安方玉, 顏春魯, 孫柏, 汪春梅, 柳穎, 王霞霞, 馬海珍, 張蕊, 陳振東
(甘肅中醫(yī)藥大學(xué),甘肅 蘭州 730000)
絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis, PMOP)是一種骨折發(fā)生率極高的常見(jiàn)骨病[1-2]。圍絕經(jīng)期的女性由于卵巢功能下降使雌激素分泌急劇下降,而雌激素分泌急劇下降導(dǎo)致骨吸收加速和骨形成減少可能是誘發(fā)PMOP發(fā)生的關(guān)鍵病機(jī)[3-4]。
研究表明,沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1, SIRT1)能夠參與機(jī)體的骨代謝、自噬、細(xì)胞凋亡和衰老等生物學(xué)過(guò)程[5-6]。另有研究表明SIRT1具有類(lèi)雌激素的作用,在多種骨系細(xì)胞(破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞等)中均有表達(dá)[7],抑制SIRT1表達(dá)可以促進(jìn)核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand, RANKL)誘導(dǎo)的骨髓巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophages,BMM)向破骨細(xì)胞分化[8],而破骨細(xì)胞祖細(xì)胞中的SIRT1還能夠通過(guò)抑制核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)活性來(lái)抑制其自身分化[9]。其他研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),SIRT1對(duì)破骨細(xì)胞生成的抑制是通過(guò)NF-κB通路和氧化應(yīng)激相互作用而介導(dǎo)的,這些途徑最終激活活化T細(xì)胞核因子胞漿1型(nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1,NFATc1)以誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成和破骨細(xì)胞融合。還有研究證明,NF-κB抑制劑顯著降低核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domainlike receptor protein 3, NLRP3)炎癥小體表達(dá)水平,緩解骨吸收[10]。上述研究提示SIRT1/NF-κB/NLRP3介導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化可能是治療PMOP潛在靶點(diǎn)。
藤黃健骨膠囊[Tenghuang-Jiangu capsule, TJC;熟地黃、鹿銜草、骨碎補(bǔ)(燙)、肉蓯蓉、淫羊藿、雞血藤和萊菔子]具有補(bǔ)腎活血之功效。臨床研究發(fā)現(xiàn),TJC通過(guò)提高PMOP患者的骨密度和抑制骨轉(zhuǎn)換來(lái)改善患者的中醫(yī)臨床癥狀積分,達(dá)到治療PMOP的目的,且臨床療效明顯[11-12]。也有研究報(bào)道,TJC可提高血鈣水平,還可降低血液黏稠度,抑制血小板聚集,從而提高骨密度,也可能通過(guò)降低破骨細(xì)胞的活性、功能抑制骨吸收、促進(jìn)成骨細(xì)胞形成來(lái)治療骨質(zhì)疏松癥、膝骨關(guān)節(jié)炎及腰椎間盤(pán)突出等疾?。?3-15]。上述文獻(xiàn)結(jié)果證明TJC對(duì)PMOP有明確療效?;诖耍覀兲岢鋈缦录僭O(shè):TJC可能通過(guò)抑制SIRT1/NF-κB/NLRP3信號(hào)通路來(lái)抑制PMOP的炎癥反應(yīng),進(jìn)而來(lái)抑制破骨細(xì)胞分化,從而發(fā)揮對(duì)PMOP的潛在療效。因此,本研究通過(guò)建立PMOP大鼠模型,旨在探討TJC對(duì)PMOP大鼠SIRT1/NF-κB/NLRP3信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響及可能的分子機(jī)制。
70只SPF級(jí)SD雌性大鼠,體質(zhì)量(180±20) g,購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào)為SCXK(甘)2020-0001。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有動(dòng)物均自由飲水、攝食。
戊酸雌二醇(estradiol valerate, ESV)片購(gòu)自拜耳醫(yī)藥保健有限公司;TJC購(gòu)自甘肅省西峰制藥有限公司;SIRT1抑制劑EX-527購(gòu)自MedChemExpress;SIRT1兔單克隆抗體購(gòu)自Abcam;NF-κB p65兔單克隆抗體購(gòu)自GeneTex;NLRP3兔單克隆抗體和GAPDH兔單克隆抗體購(gòu)自Immunoway;NFATc1兔單克隆抗體購(gòu)自Abclonal;ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒購(gòu)自YEASEN;白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β, IL-1β)ELISA試劑盒、IL-18 ELISA試劑盒和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α) ELISA試劑盒購(gòu)自FEIYA。
3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 選取60只SPF級(jí)SD雌性大鼠,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)、模型組[卵巢切除術(shù)(ovariectomy, OVX)組]、SIRT1抑制劑組(EX-527+OVX組)、陽(yáng)性藥物對(duì)照組(ESV+OVX組)、高劑量(0.36 g/kg)TJC(high-dose TJC, TJC-H)組、中劑量(0.18 g/kg)TJC(mediumdose TJC, TJC-M)組和低劑量(0.09 g/kg)TJC(lowdose TJC, TJC-L)組,每組10只。大鼠麻醉后,采取俯臥位,備皮后消毒手術(shù)區(qū)皮膚;沿背部后正中線(xiàn)作縱形切口長(zhǎng)約1.0~1.5 cm,在乳白色的脂肪團(tuán)中找到卵巢,結(jié)扎子宮角后摘除卵巢,然后傷口逐層縫合,同樣方式切除對(duì)側(cè)卵巢,而sham組大鼠只切卵巢附近白色脂肪組織,注意術(shù)后保溫[16]。造模8周后,ESV+OVX組給予ESV片(0.09 mg/kg)灌胃治療,TJC-H+OVX組、TJC-M+OVX組和TJC-L+OVX組給予TJC(0.36、0.18和0.09 g/kg)灌胃治療,sham組和OVX組給予等體積蒸餾水,EX-527+OVX組給予等體積蒸餾水并腹腔注射1 mg/kg EX-527[17],每日1次,連續(xù)8周[18]。給藥結(jié)束后進(jìn)行股動(dòng)脈取血,離心血清,處死大鼠,進(jìn)行標(biāo)本采集,部分股骨組織用4%多聚甲醛固定液固定,部分股骨組織于-80 ℃冰箱凍存、備用。
3.2 實(shí)驗(yàn)大鼠一般狀態(tài)及體重的觀察 觀察并記錄各組大鼠的飲水進(jìn)食、活動(dòng)情況、精神狀態(tài)、毛色變化等一般情況,定期稱(chēng)重并記錄大鼠體重。
3.3 ELISA法檢測(cè)血清中炎癥因子的含量 將采集的股動(dòng)脈血靜置2 h后再置于冰箱4 ℃過(guò)夜,1 500~2 000 r/min離心5 min,取上清測(cè)定血清IL-1β、IL-18和TNF-α水平變化。根據(jù)IL-1β、IL-18和TNF-α大鼠ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū),首先分別設(shè)置空白孔(不加樣品和酶標(biāo)記試劑)、標(biāo)準(zhǔn)孔(標(biāo)準(zhǔn)品50 μL)和樣品孔(樣品10 μL+樣品稀釋劑40 μL),37 ℃恒溫箱中恒溫孵育30 min并洗滌,然后每孔加入50 μL酶標(biāo)試劑,37 ℃恒溫箱中再次恒溫孵育30 min并洗滌并洗滌,每孔均加入顯色劑A(50 μL)和顯色劑B(50 μL),37 ℃恒溫箱內(nèi)避光孵育10 min后加入終止液(50 μL),450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度(A值)。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和A值算出IL-1β、IL-18和TNF-α的含量。
3.4 雙重免疫熒光觀察破骨細(xì)胞中SIRT1、NF-κB p65和NLRP3蛋白表達(dá) TRAP為破骨細(xì)胞特異性標(biāo)志物,故采用雙重免疫熒光雙染的方法分別檢測(cè)各組大鼠股骨組織中TRAP蛋白分別與SIRT1、NF-κB p65和NLRP3蛋白共表達(dá)的情況,來(lái)反映破骨細(xì)胞中SIRT1、NF-κB、NLRP3蛋白的表達(dá),具體操作方法如下:3%的H2O2避光10 min,PBS-Triton洗3次,每次3 min;100 mmol甘氨酸中和15 min,PBS-Triton洗3次,每次3 min;滴加封閉液,室溫封閉1 h;棄去封閉液后,在切片組織上同時(shí)滴加TRAP抗體(1∶100)和SIRT1(1∶100)/NF-κB p65(1∶500)/NLRP3(1∶200)抗體后4 ℃孵育過(guò)夜;用PBS-Triton洗3次,每次3 min,在切片組織上滴加Ⅱ抗,室溫避光孵育l h,再用PBS-Triton洗3次,每次3 min;然后用DAPI染核3 min,再用PBS-Triton洗3次,每次3 min;最后用抗熒光淬滅劑封片;熒光倒置掃描顯微鏡觀察并拍照,ImageJ分析數(shù)據(jù)。TRAP呈綠色,SIRT1/NF-κB p65/NLRP3呈紅色,DAPI細(xì)胞核呈藍(lán)色,雙染的共定位陽(yáng)性細(xì)胞經(jīng)疊加后呈黃色。
3.5 RT-qPCR檢測(cè)股骨組織中NF-κB p65、NLRP3和NFATc1的mRNA表達(dá) 往100 mg大鼠股骨組織中加入Trizol試劑以制備RNA,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,在7500型實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上使用實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒進(jìn)行RT-qPCR。PCR擴(kuò)增條件設(shè)置為:95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,循環(huán)40次。根據(jù)各組Ct值,通過(guò)2-ΔΔCt計(jì)算各組mRNA相對(duì)表達(dá)量,重復(fù)3次。引物序列見(jiàn)表1。
表1 引物序列Table 1. Sequences of the primers
3.6 Western blot檢測(cè)股骨組織中各組NF-κB p65、NLRP3和NFATc1的蛋白表達(dá) 往100 mg大鼠股骨組織加入蛋白裂解液提取其總蛋白,后用BCA法測(cè)濃度,繼之間上述蛋白樣品進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉及加入Ⅰ抗(NF-κB p65、NLRP3和NFATc1抗體)搖床上孵育過(guò)夜,孵育條件設(shè)置為4 ℃;次日TBST洗膜后加入Ⅱ抗孵育,孵育條件設(shè)置為37 ℃ 1 h;TBST洗膜后按1∶1的比例在PVDF膜上滴加顯影液,用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照。用ImageJ軟件進(jìn)行處理與分析。
用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。符合正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)選擇單因素方差分析;不符合正態(tài)檢驗(yàn)條件的數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
造模8周后(首次給藥前),sham組飲食飲水如常,活動(dòng)如常,反應(yīng)靈敏,毛色光亮;OVX、EX-527+OVX、ESV+OVX、TJC-H+OVX、TJC-M+OVX和TJCL+OVX組大鼠進(jìn)食飲水頻繁、活動(dòng)頻率降低、反應(yīng)欠靈敏(如抓取時(shí))、墊料更換后浸濕速度增快。造模16周后(TJC干預(yù)8周后即末次給藥后),sham組飲食飲水如常,活動(dòng)如常,反應(yīng)靈敏,毛色光亮;OVX、EX-527+OVX、ESV+OVX、TJC-H+OVX、TJC-M+OVX和TJC-L+OVX組大鼠活動(dòng)頻率明顯減少,其中OVX、EX-527+OVX和TJC-L+OVX組大鼠毛發(fā)欠光澤、部分大鼠頸部背側(cè)毛發(fā)出現(xiàn)脫落,ESV+OVX、TJC-H+OVX和TJC-M+OVX組大鼠反應(yīng)較好,毛發(fā)無(wú)明顯脫落,進(jìn)食量和飲水量飲水量稍有減少,尤以ESV+OVX組及TJC-H+OVX組大鼠上述一般狀況的改善程度最為明顯。
造模8周后(首次給藥前),與sham組相比,OVX、EX-527+OVX、ESV+OVX、TJC-H+OVX、TJCM+OVX和TJC-L+OVX組大鼠體重均顯著增加(P<0.05)。造模16周后(TJC干預(yù)8周后即末次給藥后),與sham組相比,OVX和EX-527+OVX組大鼠體重顯著增加(P<0.05);與OVX組相比,ESV+OVX和TJC-H+OVX組大鼠體重均顯著降低(P<0.05);與EX-527+OVX組相比,ESV+OVX、TJC-H+OVX和TJC-M+OVX組大鼠體重均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1。
Figure 1. Body weight changes of the rats in each group. Mean±SD. n=10. △P<0.05, △△P<0.01 vs sham group; *P<0.05, **P<0.01 vs OVX group; ▲P<0.05, ▲▲P<0.01 vs EX-527+OVX group.圖1 各組大鼠體重變化結(jié)果
與sham組相比,OVX和EX-527+OVX組大鼠血清IL-1β、IL-18和TNF-α含量顯著增加(P<0.01);與OVX組相比,ESV+OVX和TJC-H+OVX組大鼠血清IL-1β含量顯著降低,ESV+OVX、TJC-H+OVX和TJCM+OVX組大鼠血清IL-18含量顯著降低,ESV+OVX、TJC-H+OVX、TJC-M+OVX和TJC-L+OVX組大鼠血清TNF-α含量顯著降低(P<0.05);與EX-527+OVX組相比,ESV+OVX、TJC-H+OVX和TJC-M+OVX組大鼠血清IL-1β和IL-18含量顯著降低,ESV+OVX、TJC-H+OVX、TJC-M+OVX和TJC-L+OVX組大鼠血清TNF-α含量也顯著降低(P<0.05),見(jiàn)表2。
表2 各組大鼠血清炎癥因子含量變化比較Table 2. Comparison of serum content of inflammatory factors in each group (Mean±SD. n=10)
與sham組相比,OVX和EX-527+OVX組大鼠破骨細(xì)胞中SIRT1表達(dá)熒光面積顯著降低,而NF-κB p65和NLRP3表達(dá)熒光面積顯著升高(P<0.01);與OVX組相比,ESV+OVX、TJC-H+OVX、TJC-M+OVX和TJC-L+OVX組大鼠破骨細(xì)胞中SIRT1表達(dá)熒光面積顯著升高,而NF-κB p65和NLRP3表達(dá)熒光面積顯著降低(P<0.01);與EX-527+OVX組相比,ESV+OVX、TJC-H+OVX、TJC-M+OVX和TJC-L+OVX組大鼠破骨細(xì)胞中SIRT1表達(dá)熒光面積顯著升高,而NF-κB p65和NLRP3表達(dá)熒光面積顯著降低(P<0.01),見(jiàn)圖2。
Figure 2. Immunofluorescence intensity changes of SIRT1, NF-κB p65 and NLRP3 in the osteoclast of each group. The scale bar=50 μm. Mean±SD. n=3. △△P<0.01 vs sham group; **P<0.01 vs OVX group; ▲▲P<0.01 vs EX-527+OVX group.圖2 各組大鼠破骨細(xì)胞中SIRT1、NF-κB p65和NLRP3免疫熒光強(qiáng)度變化
與sham組相比,OVX和EX-527+OVX組股骨組織中NF-κB p65、NLRP3和NFATc1的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01);與OVX組相比,ESV+OVX、TJC-H+OVX、TJC-M+OVX和TJC-L+OVX組NF-κB p65、NLRP3和NFATc1的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.01);與EX-527組相比,ESV+OVX、TJC-H+OVX、TJC-M+OVX和TJC-L+OVX組NF-κB p65、NLRP3和NFATc1的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.01),見(jiàn)圖3。
Figure 3. The mRNA expression of NF-κB p65, NLRP3 and NFATc1 in the femoral tissue of each group. Mean±SD. n=3. △△P<0.01 vs sham group; **P<0.01 vs OVX group; ▲▲P<0.01 vs EX-527+OVX group.圖3 各組大鼠股骨組織中NF-κB p65、NLRP3和NFATc1 mRNA表達(dá)變化結(jié)果
與sham組相比,OVX組和EX-527+OVX組股骨組織中NF-κB p65、NLRP3和NFATc1蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01);與OVX組相比,ESV+OVX組和TJCH+OVX組NLRP3蛋白表達(dá)明顯降低,ESV+OVX組和TJC-H+OVX、TJC-M+OVX組NF-κB p65和NFATc1蛋白表達(dá)也均明顯降低(P<0.05);與EX-527+OVX組相比,ESV+OVX組和TJC-H+OVX NLRP3蛋白表達(dá)明顯降低,ESV+OVX組和TJC-H+OVX、TJC-M+OVX組NF-κB p65和NFATc1蛋白表達(dá)也均明顯降低(P<0.05),見(jiàn)圖4。
Figure 4. The protein expression of NF-κB p65, NLRP3 and NFATc1 in the femoral tissue of each group. Mean±SD. n=3. △△P<0.01 vs sham group; *P<0.05, **P<0.01 vs OVX group; ▲P<0.05, ▲▲P<0.01 vs EX-527+OVX group.圖4 各組大鼠股骨組織中NF-κB p65、NLRP3和NFATc1蛋白表達(dá)變化結(jié)果
依據(jù)PMOP的主要病機(jī)“破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收大于成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成”,目前臨床上治療PMOP的常用藥物為骨吸收抑制劑和骨形成促進(jìn)劑。骨吸收抑制劑包括雌激素、雙膦酸鹽和地諾單抗等;骨形成促進(jìn)劑有鈣劑、特立帕肽和阿巴帕肽等。這些西藥治療雖然能明顯緩解患者的疼痛,減輕臨床癥狀,但是存在一系列副作用。如雌激素長(zhǎng)期服用會(huì)增加患者冠狀動(dòng)脈疾病、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌和中風(fēng)等疾病的發(fā)病率[19-22]。雙磷酸鹽長(zhǎng)期服用患者會(huì)出現(xiàn)髖骨骨折、下頜骨壞死、胃腸道反應(yīng)、低鈣血癥等副作用[23-25]。此外,大劑量的攝入鈣可能導(dǎo)致便秘和腸脹氣,也可增加心肌梗死和腎結(jié)石的患病風(fēng)險(xiǎn)[26];特立帕肽則是患者在停藥后療效會(huì)迅速喪失[27-28]。因此,尋找新的治療策略成為PMOP亟待解決的問(wèn)題。據(jù)報(bào)道,某些補(bǔ)腎中藥復(fù)方可以通過(guò)抑制破骨細(xì)胞分化來(lái)防止PMOP引起的骨代謝紊亂[29]。TJC作為補(bǔ)腎壯骨的代表方藥,因在PMOP治療中的潛在作用而備受關(guān)注。
已有大量研究表明,炎癥反應(yīng)是促進(jìn)破骨細(xì)胞生成參與骨質(zhì)疏松癥的重要途徑[30-31]。PMOP患者由于雌激素缺乏會(huì)出現(xiàn)促炎細(xì)胞因子如IL-1、TNF-α和IL-6等分泌增多現(xiàn)象,使破骨細(xì)胞增殖和活性增強(qiáng),進(jìn)而打破了骨形成與骨吸收之間的動(dòng)態(tài)平衡[32]。有研究已證明IL-1和TNF-α受體缺失型小鼠進(jìn)行OVX,術(shù)后這類(lèi)小鼠不會(huì)出現(xiàn)骨丟失現(xiàn)象[33],說(shuō)明這些炎癥因子和骨吸收密切相關(guān)。此外大量研究證明[34-36],TNF、M-CSF、NFATc 1等因子可以調(diào)控破骨細(xì)胞的來(lái)源和分化,其中NFATc 1被認(rèn)為是破骨分化的特異性調(diào)節(jié)器[37]。本研究發(fā)現(xiàn)OVX組大鼠血清中IL-1β、IL-18和TNF-α的分泌明顯增多,股骨組織中NFATc1的mRNA和蛋白表達(dá)顯著,說(shuō)明在PMOP中炎癥反應(yīng)促進(jìn)了破骨細(xì)胞分化,這與上述研究結(jié)果相似。而TJC干預(yù)后IL-1β、IL-18和TNF-α的分泌顯著降低,股骨組織中NFATc1的mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低,證明TJC通過(guò)抑制炎癥因子的分泌正反饋抑制PMOP破骨細(xì)胞NFATc1的表達(dá),最終達(dá)到抑制PMOP破骨細(xì)胞分化的目的。但是TJC通過(guò)抑制炎癥因子的分泌正反饋抑制PMOP破骨細(xì)胞NFATc1的表達(dá)是通過(guò)什么樣的網(wǎng)絡(luò)信號(hào)來(lái)調(diào)控的,目前尚未具體闡明。
Gurt等[38]發(fā)現(xiàn),SIRT1激活劑SRT2183能抑制破骨細(xì)胞分化成熟和功能,抑制了骨吸收過(guò)程。另有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),橙皮苷升高SIRT1的表達(dá)可顯著降低炎癥介質(zhì)NF-κB以及TNF-α、IL-1β和IL-6細(xì)胞因子水平,明顯改善了骨丟失[39]。提示SIRT1可能是調(diào)控破骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。NF-κB信號(hào)通路是經(jīng)典炎癥信號(hào)通路,通過(guò)調(diào)控破骨細(xì)胞參與骨質(zhì)疏松癥的重要發(fā)生過(guò)程[40]。研究發(fā)現(xiàn),SIRT1可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路阻止BMM向破骨細(xì)胞分化,從而抑制骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[9]。而NLRP3炎癥小體激活的起始步驟也主要依賴(lài)于NF-κB通路,NF-κB抑制劑顯著降低NLRP3炎癥小體表達(dá)水平,緩解骨吸收[8]。NF-κB/NLRP3信號(hào)通路的激活刺激促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[41],因此,NF-κB、NLRP3炎癥小體作為炎癥的上游信號(hào),可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[42]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在OVX組大鼠股骨組織中NF-κB p65、NLRP3和NFATc1的mRNA和蛋白表達(dá)顯著上升,而TJC干預(yù)后NF-κB p65、NLRP3和NFATc1的mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低;說(shuō)明在OVX大鼠中激活NF-κB/NLRP3信號(hào)通路促進(jìn)了NFATc1的生成,加速了破骨細(xì)胞的分化,而TJC逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)也觀察到OVX組大鼠破骨細(xì)胞中SIRT1熒光表達(dá)面積顯著降低,而NF-κB p65和NLRP3的熒光表達(dá)面積顯著升高;TJC干預(yù)后破骨細(xì)胞中SIRT1熒光表達(dá)面積顯著上升,而NF-κB p65和NLRP3的熒光表達(dá)面積顯著降低。這表明OVX大鼠可通過(guò)SIRT1/NF-κB/NLRP3信號(hào)通路介導(dǎo)炎癥反應(yīng)促進(jìn)IL-1β、IL-18和TNF-α等炎癥因子的釋放,進(jìn)一步促進(jìn)破骨分化標(biāo)志分子NFATc1的表達(dá),從而促進(jìn)OVX大鼠破骨細(xì)胞的分化。
綜上所述,TJC通過(guò)調(diào)控SIRT1/NF-κB/NLRP3信號(hào)通路炎癥因子的分泌來(lái)正反饋抑制破骨細(xì)胞分化標(biāo)志分子NFATc1的表達(dá),抑制PMOP破骨細(xì)胞的分化,從而糾正其骨代謝紊亂,為T(mén)JC防治PMOP的作用機(jī)制研究提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。但目前研究仍然存在一些不足,本研究?jī)H通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)層面闡明了TJC抑制破骨細(xì)胞分化可能與SIRT1/NF-κB/NLRP3信號(hào)通路抑制有關(guān),但在本研究中未使用SIRT1/NF-κB/NLRP3信號(hào)通路的相關(guān)抑制劑如SIRT1抑制劑,也未使用基因干擾技術(shù)并結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)對(duì)TJC抑制破骨細(xì)胞分化的作用機(jī)制進(jìn)行深入探討。