);變形菌門豐度高于1%的內(nèi)共生菌中腸桿菌屬(Enterobacter)、埃希氏桿菌屬(Escherichia)、泛菌屬和沙雷氏菌屬遺傳距離較近,不動桿菌屬和水棲菌屬(Enhydrobacter)遺傳距離較近,溶桿菌屬(Lysobacter)和寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)遺傳距離較近,其他內(nèi)共生菌遺傳距離均較遠(yuǎn)。

2.5 內(nèi)共生菌群落在代謝途徑和蛋白質(zhì)功能上的差異性分析

通過KEGG分析柞蠶卵和赤眼蜂之間共生微生物群落的功能基因在代謝途徑上的差異和變化(圖6)。

圖6 KEGG代謝途徑差異分析Fig.6 Difference analysis of KEGG metabolic pathway左側(cè)柱圖為不同功能基因在兩組樣品中的豐度,中間所示為95%置信度區(qū)間內(nèi)功能基因的豐度差異,右側(cè)為P值The figure, the bar on the left represents the abundance of different functional genes in the two samples, the middle part represents the differences of abundance within the 95% confidence interval, and the number on the right part was the P value

共觀測了微生物群落的40種基因功能,代謝功能差異最顯著的為胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能。為了適應(yīng)環(huán)境,赤眼蜂內(nèi)共生菌群落的胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能顯著強(qiáng)于柞蠶卵內(nèi)共生菌,其次為碳水化合物代謝功能。而柞蠶卵內(nèi)共生菌群落氨基酸代謝功能明顯強(qiáng)于赤眼蜂,其次為異生物降解和代謝功能。在所有生物功能當(dāng)中,微生物群落功能主要為氨基酸代謝功能和碳水化合物代謝功能,但是二者在赤眼蜂和柞蠶卵中的功能強(qiáng)弱有差異,在赤眼蜂體內(nèi),碳水化合物代謝功能較強(qiáng),而在柞蠶卵內(nèi),氨基酸代謝功能較強(qiáng)。

通過COG對微生物群落蛋白質(zhì)功能進(jìn)行分類,共預(yù)測了微生物群落的23種蛋白質(zhì)功能(圖7)。除普通功能和未知功能外,赤眼蜂和柞蠶卵內(nèi)共生菌群落蛋白質(zhì)的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝功能最強(qiáng),其次為碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)代謝功能。赤眼蜂內(nèi)共生菌群落蛋白質(zhì)的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝功能顯著強(qiáng)于柞蠶卵,但是柞蠶卵內(nèi)共生菌群落蛋白質(zhì)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)代謝功能和信號傳導(dǎo)功能顯著強(qiáng)于赤眼蜂。相較于其他蛋白質(zhì)功能,細(xì)胞骨架功能、胞外結(jié)構(gòu)功能、RNA加工修飾功能和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)動態(tài)功能均非常弱。

圖7 COG蛋白功能預(yù)測分析Fig.7 Functional prediction of COG protein左側(cè)柱圖為不同功能蛋白在兩組樣品中的豐度,中間所示為95%置信度區(qū)間內(nèi)蛋白豐度的差異,右側(cè)為P值A(chǔ)s shown As shown in the figure, the bar on the left represents the abundance of different functional protein in the two samples, the middle part represents the differences of abundance within the 95% confidence interval, and the number on the right part was the P value

3 討 論

共生菌與昆蟲互利依存且相互影響的現(xiàn)象廣泛存在,柞蠶卵在生產(chǎn)中作為赤眼蜂的營養(yǎng)基質(zhì)和生活場所,其內(nèi)共生菌極大地影響著赤眼蜂的生存、生長和發(fā)育等諸多方面。本研究通過16S rRNA高通量測序技術(shù)研究了赤眼蜂和柞蠶卵的內(nèi)共生菌。研究表明,赤眼蜂和柞蠶卵內(nèi)豐度或多樣性較高的內(nèi)共生菌主要分布在變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria),其次還有螺旋體菌門(Saccharibacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)和異常球菌門(Deinococcus),這與其他昆蟲共生菌群落的研究報(bào)道相似,例如褐飛虱(Nilaparvatalugens)和桔小實(shí)蠅(Bactroceradorsalis)等[20,38-39]。內(nèi)共生菌物種分類與多樣性分析表明,柞蠶卵的內(nèi)共生菌物種多樣性較赤眼蜂高,二者共同享有71個OTU,屬分類水平上豐度前15且大于1%的共有共生菌為腸桿菌屬、假單胞菌屬、泛菌屬、埃希氏桿菌-志賀氏菌屬、芽胞桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬,除芽胞桿菌屬外,其他均分布在變形菌門γ-變形菌綱。變形菌門是昆蟲共生細(xì)菌中最大的門類,可在昆蟲的中腸中生存,對宿主的生物學(xué)特性、存活率、抗逆性、碳氮循環(huán)、營養(yǎng)代謝和免疫等方面有重要影響[40]。例如腸桿菌屬能夠相對促進(jìn)逆境脅迫中桔小實(shí)蠅壽命延長[41]。另外,對黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)的研究表明,腸道共生菌對PGRP-SCs(Peptidoglycan recognition protein SC)分子活性有影響,PGRP-SC表達(dá)上調(diào)又對共生菌平衡具有修復(fù)作用,并限制干細(xì)胞增殖,降低宿主細(xì)菌性炎癥反應(yīng),從而延長果蠅壽命[42];假單胞桿菌屬能分泌蛋白酶,消化并利用蛋白質(zhì),并將氨基酸或能量提供給宿主[43];或直接降解脂肪酸和碳水化合物[44-45],幫助宿主消化食物;鞘氨醇桿菌屬對烷烴、雜環(huán)芳香烴具有很強(qiáng)降解能力,其糖苷水解酶等碳水化合物活性酶能夠促進(jìn)碳源物質(zhì)降解和吸收[46],因此猜測,此類共生菌可能與腸桿菌屬相似,對赤眼蜂消化食物和生長發(fā)育具有積極的促進(jìn)作用;泛菌屬對昆蟲遭受氧化脅迫引起的損傷具有良好的修復(fù)作用,能顯著提高宿主在逆境脅迫的耐受性,例如鹽脅迫[47],這可能對赤眼蜂適應(yīng)逆境至關(guān)重要。研究表明,昆蟲的內(nèi)共生菌在種群間或種群內(nèi)的傳播方式主要為垂直傳遞和水平傳遞,其中初級共生菌多為垂直傳遞,次級共生菌多為水平傳遞[48]。本研究中的腸桿菌屬等共有共生菌為次級共生菌,因此極有可能在赤眼蜂和柞蠶卵之間進(jìn)行水平傳播,即通過赤眼蜂取食柞蠶卵卵黃進(jìn)行傳遞。

赤眼蜂和柞蠶卵除共有內(nèi)共生菌外,還有許多特有內(nèi)共生菌。在赤眼蜂體內(nèi),葡萄球菌屬所占比例最大,相對豐度達(dá)61.18%。葡萄球菌屬對宿主昆蟲的免疫反應(yīng)具有調(diào)節(jié)效應(yīng),例如金黃葡萄球菌能誘導(dǎo)家蠶BmToll9-2基因表達(dá)上調(diào),這對昆蟲保持免疫致敏應(yīng)答和抵抗外源病原生物具有關(guān)鍵作用[49]。除此之外,金黃葡萄球菌屬還能誘導(dǎo)中腸、馬氏管和血淋巴堿性磷酸酶活性顯著升高,從而增強(qiáng)宿主抵抗外源細(xì)菌侵染的免疫防御反應(yīng)[50]。相對于赤眼蜂,柞蠶卵內(nèi)共生菌中不動桿菌屬所占比例最大,相對豐度為12.72%。不動桿菌屬多為鱗翅目昆蟲的優(yōu)勢共生菌[51-52],它是一種非發(fā)酵糖的革蘭陰性球桿菌,廣泛分布于自然界和昆蟲腸道內(nèi),酯酶活性作用強(qiáng),能促進(jìn)氨芐西林、青霉素、氯氰菊酯、溴氰菊酯等物質(zhì)的代謝,有助于提高宿主抗性[53-55]。由此可見,赤眼蜂和柞蠶卵中優(yōu)勢內(nèi)共生菌均與宿主免疫和抗逆性相關(guān),這可能是長期協(xié)同進(jìn)化過程中為了抵御不良外因而進(jìn)行的選擇性演替。但是值得注意的是,赤眼蜂體內(nèi)豐度僅次于葡萄球菌屬的為沙雷氏菌屬,其對昆蟲具有致病致死作用,其中粘質(zhì)沙雷氏菌對亞州玉米螟、三角新卷葉蛾(Olethreutesleucaspis)等具有較高致死性[56]。研究表明,寄生蜂對感病寄主卵有一定的驅(qū)避性,感病寄主卵不利于寄生蜂子代的發(fā)育[57-58]。赤眼蜂體內(nèi)的沙雷氏菌屬是否影響其對于感病柞蠶卵和健康卵的選擇性,需要進(jìn)一步系統(tǒng)研究。

諸多研究表明,昆蟲內(nèi)共生菌在營養(yǎng)代謝方面可為宿主昆蟲提供氨基酸等物質(zhì),如布赫納氏菌屬(Buchnera)[59-60],甚至部分昆蟲(如白蟻)可通過共生菌彌補(bǔ)氮代謝的缺乏[61]。在碳水化合物代謝方面,內(nèi)共生菌能將大分子碳源物質(zhì)轉(zhuǎn)化為短鏈脂肪酸,包括乙酸、丙酸和丁酸等[62]。例如耐氧乳酸菌可將白蟻體內(nèi)的單糖發(fā)酵為乳酸,而擬桿菌屬則能將乳酸發(fā)酵為乙酸和丙酸等供宿主吸收利用[63]。通過KEGG和COG分析柞蠶卵和赤眼蜂之間共生微生物群落代謝途徑上的功能基因,并對微生物群落蛋白質(zhì)功能進(jìn)行了預(yù)測。結(jié)果顯示,微生物群落功能基因主要與氨基酸代謝和碳水化合物代謝相關(guān)。對微生物群落蛋白質(zhì)功能預(yù)測顯示,赤眼蜂和柞蠶卵內(nèi)共生菌群落的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝功能最強(qiáng),其次為碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)代謝功能,可見COG功能預(yù)測與KEGG分析的功能基因量相呼應(yīng)。上述功能分析結(jié)果與Nikoh等[59]、Philipp等[64-65]諸多前人學(xué)者對昆蟲內(nèi)共生菌群落功能研究相吻合。盡管赤眼蜂和柞蠶卵內(nèi)共生菌群落均以氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝和碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)代謝較強(qiáng),但是二者之間有差異。赤眼蜂內(nèi)共生菌群落蛋白質(zhì)的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝顯著(P<0.05)強(qiáng)于柞蠶卵,而柞蠶卵內(nèi)共生菌群落蛋白質(zhì)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)代謝和信號傳導(dǎo)功能顯著(P<0.05)強(qiáng)于赤眼蜂,這種差異可能與共生菌的宿主種類相關(guān)。赤眼蜂以柞蠶卵為營養(yǎng)來源,需要將柞蠶卵的氨基酸和蛋白質(zhì)等物質(zhì)消化吸收,并轉(zhuǎn)化為自身營養(yǎng)物質(zhì),因此氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝功能較強(qiáng)。

本研究從內(nèi)共生菌物種分類與多樣性分析、系統(tǒng)進(jìn)化、內(nèi)共生菌群落代謝途徑和蛋白質(zhì)功能分析深刻闡述了赤眼蜂和柞蠶卵內(nèi)共生菌群落的異同點(diǎn),以及二者內(nèi)共生菌群落功能差異,為柞蠶卵與赤眼蜂內(nèi)共生菌的平行傳遞奠定了基礎(chǔ),對探索赤眼蜂對寄主選擇的適用性具有重要意義。但是本文僅基于16S rRNA高通量測序方法對共生菌群落進(jìn)行了研究,不同種屬內(nèi)共生菌在柞蠶卵和赤眼蜂之間的平行傳遞還需要通過“抑菌-接菌”的方法做進(jìn)一步驗(yàn)證。