劉倩，李 正，歐佳琪，黃 文，2，王 益，劉 瑩，2*

（1 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 武漢430070 2 果蔬加工與品質(zhì)調(diào)控湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 武漢 430070）

羊肚菌（Morchella esculenta）作為一種珍貴的藥食兩用真菌，其性質(zhì)平和、味甘寒、沒有毒性[1]。羊肚菌中含有多糖、多酚等多種活性成分，具有防止氧化、抵御腫瘤生長(zhǎng)、緩解疲勞等作用[2]。目前對(duì)羊肚菌活性成分的研究中，羊肚菌多糖作為含量最為豐富的物質(zhì)被廣泛研究[3]，而對(duì)羊肚菌多酚的研究較少，且主要集中在羊肚菌子實(shí)體[4]或菌絲體[5]中多酚的提取工藝。

液體發(fā)酵技術(shù)就是在反應(yīng)器中模擬自然界的環(huán)境[6]，向其中加入供菌種生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，通過(guò)攪拌或振蕩等手段調(diào)節(jié)外部條件，使菌體在反應(yīng)器中生長(zhǎng)繁殖，獲得目標(biāo)物質(zhì)[7]。這種方法不僅可以提高菌絲體及其發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量，還可以保證產(chǎn)品品質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化[8]。優(yōu)化液體發(fā)酵的方法可以從培養(yǎng)基添加物質(zhì)、發(fā)酵條件等方面入手，使目標(biāo)產(chǎn)物含量提高[9]。目前有關(guān)于羊肚菌液體發(fā)酵的相關(guān)報(bào)道中，有通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件提高發(fā)酵液中多糖含量的研究，如Meng 等[10]通過(guò)優(yōu)化羊肚菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)基以及工藝參數(shù)，得到發(fā)酵液的胞外多糖含量為（2 913±265）mg/L。Li 等[11]以羊肚菌胞外多糖含量為指標(biāo)，利用豆腐渣發(fā)酵羊肚菌，最終得到多糖含量為（95.82±1.37）mg/g。此外，也有研究測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物中的多酚含量，如金紅等[12]測(cè)定金針菇等8 種食用菌發(fā)酵液中的總酚含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，總酚含量最高的是金針菇，可達(dá)5.07 mg/100 mL，然而目前未見通過(guò)優(yōu)化羊肚菌液體發(fā)酵條件提高發(fā)酵液中多酚含量的相關(guān)報(bào)道。

針對(duì)羊肚菌發(fā)酵液中多酚含量較低的問(wèn)題，本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽添加量，提高發(fā)酵產(chǎn)物中的多酚含量，并測(cè)定所得發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性，為羊肚菌發(fā)酵液中多酚的利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊肚菌株為M4M26 梯棱羊肚菌，保存于CYM 培養(yǎng)基上，來(lái)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用真菌研究所；土豆淀粉（食品級(jí)），河北古松農(nóng)副產(chǎn)品有限公司；大豆蛋白、乳清粉、蛋黃粉、食品級(jí)葡萄糖、蔗糖均為食品級(jí)，河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司；黃豆粉（食品級(jí)），曲靖市晨駿商貿(mào)有限公司；紫薯粉（食品級(jí)），廣州福正東海食品有限公司。

試劑：蛋白胨、酵母浸粉均為分析級(jí)，安琪酵母股份有限公司；福林酚（分析級(jí)），上海源葉生物科技有限公司；瓊脂（分析級(jí)），廣州賽國(guó)生物科技有限公司；沒食子酸（分析級(jí)），阿拉丁生化科技股份有限公司；MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、葡萄糖、無(wú)水碳酸鈉、甲醇均為分析級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1550 酶標(biāo)儀，Thermo scientific 公司；SW-CJ-2FDG 超凈工作臺(tái)，萊特（南通）有限公司；HZQF160 全溫振蕩搖床，蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LGJ-10 真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 羊肚菌種子液的制備及處理 CYM 培養(yǎng)基：蛋白胨2 g、酵母浸粉2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO40.6 g、K2HPO4·3H2O 1 g、葡萄糖22 g、瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 自然，121 ℃高溫、高壓滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨2 g、酵母浸粉2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO40.6 g、K2HPO4·3H2O 1 g、葡萄糖22 g，蒸餾水1 L，121 ℃高溫、高壓滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：食品級(jí)葡萄糖2 g，大豆蛋白1 g，KH2PO40.5 g，加蒸餾水至100 mL，在高壓滅菌鍋內(nèi)121 ℃，30 min 滅菌后備用。

將保存于試管中的M4M26 梯棱羊肚菌（以下簡(jiǎn)稱羊肚菌）接種至CYM 平板上，待菌絲體生長(zhǎng)5 d 后，取直徑1 cm 的菌塊24 個(gè)，接入種子培養(yǎng)基中，置于全溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，設(shè)置轉(zhuǎn)速為120 r/min，溫度25 ℃。搖瓶振蕩4 d 后取出，在超凈工作臺(tái)上將種子培養(yǎng)基和菌球進(jìn)行勻漿，制成羊肚菌種子液，按10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。

將發(fā)酵完成的羊肚菌發(fā)酵液勻漿后，在80 ℃水浴鍋中加熱30 min，使菌絲體中的活性物質(zhì)浸出后，離心、過(guò)濾得到澄清的羊肚菌發(fā)酵液，濃縮后凍干獲得粉末狀樣品，用于后續(xù)測(cè)定。

1.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1）碳源單因素實(shí)驗(yàn) 以土豆淀粉、紫薯粉、蔗糖代替1.3.1 節(jié)中發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖，其它添加物質(zhì)與1.3.1 節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基保持一致。試驗(yàn)條件：溫度25 ℃、搖床轉(zhuǎn)速120 r/min、發(fā)酵7 d，以多酚含量為指標(biāo)確定最佳碳源。對(duì)最佳碳源的添加量進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

2）氮源單因素實(shí)驗(yàn) 在發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上選用黃豆粉、乳清粉、蛋黃粉代替大豆蛋白作為氮源，其它成分保持不變。試驗(yàn)條件與1.3.2（1）節(jié)一致。之后對(duì)最佳氮源添加量進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

3）無(wú)機(jī)鹽單因素實(shí)驗(yàn) 趙航軻等[13]的研究表明，在選取的8 種無(wú)機(jī)鹽中，以KH2PO4為唯一無(wú)機(jī)鹽時(shí)得到的菌絲體最多。本試驗(yàn)直接選用KH2PO4作為無(wú)機(jī)鹽供給，對(duì)其添加量進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)條件與1.3.2（1）節(jié)一致，以多酚含量為指標(biāo)確定最優(yōu)添加量。

4）響應(yīng)面分析法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基 基于單因素實(shí)驗(yàn)篩選的各種添加物，用Design-Expert 12軟件，以發(fā)酵后的多酚含量作為優(yōu)化指標(biāo)進(jìn)行條件優(yōu)化。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.3 多酚含量的測(cè)定方法及表示 采用Folin-Ciocalteus 法測(cè)定多酚含量[14]，在10 mL 離心管中加入1 mL 待測(cè)樣品，5 mL 蒸餾水，3 mL 的7.5%碳酸鈉溶和1 mL 福林酚試劑，在室溫避光處反應(yīng)2 h，取200 μL 加入96 孔板中，用酶標(biāo)儀于765 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以沒食子酸（0，5，10，15，25，30 μg/mL）為對(duì)照品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

本節(jié)試驗(yàn)中待測(cè)樣品為羊肚菌菌絲體發(fā)酵液經(jīng)冷凍干燥后得到的固體粉末，用蒸餾水配制成0.50 mg/mL 的待測(cè)溶液。發(fā)酵液中多酚含量計(jì)算公式如下：

式中，X——發(fā)酵液中的多酚含量（mg/mL）；ρ——以樣品反應(yīng)體系吸光度及沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出（mg/mL）；c——待測(cè)樣品的溶液質(zhì)量濃度，0.50 mg/mL；m——發(fā)酵液凍干粉的質(zhì)量（mg）；V——發(fā)酵液體積（mL）。

1.3.4 抗氧化活性的測(cè)定方法

1）DPPH 自由基清除率的測(cè)定方法 參考Zeng 等[15]的方法并加以調(diào)整。用甲醇溶解DPPH配成0.2 mmol/L 的溶液（使用時(shí)配制），避光放置。以酶標(biāo)孔為反應(yīng)容器，取一定濃度的樣液100 μL于酶標(biāo)孔中，加等量的DPPH 溶液，充分混合，室溫下避光靜置反應(yīng)10 min，在517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值A(chǔ)i。用甲醇代替DPPH 溶液測(cè)得吸光值為Aj，用蒸餾水代替樣品測(cè)得吸光值為A0。清除率計(jì)算公式如下：

2）ABTS 自由基清除率測(cè)定方法

①ABTS 溶液的配制 配制7.0 mmol/L ABTS 溶液和140.0 mmol/L K2S2O8溶液，分別取5 mL 和88 μL 完全混勻，避光保存14 h。試驗(yàn)前用蒸餾水稀釋，734 nm 波長(zhǎng)處的吸光度在0.698～0.702 之間即可使用。

②試驗(yàn)方法 以酶標(biāo)孔為反應(yīng)容器，吸取一定濃度的樣液20 μL 于酶標(biāo)孔中，加入180 μL ABTS 自由基溶液，室溫避光反應(yīng)10 min，在734 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值A(chǔ)i。用蒸餾水代替ABTS 自由基溶液測(cè)得吸光度值A(chǔ)j，用蒸餾水代替樣品測(cè)得吸光度值A(chǔ)0。清除率計(jì)算公式同1.3.4節(jié)。

3）羥自由基清除率的測(cè)定方法 參考Nicholas 等[16]的方法并加以調(diào)整。以酶標(biāo)孔為反應(yīng)容器，吸取一定濃度的樣液50 μL 于酶標(biāo)孔中，依次加入FeSO4溶液（9.0 mmol/L）和水楊酸乙醇溶液（9.0 mmol/L）50 μL，完全混勻后加入50 μL H2O2（8.8 mmol/L）溶液，37 ℃反應(yīng)60 min。反應(yīng)結(jié)束后在510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值A(chǔ)i。用蒸餾水代替H2O2溶液測(cè)得吸光度值A(chǔ)j，用蒸餾水代替樣品測(cè)得吸光度值A(chǔ)0。清除率計(jì)算公式同1.3.4節(jié)。

4）FRAP 鐵離子還原能力的測(cè)定

①FRAP 工作液的配制 將0.3 mol/L 醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH=3.6），0.01 mol/L TPTZ 溶液和0.02 mol/L FeCl3溶液分別取10，1，1 mL，混合均勻，開始使用時(shí)配制。其中TPTZ 用0.04 mol/L 鹽酸溶解，兩者充分混合。

②制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 以酶標(biāo)孔為反應(yīng)容器，在其中加入10 μL 不同濃度的FeSO4溶液，再加入190 μL FRAP 工作液，在37 ℃反應(yīng)15 min。結(jié)束后在593 nm 波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值A(chǔ)i。用蒸餾水代替FRAP 工作液測(cè)得吸光度值A(chǔ)j，用蒸餾水代替樣品測(cè)得吸光度值A(chǔ)0。以Ai-A0-Aj值為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的FeSO4溶液濃度為橫坐標(biāo)作圖。

③測(cè)定FRAP 值 按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，將FeSO4溶液換成發(fā)酵液樣品，其余操作一致，得到Ai-A0-Aj值，將其帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，確定相應(yīng)的FeSO4濃度，即FRAP 值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 培養(yǎng)基碳源和氮源種類對(duì)多酚含量的影響

從圖1 可看出，不同碳源和氮源對(duì)發(fā)酵液中多酚含量的影響差異顯著，其中最佳碳源為土豆淀粉，最佳氮源為大豆蛋白。因此，選取這兩種物質(zhì)作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源和氮源。

圖1 不同碳源（a）、氮源（b）、無(wú)機(jī)鹽（c）種類對(duì)發(fā)酵液中多酚含量的影響Fig.1 Effects of different carbon（a），nitrogen（b）and inorganic salt（c）species on polyphenol content in fermentation broth

據(jù)王瑩[17]的研究結(jié)果，淀粉作為碳源時(shí)所得菌絲體生物量最少，僅為葡萄糖的2/3；劉華晶等[18]的研究也證明了這一點(diǎn)。而本試驗(yàn)以土豆淀粉為碳源時(shí)，得到的發(fā)酵液中多酚含量最高。推測(cè)是菌絲發(fā)酵過(guò)程中，如果菌絲體的生物量超過(guò)一定限度，就會(huì)開始利用多酚，從而使發(fā)酵產(chǎn)物中多酚含量減少[19]。

李文靜[20]對(duì)羊肚菌深層發(fā)酵培養(yǎng)基的研究表明，羊肚菌在無(wú)機(jī)氮源中的生物量不如在有機(jī)氮源中的生物量高。趙航軻等[13]研究表明將有機(jī)氮源黃豆粉添加至發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，得到的菌絲體生物量最多。而本試驗(yàn)中，用大豆蛋白作為氮源時(shí)，發(fā)酵液中多酚含量最高，分析大豆蛋白和黃豆粉的成分，大豆蛋白中蛋白質(zhì)含量可達(dá)90%以上，分解后有利于菌絲體合成蛋白質(zhì)和核酸[21-22]，可以供給菌絲體生長(zhǎng)足夠的營(yíng)養(yǎng)，有利于菌絲體發(fā)酵產(chǎn)物的生成。

2.1.2 各物質(zhì)添加量對(duì)多酚含量的影響 由圖2a可知，隨著土豆淀粉添加量的增加，發(fā)酵液中的多酚含量呈先增加后降低的趨勢(shì)，且土豆淀粉添加量為0.5%時(shí)，發(fā)酵液中多酚含量達(dá)到最大值。土豆淀粉添加量在0～0.25%時(shí)，發(fā)酵液中多酚含量增長(zhǎng)緩慢，而添加量0.25%～0.5%時(shí)迅速增加，說(shuō)明當(dāng)土豆淀粉添加量小于0.25%時(shí)，土豆淀粉作為碳源，不足以提供羊肚菌菌絲體生長(zhǎng)發(fā)育所需營(yíng)養(yǎng)，不利于發(fā)酵產(chǎn)物的積累。隨著土豆淀粉添加量的增大，羊肚菌菌絲體生長(zhǎng)發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸充足，使其發(fā)酵產(chǎn)物的多酚含量達(dá)到最大值。然而，當(dāng)土豆淀粉添加量繼續(xù)增大時(shí)，菌絲體的生長(zhǎng)發(fā)育迅速增長(zhǎng)，當(dāng)土豆淀粉供給的營(yíng)養(yǎng)不足以支撐菌絲體生長(zhǎng)發(fā)育所需時(shí)，便開始消耗發(fā)酵液中的多酚，使其含量大幅度下降。最終選擇土豆淀粉添加量為0.5%。

圖2 培養(yǎng)基各物質(zhì)添加量和發(fā)酵液中多酚含量的關(guān)系Fig.2 The relationship between the added amount of each substance in the medium and the content of polyphenols

由圖2b 可知，隨著大豆蛋白添加量的增加，發(fā)酵液中的多酚含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)大豆蛋白添加量為4%時(shí)，發(fā)酵液中多酚含量達(dá)到最大值。大豆蛋白添加量在1%～4%時(shí)，發(fā)酵液中多酚含量不斷增大，添加量4%～8%時(shí)逐漸降低，說(shuō)明其添加量小于4%時(shí)，隨著供給羊肚菌菌絲體生長(zhǎng)發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)的增加，其發(fā)酵產(chǎn)物多酚含量達(dá)到最大值。而在發(fā)酵培養(yǎng)基水溶液保持100 mL 不變時(shí)，大豆蛋白添加量越多，發(fā)酵培養(yǎng)基溶液的黏稠度越大，在同樣搖床轉(zhuǎn)速下，培養(yǎng)基的振蕩幅度相對(duì)減小，不利于氣體的流動(dòng)，溶解氧減少[23-24]，使菌絲體生長(zhǎng)緩慢，不利于發(fā)酵產(chǎn)物的生成，因此發(fā)酵液中多酚含量開始下降。最終選擇大豆蛋白添加量為4%。

由圖2c 可知，增大KH2PO4的添加量，發(fā)酵液中的多酚含量先增多后減少，當(dāng)KH2PO4添加量為0.25%時(shí)，多酚含量達(dá)到最大值。KH2PO4添加量在0～0.25% 時(shí)，多酚含量不斷增加，這是因?yàn)闊o(wú)機(jī)鹽在液體發(fā)酵過(guò)程中起到調(diào)節(jié)滲透壓和氧化-還原電位的作用，添加少量的無(wú)機(jī)鹽可促進(jìn)菌絲體和發(fā)酵產(chǎn)物的生成[25-26]。然而繼續(xù)增加無(wú)機(jī)鹽濃度，可能使培養(yǎng)基濃度過(guò)高，從而抑制菌絲體的生長(zhǎng)[18]。最終選擇KH2PO4的添加量為0.25%。

2.2 響應(yīng)面法分析優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基提高發(fā)酵液中多酚含量

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)是通過(guò)對(duì)上述單因素實(shí)驗(yàn)中的3 個(gè)因素：土豆淀粉添加量、大豆蛋白添加量和磷酸二氫鉀添加量，進(jìn)行排列組合得出，見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.1 模型建立和顯著性分析結(jié)果 使用軟件對(duì)表2 進(jìn)行擬合，結(jié)果見表3。回歸方程為：

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

多酚含量=1.04+0.0124A+0.0170B-0.1137C-0.0675AB +0.0034AC +0.0511BC -0.2185A2-0.2210B2-0.2388C2，回歸模型的方差分析見表3。

由表3 可看出，模型的P=0.0351〈0.05（顯著），失擬項(xiàng)檢驗(yàn)的P=0.9395（不顯著），R2=0.8448，其中R2用于反映回歸方程對(duì)響應(yīng)值的擬合效果[27]，意味著此次模擬可以解釋84.48%的情況，表明模型充分?jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)[28]。該方程是發(fā)酵液中多酚含量與培養(yǎng)基各物質(zhì)添加量適合的數(shù)學(xué)模型，可利用其確定提高發(fā)酵液中多酚含量的培養(yǎng)基物質(zhì)添加量。在試驗(yàn)范圍，不同因素對(duì)發(fā)酵液中多酚含量的影響排序?yàn)镃〉B〉A(chǔ)，即KH2PO4〉大豆蛋白〉土豆淀粉添加量。

2.2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析 響應(yīng)面的3D 圖形是響應(yīng)值對(duì)各因素所構(gòu)成的三維空間曲面圖，可看出各因素水平的最優(yōu)解及其之間的影響[29]。曲面越陡，表明該因素對(duì)響應(yīng)值的影響越大[30]。從圖3 可看出，KH2PO4添加量的響應(yīng)面坡面比較陡峭，說(shuō)明其對(duì)多酚含量影響較大，而土豆淀粉和大豆蛋白的響應(yīng)面坡面較平緩，說(shuō)明其對(duì)發(fā)酵液中多酚含量的影響不是很大，這與表3 的回歸分析結(jié)果一致。

圖3 兩因素交互作用對(duì)多酚含量的響應(yīng)面Fig.3 Response surface of two-factor interaction on polyphenol content

2.2.3 最佳工藝驗(yàn)證 通過(guò)軟件分析得到最優(yōu)結(jié)果為土豆淀粉0.5%、大豆蛋白4%、磷酸二氫鉀0.3%，在此條件下由公式計(jì)算出的多酚含量理論值為1.06 mg/mL。以最優(yōu)結(jié)果為基礎(chǔ)，進(jìn)行3 組驗(yàn)證試驗(yàn)，3 組發(fā)酵液中多酚平均含量為1.02 mg/mL，測(cè)定結(jié)果與理論值的相對(duì)誤差為3.3%，表明試驗(yàn)結(jié)果合理、可靠。

2.3 抗氧化活性分析

2.3.1 DPPH 自由基清除能力 由圖4 可看出，在1～5 mg/mL 范圍內(nèi)，發(fā)酵液對(duì)DPPH 自由基的清除效果與濃度變化一致，基本呈直線，表明發(fā)酵液對(duì)DPPH 自由基有很好的清除作用。根據(jù)擬合得到的線性方程計(jì)算發(fā)酵液的IC50=1.83 mg/mL，與李文靜[20]得到的羊肚菌發(fā)酵液DPPH 自由基清除率的IC50（約6 mg/mL）相比，本樣品的DPPH 自由基清除效果更好。

圖4 VC 和發(fā)酵液樣品對(duì)DPPH 自由基的清除作用Fig.4 The scavenging effect of VC and fermentation broth samples on DPPH

2.3.2 ABTS 自由基清除能力 由圖5 可以看出，隨著發(fā)酵液濃度的增大，對(duì)ABTS 自由基的清除效果變好，當(dāng)質(zhì)量濃度大于10 mg/mL 時(shí)，清除效果沒有明顯變化，維持在60%左右，達(dá)到清除極限。根據(jù)擬合曲線計(jì)算得到的IC50=4.81 mg/mL，相比于猴頭菌發(fā)酵液[31]的IC50=68 mg/mL，羊肚菌發(fā)酵液的ABTS 自由基清除率效果優(yōu)于此猴頭菌發(fā)酵液。

2.3.3 羥自由基清除能力 從圖6 可以看出，VC和發(fā)酵液質(zhì)量濃度與其對(duì)羥自由基清除能力的變化一致。計(jì)算VC 的IC50=0.1 mg/mL，而發(fā)酵液質(zhì)量濃度為3 mg/mL，對(duì)羥自由基的清除能力達(dá)80%左右，且不再有明顯升高，達(dá)到清除極限。計(jì)算其IC50=0.78 mg/mL，是維生素C 的70%左右，表明羊肚菌發(fā)酵液具有較強(qiáng)的羥自由基清除效果。

2.3.4 FRAP 鐵離子還原能力分析 由圖7 可以看出，隨著發(fā)酵液濃度的升高，對(duì)鐵離子的還原能力也升高，發(fā)酵液質(zhì)量濃度達(dá)15 mg/mL 時(shí)，F(xiàn)RAP值基本保持在0.8 左右，到達(dá)飽和。相比李文靜[20]的羊肚菌發(fā)酵液質(zhì)量濃度25 mg/mL 時(shí)的FRAP值0.75，本試驗(yàn)得到的發(fā)酵液效果更好。

圖7 VC 和發(fā)酵液樣品對(duì)鐵離子還原能力的測(cè)定Fig.7 The scavenging effect of VC and fermentation broth samples on FRAP

3 結(jié)論

本研究通過(guò)改變發(fā)酵培養(yǎng)基中的添加物質(zhì)及其添加量來(lái)調(diào)控羊肚菌發(fā)酵液中的多酚含量，是從發(fā)酵源頭進(jìn)行調(diào)控，便于工廠生產(chǎn)，且發(fā)酵原料來(lái)源廣泛、價(jià)格便宜，無(wú)毒性，得到的多酚更加安全。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面法分析得出培養(yǎng)基各物質(zhì)的最佳添加量，其中土豆淀粉0.5%、大豆蛋白4%、磷酸二氫鉀0.3%。對(duì)最佳條件下得到的羊肚菌發(fā)酵液進(jìn)行活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗氧化活性，符合多酚具有較好抗氧化活性的特征。其多酚結(jié)構(gòu)還有待進(jìn)一步研究。