李亞楠，郭明珠，邵娟娟，桑亞新，孫紀(jì)錄*

（1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院 河北滄州061100 2 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 河北保定 071000）

大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabryanus）屬鯉形目、鰍科、花鰍亞科、副泥鰍屬，主要分布于長(zhǎng)江、嘉陵江和岷江水系、遼河中下游、黃河及黑龍江等地區(qū)，是一種營(yíng)底棲生活的小型魚類[1]。其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，具有極快的生長(zhǎng)速度和較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，近年來，逐漸成為廣大養(yǎng)殖戶選擇的品種之一[2]。

泥鰍體表能分泌出大量黏液，尤其是在冷鏈運(yùn)輸和加工預(yù)處理過程中。泥鰍黏液入藥味甘、性平，具有補(bǔ)中益氣、利尿除濕等功效[3]。魚皮的黏液層含有各種來自表皮杯狀細(xì)胞和上皮細(xì)胞的分泌物，這些分泌物與許多重要的生物學(xué)功能有關(guān)[4]。泥鰍黏液中含有超氧化物歧化酶、抗菌肽、多糖等多種生物活性物質(zhì)[5]。目前，在泥鰍運(yùn)輸和加工過程中產(chǎn)生的大量黏液被廢棄，不僅造成極大的資源浪費(fèi)，還帶來環(huán)境污染問題。

泥鰍黏液多糖作為一類生物活性物質(zhì)，已有少數(shù)研究報(bào)道。Qin 等[6]從普通泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）黏液中分離純化出一種分子質(zhì)量為1.30×105u 的泥鰍多糖（Misgurnus anguillicaudatus polysaccharide，MAP），該多糖具有很強(qiáng)的抗氧化能力、免疫活性和恢復(fù)肝臟損傷等功能。孫智華等[7]利用泥鰍黏液制備出一種分子質(zhì)量為1.57×104u 的具有保濕性的透明質(zhì)酸，在化妝品和醫(yī)藥行業(yè)具有應(yīng)用價(jià)值。Kimura 等[8]從泥鰍黏液中分離并鑒定出一種含神經(jīng)氨酸的脫胺糖蛋白。孫朋朋[9]從泥鰍黏液中分離出含有O-型糖基化結(jié)構(gòu)的凝集素。目前，關(guān)于泥鰍的研究報(bào)道主要集中于養(yǎng)殖和遺傳方面，對(duì)泥鰍黏液中的多糖研究較少，而且主要是針對(duì)普通泥鰍的黏液。對(duì)大鱗副泥鰍的黏液多糖及其抗糖活性鮮有報(bào)道。

本文從泥鰍副產(chǎn)物資源的綜合利用角度出發(fā)，擬從大鱗副泥鰍黏液中分離多糖，對(duì)其化學(xué)組成、理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，并探討其體外抗糖活性，以期為大鱗副泥鰍黏液資源應(yīng)用到食品和醫(yī)藥行業(yè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 大鱗副泥鰍：購(gòu)于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)科技市場(chǎng)。

葡萄糖、苯酚、三氯乙酸、酒石酸鉀鈉、3，5-二硝基水楊酸，福晨化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；溴化鉀，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸、氫氧化鈉、氯化鈉為分析純級(jí)，天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；牛血清白蛋白（BSA）、考馬斯亮藍(lán)G-250，北京索萊寶科技有限公司；甲醇、正丁醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氟乙酸，上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.1.2 設(shè)備與儀器 TGL21M 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙易達(dá)儀器有限公司；YTLG-12A 臺(tái)式真空冷凍干燥機(jī)，上海葉拓科技有限公司；721G 可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；Multiskan Spectrum 酶標(biāo)儀，Thermo scientific 公司；高效液相（HPLC）色譜儀（LC-20A），日本島津公司；核磁共振波譜儀（Bruker 400M），德國(guó)Bruker 公司；Nicolet iS50 型傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR），美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；X 射線衍射儀（日本理學(xué)Ultima IV），熱重分析儀（NETZSCH STA 409 PC/PG），耐馳科學(xué)儀器商貿(mào)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PDMP 的化學(xué)組成分析

1.2.1.1 PDMP 的制備 鮮活泥鰍→蒸餾水浸沒暫養(yǎng)12 h→收集黏液→濃縮→超聲→醇沉→去蛋白→透析→冷凍干燥→泥鰍黏液多糖。

1.2.1.2 PDMP 的成分測(cè)定 采用苯酚硫酸法測(cè)定總糖含量[10]，3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖含量[11]，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[12]，采用BaCl2-明膠法測(cè)定硫酸基含量[12]，采用咔唑硫酸法測(cè)定糖醛酸含量[12]。

1.2.1.3 紫外光譜分析 使用紫外（UV）分光光度計(jì)掃描，將PDMP 樣品制備1 mg/mL 的去離子水溶液[13]，并在200～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)記錄光譜。

1.2.1.4 分子質(zhì)量測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)采用HPGPC法[14]測(cè)定PDMP 的平均分子質(zhì)量，以葡聚糖T-10，T-40，T-70，T-500 和T-2000 葡聚糖為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定獲得 “分子質(zhì)量-保留時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)曲線”。

1.2.1.5 單糖組成

1）樣品提取

a）固體樣本提取 取干凈的色譜瓶，精確稱量多糖樣品5 mg，加入1 mL 2 mol/L TFA 酸溶液，105 ℃加熱6 h。通氮?dú)?，吹干。加入甲醇清洗，再吹干，重?fù)甲醇清洗2～3 次。加入無菌水溶解，轉(zhuǎn)入色譜瓶中待測(cè)。

b）液體樣本提取 取適量的上清液，旋轉(zhuǎn)濃縮或氮?dú)獯蹈?。加? mL 2 mol/L TFA 酸溶液，105 ℃加熱6 h。通氮?dú)猓蹈?。加入甲醇清洗，再吹干，重?fù)甲醇清洗2～3 次。加入無菌水溶解，轉(zhuǎn)入色譜瓶中待測(cè)。色譜系統(tǒng)采用的是Thermo ICS5000 離子色譜系統(tǒng)（ICS5000，Thermo Fisher Scientific，USA），利用電化學(xué)檢測(cè)器對(duì)單糖組分進(jìn)行分析檢測(cè)。

2）儀器參數(shù) 采用DionexTMCarboPacTMPA20（150 mm×3.0 mm，10 μm）液相色譜柱；進(jìn)樣量為5 μL。流動(dòng)相A（0.1 mol/L NaOH），流動(dòng)相B（0.1 mol/L NaOH，0.2 mol/L NaAc），流速0.5 mL/min；柱溫為30 ℃；洗脫梯度：0 min A 相/B 相（95∶5，V/V），30 min A 相/B 相（80∶20，V/V），30.1 min A 相/B 相（60∶40，V/V），45 min A 相/B 相（60∶40，V/V），45.1 min A 相/B 相（95 ∶5，V/V），60 min A相/B 相（95∶5，V/V）。

1.2.1.6 傅里葉變換紅外光譜 紅外光譜（IR）測(cè)定：將PDMP 和KBr 按質(zhì)量比1∶100 混合研磨均勻（提前于105 ℃的烘箱中烘干），并壓成1 mm 薄片在4 000～500 cm-1范圍內(nèi)掃描，測(cè)定多糖的有機(jī)官能團(tuán)。

1.2.1.7 核磁共振波譜（NMR）測(cè)定 PDMP 的1H NMR 和13C NMR 的測(cè)定：取20 mg PDMP 溶解在1 mL 氧化二氘（D2O）中，使用400 MHz 傅立葉變換核磁共振波譜儀。在25 ℃下記錄1H 和13C的NMR 光譜[10]。

1.2.2 理化性質(zhì)分析

1.2.2.1 熱穩(wěn)定性測(cè)定 采用STA449C 型同步熱分析儀，測(cè)定PDMP 的熱穩(wěn)定性能[15]。取10 mg 樣品，測(cè)試條件：溫度范圍30～700 ℃，升溫速率（β）5℃/min，氮?dú)鈿夥?，氣體流量20 mL/min。

1.2.2.2 結(jié)晶度測(cè)定 采用X-射線衍射儀（XRD）測(cè)定PDMP 的結(jié)晶度[16]。XRD 在散射角范圍（2θ，10°～80°）下進(jìn)行，步長(zhǎng)和曝光時(shí)間分別為0.05 s 和1 s。

1.2.2.3 微觀結(jié)構(gòu)觀察 參照何坤明等[17]的方法，將樣品干燥至恒重，取適量進(jìn)行黏臺(tái)、鍍金后，使用HitachiS-4800 掃描電子顯微鏡在放大500 倍和2 000 倍觀察PDMP 表面的微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.3 體外降血糖活性

1.2.3.1 α-葡萄糖甘酶抑制活性測(cè)定 α-葡萄糖甘酶的活性測(cè)定根據(jù)Getachew 等[16]的方法并略作改動(dòng)，將PDMP 分別配制成不同濃度梯度的多糖溶液（1.0，3.0，5.0，7.0，9.0 mg/mL），分別取400 μL的樣品與50 μL α-葡萄糖甘酶（0.2 U/mL）混合，在37 ℃下反應(yīng)10 min，反應(yīng)所用緩沖溶液為0.1 mol/L，pH 5.5 的磷酸鹽緩沖溶液，然后加入1 mg/mL 還原型谷胱甘肽和PNPG，分別為50 μL 和100 μL，在37 ℃下反應(yīng)30 min 后，通過加入1 mL NaCO3（0.1 mol/L）終止催化反應(yīng)。以阿卡波糖為陽性對(duì)照。α-葡萄糖甘酶抑制率計(jì)算方法：

式中，As——樣品組的吸光值；Ab——陰性空白對(duì)照組（不含樣品和酶）的吸光值；Ac——樣品對(duì)照組（不含酶）的吸光值。

1.2.3.2 α-淀粉酶抑制活性的測(cè)定 將100 μL α-淀粉酶溶液和不同濃度的多糖溶液混合并在25 ℃下反應(yīng)10 min，然后加入可溶性淀粉溶液100 μL，繼續(xù)反應(yīng)10 min，隨后加入200 μL 3，5-二硝基水楊酸并在沸水中加熱5 min，然后將混合物冷卻至室溫并用3 mL 去離子水稀釋。在540 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以阿卡波糖為陽性對(duì)照。α-淀粉酶抑制率計(jì)算方法：

式中，As——樣品組的吸光值；Asc——樣品對(duì)照組（不含酶）的吸光值；Ac——陰性對(duì)照組（不含樣品）的吸光值；Abc——陰性空白對(duì)照組（不含樣品和酶）的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

3 次重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果以 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，使用Microsoft Office ExceL 2010 處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Origin 2018軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PDMP 的化學(xué)組成分析

2.1.1 PDMP 中的主要化學(xué)成分 表1 顯示了PDMP 的化學(xué)成分。

表1 PDMP 的主要化學(xué)成分Table 1 Main chemical constituents of PDMP

表2 PDMP 的凝膠過濾色譜分析Table 2 Analytical results of PDMP by GPC

如表1 所示，PDMP 含有（2.87±0.09）%的蛋白質(zhì)和（95.51±2.27）%的總糖，其還原糖含量為（13.28±0.10）%，硫酸基含量為（23.41±0.87）%，不含糖醛酸。以上研究結(jié)果表明制備的PDMP 純度較高，可以用于后續(xù)的測(cè)定。此外，多糖中含有大量的硫酸基，表明可能與多種功能活性相關(guān)，例如抗腫瘤、抗氧化、抗凝血等活性，有研究表明硫酸基與降血糖功能存在一定相關(guān)性，可進(jìn)一步研究其降血糖活性。

2.1.2 PDMP 的紫外光譜 PDMP 通過紫外-可見光譜進(jìn)行檢測(cè)，吸收光譜如圖1 所示。

圖1 PDMP 的UV 光譜Fig.1 UV spectra of PDMP

由圖1 可以看出，在200 nm 波長(zhǎng)處存在多糖的特征吸收峰，PDMP 在260～280 nm 處無明顯吸收峰，表明不存在核酸類和蛋白類雜質(zhì)，說明PDMP 的純度較高，而在280 nm 波長(zhǎng)處，只出現(xiàn)微弱吸收峰，表明PDMP 經(jīng)脫蛋白處理后，有極少量蛋白與多糖緊密結(jié)合[18]，這與Bradford 法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的結(jié)果一致，說明去除蛋白的效果明顯。

2.1.3 PDMP 的分子質(zhì)量 多糖的分子質(zhì)量被證實(shí)是影響多糖的理化和生物活性差異的重要指標(biāo)[14]。

PDMP 的高效凝膠滲透色譜（HPGPC）的測(cè)定結(jié)果顯示，PDMP 的主要組分的重均分子質(zhì)量為362 928 u，數(shù)均分子質(zhì)量為237 749 u。多分散性指數(shù)（Mw/Mn）為1.527，接近1，說明PDMP 的平均分子質(zhì)量分布較集中。PDMP 的Mw 為362 928 u。分子質(zhì)量的表征有助于進(jìn)一步研究其與活性的關(guān)系，并有助于了解其潛在的應(yīng)用價(jià)值。

2.1.4 PDMP 的單糖組成 如圖2a 所示混合標(biāo)準(zhǔn)品中各單糖的出峰時(shí)間依次為3.692，7.584，7.892，9.95，11.392，13.392，14.125，16.509，18.067，34.192，34.867，36.725，38.992 min。

圖2 單糖標(biāo)準(zhǔn)品（a）和PDMP（b）的離子色譜圖Fig.2 Ion chromatograms of standard substance（a）and PDMP（b）

根據(jù)單糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化的保留時(shí)間鑒定PDMP 的單糖組成，如圖2b 所示，PDMP 的單糖組成主要由巖藻糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖和木糖組成，其物質(zhì)的量比為13.27 ∶5.68 ∶2.31 ∶2.23 ∶0.45。根據(jù)已發(fā)表的泥鰍黏液多糖的文獻(xiàn)表明，單糖組成有一定差異，已經(jīng)報(bào)道的泥鰍黏液多糖的單糖組成的主要結(jié)構(gòu)單體由半乳糖、巖藻糖和甘露糖（5∶4∶1）組成[19]；本文中PDMP 主要組分巖藻糖和半乳糖，所占百分比分別為55.42%和23.74%，甘露糖、葡萄糖和木糖所占百分比分別為9.66%，9.33%，1.86%。這可能是由于原料的種類、產(chǎn)地及生活習(xí)性不同導(dǎo)致。以上結(jié)果表明，PDMP 主要為巖藻半乳糖，此外FT-IR 光譜分析中有α-型糖苷鍵的信號(hào)，因此單糖組分中的糖有可能存在α 異構(gòu)型。

2.1.5 PDMP 的FT-IR 光譜分析 FT-IR 分析是確定多糖基本結(jié)構(gòu)特征的經(jīng)典方法。FT-IR 光譜的指紋區(qū)域是基于對(duì)特定波數(shù)吸收峰的分析[20]，官能團(tuán)分析基于范圍從4 000～1 333 cm-1的特征吸收峰面積，1 000 cm-1以下的指紋區(qū)域提供了更多關(guān)于復(fù)雜結(jié)構(gòu)的信息[21]。

如圖3 所示，在3 423 cm-1附近的特征性強(qiáng)寬帶表明氫鍵中存在O-H 拉伸[22]，表明多糖鏈的分子間和分子內(nèi)相互作用很強(qiáng)。2930 cm-1和1400～1 200 cm-1處分別對(duì)應(yīng)C-H 伸縮振動(dòng)和C-H 變角振動(dòng)[23]；1 642 cm-1和1 554 cm-1處的雙峰歸因于-CH2-CO-中的C=O 的伸縮振動(dòng)及PDMP 中的結(jié)晶水[24-25]；在1 188，1 118 cm-1和1 060 cm-1處的吸收峰是吡喃環(huán)骨架的C-O 變角振動(dòng)吸收峰[26]，表明分子中存在C-O-H 和C-O-C 結(jié)構(gòu)[27]；在1 060 cm-1和615 cm-1處為硫酸根的伸縮振動(dòng)峰[26]；出現(xiàn)在884 cm-1附近的吸收峰，表明吡喃糖的存在[28]，具體的連接鍵型（α-，β-）需要后續(xù)的核磁共振驗(yàn)證。從上述結(jié)果可以推斷PDMP 有可能為含有硫酸根的硫酸化多糖。由于多糖的天然特性，不同糖殘基產(chǎn)生的一些信號(hào)可能在指紋區(qū)域重疊，然而，大多數(shù)典型信號(hào)可以根據(jù)準(zhǔn)確的單糖組成分析和NMR 譜圖進(jìn)行分析比對(duì)。

圖3 PDMP 的FT-IR 光譜Fig.3 FT-IR spectrum of PDMP

2.1.6 PDMP 的NMR 光譜分析 通過1H 和13C NMR 光譜以進(jìn)一步研究糖基殘基的連接，PDMP的1H NMR 和13C NMR 圖，如圖4 和5 所示。

圖4 PDMP 的1H NMR 光譜圖Fig.4 1H NMR spectra of PDMP

1）PDMP 的1H NMR 光譜

在PDMP 的1H NMR 譜圖中，多糖中糖殘基的異頭質(zhì)子的構(gòu)型可以根據(jù)它們的化學(xué)位移（δ）從它們的1H-NMR 光譜中識(shí)別出來。一般來說，4.9～6.0 ppm 范圍內(nèi)的異頭質(zhì)子是α-構(gòu)型，而4.0～4.9 ppm 范圍內(nèi)的異頭質(zhì)子是β-構(gòu)型[29]。在1H NMR 譜圖中，PDMP 在δ 4.0～4.9 ppm 處的吸收峰，表明了異頭質(zhì)子的存在，δ H 大約在3.4～4.0 ppm 的值代表了多糖中的非異頭原子H2-H6。在δ 5.0～5.3 ppm 并未出現(xiàn)異頭質(zhì)子信號(hào)，說明PDMP 中不存在α-Galp A 殘基的異頭氫質(zhì)子信號(hào)[30]。在δ 1.8～2.3 ppm 的共振信號(hào)歸屬于乙?；–H3CO-）的甲基質(zhì)子信號(hào)，為GalNAc 中甲基的（CH3-）[31]，進(jìn)一步印證了FT-IR 和單糖組成的分析結(jié)果。

2）PDMP 的13C NMR 光譜 與1H-NMR 相比，13C-NMR 化學(xué)位移范圍寬廣，分辨率高，可以解析異頭碳的構(gòu)型，多糖殘基中取代位點(diǎn)和分支點(diǎn)[32]。13C NMR 譜中異頭碳的共振峰位于δ 95.0～110.0 ppm 范圍內(nèi)。在PDMP 的13C NMR 譜圖中，異頭碳 的化學(xué) 位移有100.35，102.10，103.19 ppm，表明存在α-糖苷鍵和β-糖苷鍵構(gòu)型[33]，另一方面，吡喃糖的C-3 和C-5 的化學(xué)位移一般小于80 ppm，而呋喃糖一般介于82～84 ppm 之間[34]。圖中可以看出，多個(gè)碳的信號(hào)峰，除了異頭碳的信號(hào)外，其它均小于80 ppm，因此判斷PDMP 為吡喃糖，這也與上文紅外光譜測(cè)定的結(jié)果相一致。δ C大約在60～90 ppm 的信號(hào)峰，代表了多糖中的非異頭原子C2-C6，13C-NMR 圖中δ 71.34 ppm 和δ 63.28 ppm 區(qū)域的峰分別對(duì)應(yīng)于C2-C5 和C-6 的峰信號(hào)[35]，60～70 ppm 之間有化學(xué)位移，表明C6 位置羥基一部分發(fā)生取代，C2-C5 信號(hào)的δ 值基本全部集中在70～77 ppm 之間，表明其絕大部分未被取代，還有一小部分被取代[36]，而圖5 中δ 75～85 ppm 沒有峰信號(hào)，因此，C2-C5 位置上的羥基沒有被取代。在δ 27.01 ppm，29.97 ppm 和δ 39.74 ppm 處的碳信號(hào)均在小于78 ppm，進(jìn)一步證實(shí)PDMP 的糖環(huán)為吡喃糖環(huán)[37]。δ 174.56 ppm的峰信號(hào)乙?；拇嬖赱38]，證實(shí)了FT-IR 的分析結(jié)果，表明PDMP 可能為一種硫酸化多糖。由1H NMR 和13C NMR 的核磁信息，PDMP 含有（1→）-和（1→6）-糖苷鍵的α-糖基和β-糖基。黨超[11]從泥鰍魚頭中提取的泥鰍多糖中同時(shí)存在α 型吡喃糖和β 型吡喃糖，這與本研究的PDMP 相似。

圖5 PDMP 的13C NMR 光譜圖Fig.5 13C NMR spectra of PDMP

2.2 PDMP 的理化性質(zhì)分析

2.2.1 PDMP 的熱穩(wěn)定性 圖6 為PDMP 熱降解質(zhì)量變化與變化速率曲線。TG 是樣品質(zhì)量隨溫度變化曲線，DTG 是TG 的一階微分曲線，表示樣品失重速率與溫度的關(guān)系，通過熱重分析可以了解樣品的熱穩(wěn)定性。

圖6 PDMP 的TG 曲線（a）和DTG 曲線（b）Fig.6 TG curve（a）and DTG curve（b）of PDMP

圖7 PDMP 的X-射線衍射圖Fig.7 X-ray diffraction pattern of PDMP

TG 結(jié)果顯示隨著溫度的變化PDMP 的質(zhì)量損失率，在200 ℃之前PDMP 并沒有因?yàn)樯郎囟霈F(xiàn)明顯的失重，質(zhì)量損失僅為7.38%，這部分的質(zhì)量損失主要是由于多糖物理吸附水的揮發(fā)[37]。當(dāng)溫度超過200 ℃時(shí)，PDMP 出現(xiàn)明顯的質(zhì)量損失，損失率達(dá)52.79%，由DTG 曲線可以看出，多糖在300 ℃之前降解速率很快，242.10 ℃時(shí)降解速率達(dá)到最快，300 ℃之后降解開始逐漸降低，在200 ℃到400 ℃范圍內(nèi)有較大的質(zhì)量損失，可能是分子質(zhì)量相對(duì)較大或穩(wěn)定性高的成分在這個(gè)階段溫度內(nèi)被降解[38]。400 ℃時(shí)開始趨于平緩，到達(dá)終末溫度600 ℃時(shí)，物質(zhì)并沒有完全分解，PDMP 質(zhì)量殘留率為31.25%，主要是殘余物成分慢慢碳化階段，還與質(zhì)量損失中的一些未分解物質(zhì)有關(guān)[39]。該結(jié)果表明，PDMP 的熱穩(wěn)定性較高，圖8 PDMP的掃描電鏡圖顯示比較規(guī)則的排列，分子間相互作用力較強(qiáng)，可能這種物理結(jié)構(gòu)使其更不易熱分解。

圖8 PDMP 的掃描電鏡圖Fig.8 SEM images of PDMP

2.2.2 PDMP 的結(jié)晶性 X 射線衍射是確定物相、晶體結(jié)構(gòu)和其它結(jié)構(gòu)參數(shù)的有用工具[40]。通過X 射線衍射分析PDMP 的結(jié)晶性能。

根據(jù)PDMP 的XRD 圖，可以看出，PDMP 的衍射角在30.60°，31.67°和44.54°有明顯尖峰，說明其含有粒度較大的微晶[41]；在21.79°時(shí)有彌散寬尖峰，說明其不僅存在微晶體系，還存在微晶與非晶共存、亞微晶與非晶共存的多晶體系[43]。這與蔣茂婷等[42]提取的蒜皮水溶性多糖的結(jié)晶性有相似之處。以上結(jié)果表明PDMP 的可塑性高，PDMP 是一種很有前途的功能性高分子碳水化合物。

2.2.3 PDMP 的表面形貌觀察 經(jīng)脫蛋白處理后的PDMP 的表面形貌通過SEM 在500 倍和2 000倍放大倍數(shù)下觀察。

如圖8 所示，樣品分別以100 μm 和20 μm標(biāo)尺拍攝圖片，PDMP 的表面形成大小均一密集的蜂窩狀孔洞，內(nèi)部有大小不一的孔洞結(jié)構(gòu)，說明PDMP 的成分相對(duì)均一，分子間相互作用力較強(qiáng)。

2.3 PDMP 的體外降糖活性評(píng)價(jià)

2.3.1 PDMP 的α-淀粉酶抑制活性 α-淀粉酶是一種碳水化合物降解酶，它最初作用于高分子質(zhì)量的糖類，并將它們分解成較小分子質(zhì)量的低聚糖，然后通過α-葡萄糖苷酶進(jìn)一步將低聚糖降解為單糖，隨后導(dǎo)致血液中的糖水平升高[17]。

如圖9 所示，在不同濃度下，PDMP 對(duì)α-淀粉酶都有抑制活性，在1～9 mg/mL 范圍內(nèi)，PDMP 對(duì)α-淀粉酶的抑制活性呈一定的劑量依賴關(guān)系，相同濃度下PDMP 的抑制效果要低于陽性對(duì)照組阿卡波糖。PDMP 和阿卡波糖的50%抑制濃度（IC50）分別為152 μg/mL 和476 μg/mL。當(dāng)質(zhì)量濃度為9 mg/mL 時(shí)，PDMP 和阿卡波糖的抑制率分別達(dá)到65.02%和88.70%。Lakshmanasenthil 等[43]發(fā)現(xiàn)喇叭藻（Turbinaria ornate）中褐藻糖膠硫酸基含量為（33.00±0.42）%，具有較強(qiáng)的α-淀粉酶抑制作用，IC50值為33.60 μg，低于阿卡波糖125 μg。本研究推測(cè)PDMP 中硫酸基的存在是其抑制其活性的原因之一，可進(jìn)一步深入研究其構(gòu)效關(guān)系。

圖9 PDMP 和阿卡波糖的α-淀粉酶抑制活性Fig.9 α-Amylase inhibitory activity of PDMP and acarbose

2.3.2 PDMP 的α-葡萄糖苷酶抑制活性 降低餐后高血糖的α-葡萄糖苷酶抑制劑可以調(diào)節(jié)血糖水平減緩糖尿病的進(jìn)展，是治療Ⅱ型糖尿病前期狀態(tài)的關(guān)鍵因素[18]。PDMP 體外對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性如圖10 所示。

圖10 PDMP 和阿卡波糖的α-葡萄糖苷酶抑制活性Fig.10 α-Glucosidase inhibitory activity of PDMP and acarbose

如圖所示，在不同濃度下PDMP 對(duì)α-葡萄糖苷酶有抑制活性，在1～9 mg/mL 范圍內(nèi)，PDMP 對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性呈一定的劑量依賴關(guān)系，相同濃度下PDMP 的抑制效果要高于陽性對(duì)照組阿卡波糖。PDMP 和阿卡波糖的50%抑制濃度（IC50）分別為550，136 μg/mL。當(dāng)質(zhì)量濃度為9 mg/mL 時(shí)PDMP 和阿卡波糖的抑制率分別達(dá)到86.40%，74.35%。PDMP 表現(xiàn)出顯著的對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性。Xiao 等[44]從馬尾藻制備的硫酸化馬尾藻多糖硫酸根含量為35.80%，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果顯著，在質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到98.40%，高于阿卡波糖。Zhong等[45]制備的硫酸化裙帶菜多糖硫酸根含量為38.79%，IC50值為50.50 μg/mL，比阿卡波糖更有效（IC50值為337.30 μg/mL）。以上結(jié)果說明含有硫酸基的天然PDMP 對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性較高，猜測(cè)可能與其本身含有大量硫酸根有一定關(guān)系，此外，含有較多的巖藻糖和半乳糖以及阿拉伯糖和木糖都具有顯著的α-葡萄糖苷酶活性，因此，PDMP 可能是緩解Ⅱ型糖尿病的一種潛在物質(zhì)，為后續(xù)深入研究其機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

從大鱗副泥鰍黏液中分離出一種熱穩(wěn)定較強(qiáng)，有一定結(jié)晶性的多糖-PDMP，其總糖含量為（95.51±2.27）%，富含硫酸基，不含糖醛酸，Mw 為362 928 u。PDMP 是由巖藻糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、木糖5 種單糖組成的巖藻半乳糖，其摩爾比為13.27∶5.68∶2.31∶2.23∶0.45。PDMP 含有（1→）-和（1→6）-糖苷鍵的α-糖基和β-糖基的吡喃糖。此外，PDMP 在體外對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果良好，展現(xiàn)出一定的降糖潛力。這些研究結(jié)果為PDMP 在醫(yī)藥領(lǐng)域和現(xiàn)代食品工業(yè)的應(yīng)用奠定了一定的理論基礎(chǔ)。