王海琪，史芳芳

（新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆 烏魯木齊 830088）

草莓（Fragaria×ananassa Duch.）為薔薇科多年生草本植物，富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，果實(shí)味道甜美，生育期短，結(jié)果早和產(chǎn)量高，備受人們喜愛(ài)，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近些年來(lái)，草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，但是由于種植面積不斷擴(kuò)大、種植連作等原因，導(dǎo)致草莓土傳病害嚴(yán)重[1]。尖孢鐮刀菌為一類可在土壤內(nèi)生存又可侵染作物的兼性寄生真菌。由尖孢鐮刀菌草莓?；停‵usarium oxysporum Schl.f.sp.fragariae）侵染引起的枯萎病是引起連作草莓普遍發(fā)生的重要土傳病害，嚴(yán)重制約了草莓的可持續(xù)發(fā)展[2-3]。目前生產(chǎn)上大量使用化學(xué)殺菌劑防治草莓枯萎病，導(dǎo)致病原菌抗藥性及農(nóng)藥殘留等問(wèn)題加劇，對(duì)生態(tài)環(huán)境和食品安全造成了極大危害，因此探索有效防控草莓枯萎病的生物方法刻不容緩。

十字花科蔬菜具良好的化感作用[4]，將十字花科蕓薹屬蔬菜的植株殘?bào)w翻埋進(jìn)土壤，具有改善土壤質(zhì)量、提高土壤微生物多樣性、促進(jìn)草莓生長(zhǎng)的作用，同時(shí)還可降低土壤中有害真菌數(shù)量，減少枯萎病的發(fā)生。王德江等[5]通過(guò)研究4 種蕓薹屬蔬菜生物熏蒸對(duì)黃瓜枯萎病的影響，發(fā)現(xiàn)4 種蔬菜提取液對(duì)枯萎病病菌的生長(zhǎng)均有抑制作用，其中芥菜生物熏蒸處理防病效果達(dá)到52.9%。劉琳等[6]、劉瓊等[7]研究發(fā)現(xiàn)，芥菜和茼蒿蔬菜提取物可抑制西瓜專化型尖孢鐮刀菌，有效抑制菌體生長(zhǎng)，抑菌率可達(dá)90%。十字花科蔬菜屬于新疆常見(jiàn)作物，且其體內(nèi)化感效應(yīng)對(duì)改善土壤質(zhì)量有明顯效果，因此本研究選取十字花科蔬菜探討對(duì)連作草莓普遍發(fā)生枯萎病的影響。

本研究對(duì)所采集的草莓病株進(jìn)行病原菌分離、培養(yǎng)、鑒定，通過(guò)DNA 鑒定出草莓專尖孢鐮刀菌導(dǎo)致的草莓枯萎病，對(duì)分離出的病原菌進(jìn)行藥劑試驗(yàn)；并采用菌絲生長(zhǎng)法測(cè)定5 種十字花科蔬菜對(duì)草莓?；图怄哏牭毒氖覂?nèi)毒力，篩選其殺菌活性，旨在為草莓枯萎病防治和蔬菜源農(nóng)藥先導(dǎo)化合物的研發(fā)提供技術(shù)依據(jù)。同時(shí)利用十字花科蔬菜之間的化感作用合理安排與草莓輪、間作[8]，可改善土壤微生物結(jié)構(gòu)，減輕病害發(fā)生。

1 材料及方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

試驗(yàn)于2023 年5 月在新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所組培室進(jìn)行。

1.2 材料與試劑

蔬菜：采用種植于新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所冷棚的芥菜、茼蒿、甘藍(lán)、油菜和雪里蕻，經(jīng)風(fēng)干后用小型粉碎機(jī)制成粉末狀樣品，過(guò)40 目篩，放置于密封袋備用。

供試菌株： 尖孢鐮刀菌草莓?；停‵usarium oxysporum Schl.f.sp.fragariae） 采自十二師農(nóng)科所草莓種苗繁育基地，通過(guò)采集病株分離、純化、DNA 鑒定后，經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證并保存的菌種。

試劑PDA（potato dextrose agar）培養(yǎng)基、95%乙醇、注射用氨芐青霉素鈉，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)（JBVS 840 型），蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；電子天平（PL203），Mettler Toledo；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9080B 型），上海瑯玕實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器（LDZH-200KBS 型），上海申安醫(yī)療器械廠；氮吹儀（CM-24T），北京成萌偉業(yè)技有限公司；粉樣機(jī)，小熊磨粉機(jī)；90 mm、培養(yǎng)皿，移液槍，鑷子、接種刀、50 mL 離心管等。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 蔬菜提取液的制備

準(zhǔn)確稱取10.0 g 芥菜、茼蒿、甘藍(lán)、油菜和雪里蕻粉末各3 份，分別加入10 倍體積的95%乙醇，浸提24 h，并用超聲波輔助提取2 h，過(guò)濾提取液，使用氮吹儀（50 ℃）濃縮至10 mL，制成濃度為1.0 g/mL 的芥菜、茼蒿、甘藍(lán)、油菜和雪里蕻提取物溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 氨芐青霉素鈉溶液的配制

稱取氨芐青霉素鈉0.5 g 置于50 mL 離心管中，定容并配制成濃度為10 mg/L 氨芐青霉素鈉溶液。

1.4.3 不同蔬菜提取物的抑菌活性

將1.0 g/mL 芥菜、茼蒿、甘藍(lán)、油菜和雪里蕻提取物分別稀釋成0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 g/mL 的不同濃度溶液，無(wú)菌條件下與培養(yǎng)基混合制成含藥平板，同時(shí)加入濃度為10 mg/L 的氨芐青霉素鈉溶液（抑制細(xì)菌生長(zhǎng)），以多菌靈作為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌水作為陰性對(duì)照。無(wú)菌條件下，將供試病菌接種至PDA 培養(yǎng)基后，于28 ℃培養(yǎng)箱中恒溫暗培養(yǎng)5 d，待菌種長(zhǎng)滿平板時(shí)，在菌落邊緣處打取直徑為7 mm 的菌餅備用。

1.4.4 蔬菜提取物對(duì)西瓜枯萎病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

取制備好的菌餅接種于含藥培養(yǎng)基中央，重復(fù)3 次。放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑[9]，按照公式（1）（2）計(jì)算菌落直徑和抑菌率。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010 和SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Duncan和LSD 進(jìn)行多重差異分析，采用DPS 7.05 制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蔬菜提取液的抑菌活性

由圖1～2 可以看出，隨不同蔬菜提取液濃度的降低，抑菌率呈現(xiàn)出隨之降低的趨勢(shì)，其中0.4～1 g/mL 對(duì)尖孢鐮刀菌有明顯抑制作用，濃度大于0.8 g/mL 時(shí)，抑菌率均大于50%；蔬菜提取液濃度為0.05～0.2 g/mL 的抑菌效果不明顯，濃度為0.05 g/mL 時(shí)抑制作用接近于4%。不同濃度下各蔬菜提取液對(duì)尖孢鐮刀菌抑菌效果差異明顯，在高濃度下以茼蒿和芥菜抑菌效果最好，濃度在1 g/mL 時(shí)，茼蒿和芥菜抑菌率最高，顯著高于甘藍(lán)、雪里蕻、油菜，分別高12.58%、3.89%、3.42%和12.08%、3.56%、2.96%。

圖1 不同濃度的蔬菜提取液對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of vegetable extracts with different concentrations on mycelial growth

圖2 不同濃度蔬菜提取液對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌率Fig.2 Antibacterial rate of vegetable extracts with different concentrations against F.oxysporum

2.2 5 種蔬菜提取物對(duì)尖孢鐮刀菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

以茼蒿、甘藍(lán)、芥菜、雪里蕻、油菜5 種蔬菜提取液的濃度為橫坐標(biāo)，以抑菌率為縱坐標(biāo)，得出5 種蔬菜提取物對(duì)草莓尖孢鐮刀菌的毒力回歸方程及EC50、斜率、相關(guān)系數(shù)等。EC50是衡量藥劑毒力大小的重要指標(biāo)，其EC50值越大，表明該藥劑毒力越?。环粗?，則表明藥劑毒力越大[10]。

由表1 可以看出，茼蒿的EC50為0.413 0 g/mL，說(shuō)明茼蒿提取液毒力大，對(duì)尖孢鐮刀菌抑制效果最好，芥菜、雪里蕻和油菜EC50在0.473 5～0.491 5 g/mL 之間，說(shuō)明這三種蔬菜提取液毒力相當(dāng)，甘藍(lán)的EC50最高，對(duì)病原菌抑制作用最低。毒力回歸方程的斜率k 代表了病菌對(duì)殺菌劑的敏感性，斜率k 越大，敏感性越高，反之，敏感性越低[11]。表1 中可以看出茼蒿、雪里蕻、油菜3 種蔬菜斜率k 較大，說(shuō)明尖孢鐮刀菌對(duì)這3 種蔬菜敏感性較高，病原菌對(duì)甘藍(lán)敏感性較低。

表1 不同蔬菜提取液對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of different vegetable extracts on the growth of F.oxysporum hyphae

3 結(jié)論

目前生產(chǎn)上防控草莓枯萎病多采用化學(xué)防治方法，如百菌清、代森錳鋅和多菌靈等，但化學(xué)防控越來(lái)越難以滿足草莓產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展需求，因此急需探索對(duì)草莓枯萎病防控的生物防治方法，已有不少研究關(guān)于蔬菜中的揮發(fā)油和萜類化合物等對(duì)病害病原菌具有抑制和殺滅作用[12-14]。本研究通過(guò)菌絲生長(zhǎng)法測(cè)定，發(fā)現(xiàn)5 種十字花科蔬菜提取液均對(duì)草莓?；图怄哏牭毒幸欢ǖ囊志Ч?，但不同蔬菜提取液抑制作用不同，蔬菜提取物對(duì)尖孢鐮刀菌的最佳抑制濃度為1 g/mL，此濃度下5種蔬菜抑菌活性大小依次為茼蒿、芥菜、油菜、雪里蕻、甘藍(lán)，這與劉琳等[6]發(fā)現(xiàn)芥菜提取物對(duì)西瓜枯萎病的抑制濃度相當(dāng)。5 種十字花科蔬菜提取液中茼蒿、油菜、雪里蕻和芥菜對(duì)尖孢鐮刀菌具有較強(qiáng)的毒力，EC50值分別達(dá)到了0.413 0、0.473 5、0.474 9、0.491 5 g/mL。綜合發(fā)現(xiàn)，茼蒿提取液對(duì)草莓枯萎病的抑制作用最好，這與李珊珊等[15]研究結(jié)果相似，她認(rèn)為茼蒿中含有的綠原酸能抑制西瓜枯萎病病原菌菌絲生長(zhǎng)，降低病菌孢子萌發(fā)率。十字花科蕓薹屬蔬菜是中國(guó)栽培面積最大、消費(fèi)量最大的蔬菜，因此研究生物質(zhì)體內(nèi)活性物質(zhì)對(duì)蔬菜病害的抑菌效果有重要的現(xiàn)實(shí)意義，田間可通過(guò)茼蒿等十字花科蔬菜與草莓輪作進(jìn)行草莓枯萎病的防治，后續(xù)可采集輪作后蔬菜與土壤酚酸類物質(zhì)進(jìn)行研究，進(jìn)一步探索十字花科蔬菜對(duì)枯萎病病原菌的化感作用，為今后研發(fā)生物殺菌劑提供理論依據(jù)。