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        飲食誘導(dǎo)的小鼠非酒精性脂肪性肝病進(jìn)展中糖代謝酶的變化*

        2023-12-04 02:10:14李超波楊麗媛王春梅宋井一郝艷艷曹立瀛馬向明
        中國病理生理雜志 2023年11期
        關(guān)鍵詞:進(jìn)展小鼠水平

        李超波, 楊麗媛, 王春梅, 宋井一, 郝艷艷, 曹立瀛, 馬向明

        (華北理工大學(xué)附屬開灤總醫(yī)院 肝膽外科,河北 唐山 063000)

        非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是目前最常見的慢性肝病,影響了全球約30%的人口[1]。約20%~30%的NAFLD患者會(huì)從早期的非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver, NAFL)進(jìn)展為非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH),并最終可能發(fā)展為不可逆的肝硬化和肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)[2]。NAFLD的發(fā)病機(jī)制最初被描述為“雙重打擊”學(xué)說,最近的研究結(jié)果描述了一種“多重打擊”學(xué)說,其中多個(gè)平行的致病事件協(xié)同作用[3],糖代謝重編程導(dǎo)致的脂質(zhì)沉積、纖維化和肝星狀細(xì)胞的激活可以作為平行事件來推動(dòng)NAFLD的進(jìn)展[4-5]。流行病學(xué)研究表明,代謝相關(guān)疾病也是NAFLD患者發(fā)生HCC的高危因素[6],因此高脂飲食(high-fat diet, HFD)誘導(dǎo)的肝臟脂代謝紊亂與糖代謝重編程可能是促進(jìn)NAFLD發(fā)生的因素之一。目前,對(duì)NAFL向NASH進(jìn)展的糖代謝變化的了解并不完整,我們構(gòu)建了一個(gè)NAFLD模型,探討糖代謝途徑在NAFL向NASH進(jìn)展過程中的變化及意義。

        材料和方法

        1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

        48只3周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠購買于北京華阜康生物科技股份有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證編號(hào):110322220101862816,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2019-0008],飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)附屬開灤總醫(yī)院肝膽病研究所動(dòng)物飼養(yǎng)室,環(huán)境溫度控制在(23±2) ℃,濕度控制在40%~60%,自由進(jìn)食進(jìn)水。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都是在華北理工大學(xué)附屬開灤總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)下進(jìn)行的。

        2 主要試劑

        總膽固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所);葡萄糖檢測(cè)試劑盒(上海榮盛生物技術(shù)有限公司);改良油紅O染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);BCA蛋白定量試劑盒和超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(河北瑞帕特生物科技有限公司);RIPA裂解液(強(qiáng))購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Immobilon?-P PVDF膜(Millipore);丙酮酸激酶M1(pyruvate kinase M1, PKM1)和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體(Cell Signaling Technology);丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase, PC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(phosphoenolpyruvate carboxykinase 1, PCK1)和葡萄糖-6-磷酸酶催化亞基(glucose-6-phosphatase catalytic subunit, G6PC)抗體(ABclonal);磷酸果糖激酶B(phosphofructokinase B, PFKB)、乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A, LDHA)、果糖-1,6-二磷酸酶1(fructose-1,6-bisphosphatase 1, FBP1)、PKM2、己糖激酶1(hexokinase 1, HK1)和HK2抗體(杭州華安生物技術(shù)有限公司)。

        3 主要儀器

        HistoStar石蠟包埋機(jī)和Gemini AS全自動(dòng)染色機(jī)(Thermo Fisher);Sunrise酶標(biāo)儀(Tecan);低溫離心機(jī)(無錫德凡儀器有限公司);HistoCore PEARL組織脫水機(jī)、HistoCore BIOCUT旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)、CM1950型冰凍切片機(jī)(Leica);全自動(dòng)凝膠成像儀(上海嘉鵬科技有限公司);Axio Scope.A1光學(xué)顯微鏡(Carl Zeiss)。

        4 分組、造模及取材

        所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為對(duì)照飲食(control diet, CD)組(n=24)和HFD組(n=24)。CD組給予10%脂肪供能的普通對(duì)照飼料(XTCON50J:10%脂肪、70%碳水化合物和20%蛋白質(zhì);江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司),HFD組給予60%脂肪供能的膽堿缺乏飼料(XTCD60:60%脂肪、20%碳水化合物和20%蛋白質(zhì);江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司)。兩組均在給予相應(yīng)飼料喂養(yǎng)后8、12、16和20周分4批次處死小鼠,每次6只,處死前禁食12 h,予七氟烷吸入麻醉后摘除眼球取血,室溫靜置3 h后4 ℃、3 000 r/min離心10 min,取上清,分裝后-80 ℃凍存?zhèn)溆?。頸椎脫臼法處死小鼠,取出肝臟后稱重,取部分肝臟組織制備石蠟塊以及冰凍切片。剩余組織分裝后-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

        5 主要方法

        5.1 肝組織HE染色 小鼠肝臟在4%中性甲醛溶液中固定24 h以上,進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋,包埋后的石蠟塊切成4 um的厚度,烤片30 min,使用全自動(dòng)染色機(jī)進(jìn)行HE染色,用光學(xué)顯微鏡閱片并進(jìn)行NAFLD活動(dòng)度評(píng)分(NAFLD activity score,NAS),NAS≥5時(shí)可診斷為NASH[7]。

        5.2 肝組織油紅O染色 新鮮肝組織在冰凍切片機(jī)中切成8 um的厚度,根據(jù)油紅O染色試劑盒說明書進(jìn)行油紅O染色,染色完成后光學(xué)顯微鏡觀察及拍攝。

        5.3 小鼠血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 取適量血清根據(jù)試劑盒說明書檢測(cè)TC、TG、ALT、AST和葡萄糖水平。

        5.4 Western blot檢測(cè) 取約40 mg肝組織,加入10倍體積RIPA裂解液及1% PMSF,使用玻璃勻漿器冰上勻漿;冰上靜置30 min后4 ℃、12 000 r/min離心10 min;取上清,BCA法測(cè)定蛋白濃度;加入5× loading buffer和RIPA裂解液進(jìn)行濃度均一化,使用SDSPAGE分離蛋白;電轉(zhuǎn)至PVDF膜上,用TBST稀釋的5%脫脂牛奶室溫封閉1 h;將PVDF膜和封閉液稀釋的Ⅰ抗在4 ℃下孵育過夜;次日,TBST洗膜后使用封閉液稀釋的Ⅱ抗室溫孵育1 h;TBST洗膜后ECL發(fā)光液進(jìn)行免疫印跡可視化并拍攝;使用Photoshop 2021軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行組圖并使用ImageJ軟件對(duì)蛋白灰度值進(jìn)行測(cè)量。

        6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        使用GraphPad Prism 9.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖。對(duì)計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        結(jié)果

        1 HFD喂養(yǎng)的小鼠16周時(shí)出現(xiàn)明顯的肝臟脂質(zhì)蓄積

        HFD組小鼠在喂食HFD后第4周體重開始明顯增加,到第16周顯著高于CD組(P<0.01),見圖1A。HFD組小鼠肝重到16周顯著高于CD組(P<0.01),見圖1B。HFD組肝臟指數(shù)(肝重/體重)在16周后大于CD組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖1C。相比CD組,HFD組喂食16周時(shí)可見肝臟變大且顏色變淺,見圖1D。HE染色顯示,16周CD組肝細(xì)胞排列整齊,結(jié)構(gòu)清晰,胞內(nèi)無脂肪空泡出現(xiàn),而16周HFD組存在分布廣泛的大小不等的脂肪空泡;油紅O染色顯示,16周HFD組中存在大量橘紅色脂滴,見圖1E。這些數(shù)據(jù)表明,HFD喂養(yǎng)的小鼠到16周時(shí)表現(xiàn)出明顯的肝臟脂質(zhì)蓄積。

        Figure 1. Mouse body weight (A), liver weight (B), liver index (C), liver gross appearance at 16 weeks (D), and HE and oil red O staining of liver tissues at 16 weeks (E, ×200). CD: control diet; HFD: high-fat diet. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs CD group.圖1 小鼠體重、肝重、肝臟指數(shù)、16周肝臟外觀及16周肝組織HE和油紅O染色圖

        2 HFD組小鼠在16周時(shí)出現(xiàn)外周血糖脂代謝紊亂并大部分進(jìn)展為NASH

        HFD組小鼠血清TC水平在16周后顯著高于CD組(P<0.05),而血清ALT和血糖水平在12周以后較CD組顯著升高(P<0.05),見圖2A~C。另外在所有實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)兩組血清TG和AST水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖2D、E。小鼠肝臟在第8周時(shí)出現(xiàn)大-微泡性脂肪變性,并在隨后的實(shí)驗(yàn)期間進(jìn)展到更嚴(yán)重的地步(圖2G),這些結(jié)果與之前的研究類似[8]。根據(jù)NAS評(píng)估小鼠肝脂肪變性、小葉炎癥和氣球樣變[7],結(jié)果顯示HFD組小鼠在16周時(shí)大部分表現(xiàn)為NASH(圖2F),與肝重(圖1B)增長(zhǎng)時(shí)間一致,HFD組各階段的油紅O染色(圖2G)與此表現(xiàn)一致。這些數(shù)據(jù)表明,高脂喂養(yǎng)的小鼠外周血主要在16周后發(fā)生糖脂紊亂,而肝組織脂肪病變?cè)?周甚至更早期就已經(jīng)開始,在16周時(shí)大部分進(jìn)展為NASH。

        Figure 2. Serum levels of total cholesterol (TC; A), alanine aminotransferase (ALT; B), glucose (C), triglyceride (TG; D) and aspartate aminotransferase (AST; E), hepatic NAFLD activity score (NAS; F), and representative images of HE and oil red O staining (G, ×200) in mice at different time points. CD: control diet; HFD: high-fat diet. Mean±SD. n=6. *P<0.05,**P<0.01 vs CD group.圖2 小鼠各階段血清TC、ALT、葡萄糖、TG、AST水平及肝臟NAS、HFD組HE染色和油紅O染色圖片

        3 小鼠糖酵解酶表達(dá)水平

        上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示HFD組小鼠在16周時(shí)出現(xiàn)明顯的NASH改變并伴隨外周血糖脂紊亂,通過Western blot檢測(cè)16周CD組和HFD組小鼠肝糖酵解酶的蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),與16周CD組相比,HFD組小鼠肝糖酵解關(guān)鍵酶HK1、HK2、PKM2和LDHA蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05或P<0.01),PFKB和PKM1蛋白表達(dá)基本不變(P>0.05),見圖3A。HK2和PKM2亞型的表達(dá)與有氧糖酵解密切相關(guān)[9],為了進(jìn)一步明確糖酵解酶的表達(dá)趨勢(shì),對(duì)第8、12、16和20周HFD組小鼠肝糖酵解酶表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)HK2、PKM2和LDHA蛋白表達(dá)水平都隨著NAFLNASH進(jìn)展而升高(P<0.01),見圖3B。這些結(jié)果提示,HFD誘導(dǎo)的小鼠肝內(nèi)有氧糖酵解增加且與NAFL向NASH進(jìn)展有關(guān)。

        Figure 3. Protein expression levels of glycolytic enzymes, hexokinase 1 (HK1), HK2, phosphofructokinase B (PFKB), pyruvate kinase M1 (PKM1), PKM2 and lactate dehydrogenase A (LDHA), in mouse liver tissues. CD: control diet; HFD: high-fat diet. Mean±SD. n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs CD group; ##P<0.01 vs 8 weeks.圖3 小鼠肝組織糖酵解酶蛋白表達(dá)水平

        4 小鼠糖異生關(guān)鍵酶表達(dá)水平

        與糖酵解關(guān)鍵酶表達(dá)水平的升高相反,與16周CD組相比,HFD組小鼠肝糖異生關(guān)鍵酶G6PC、FBP1和PCK1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01),PC蛋白表達(dá)水平基本不變(P>0.05),見圖4A。同樣,對(duì)第8、12、16和20周HFD組小鼠肝糖異生關(guān)鍵酶表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),在NAFL向NASH的進(jìn)展中,PCK1蛋白表達(dá)水平逐漸降低(P<0.01),PC蛋白表達(dá)水平逐漸升高(P<0.05),F(xiàn)BP1蛋白表達(dá)水平未出現(xiàn)顯著改變(P>0.05),與LDHA類似,G6PC蛋白表達(dá)水平主要從第12周就顯著升高(P<0.05),見圖4B。這些結(jié)果提示,HFD誘導(dǎo)的小鼠肝內(nèi)糖異生酶表達(dá)水平降低且與NAFL向NASH進(jìn)展有關(guān)。

        Figure 4. Protein expression levels of key gluconeogenic enzymes, glucose-6-phosphatase catalytic subunit (G6PC), fructose-1,6-bisphosphatase 1 (FBP1), phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 (PCK1) and pyruvate carboxylase (PC), in mouse liver tissues. CD: control diet; HFD: high-fat diet. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs CD group; #P<0.05, ##P<0.01 vs 8 weeks.圖4 小鼠肝組織糖異生關(guān)鍵酶蛋白表達(dá)水平

        5 NAFLD小鼠肝組織糖代謝酶蛋白表達(dá)水平與NAS的相關(guān)性

        小鼠肝組織糖代謝酶PKM2、LDHA、G6PC、PCK1和PC在NAFL向NASH進(jìn)展中的表達(dá)水平與NAS存在顯著相關(guān)性(P<0.05或P<0.01),而HK2與NAS的相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),其中PKM2、PCK1和PC與NAS存在強(qiáng)的正相關(guān)或負(fù)相關(guān),見表1。

        表1 NAS與糖代謝酶蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性Table 1. Correlations between NAFLD activity score (NAS) and the protein levels of glucose metabolism enzymes

        討論

        NAFLD通常合并有代謝綜合征,如2型糖尿病、全身性高血壓、血脂異常和胰島素抵抗等,而代謝重編程在NAFLD中導(dǎo)致了脂質(zhì)在肝臟內(nèi)的異常積累、炎癥反應(yīng)的增加以及肝細(xì)胞受損[10]。本研究中HFD組小鼠飲水中并未添加果糖/葡萄糖,HFD組數(shù)據(jù)可準(zhǔn)確反映HFD對(duì)糖代謝的影響。同時(shí),HFD中缺乏膽堿,這會(huì)導(dǎo)致極低密度脂蛋白生成障礙,從而加快肝臟中甘油三酯蓄積,但外周血中甘油三酯并不會(huì)明顯增加,這與我們的研究一致。本研究發(fā)現(xiàn),12周后在HFD組小鼠中觀察到外周血糖脂代謝紊亂,在16周時(shí)肝臟變大且顏色變淺,NAS提示肝臟在16周時(shí)大部分進(jìn)展為NASH,而肝臟脂肪變性>50%時(shí)才會(huì)表現(xiàn)出明顯的肝臟肥大[11],表明隨著NAFL向NASH的進(jìn)展,除了肝臟脂質(zhì)蓄積明顯增加外,也會(huì)導(dǎo)致外周血糖脂紊亂。

        為了進(jìn)一步明確HFD是否會(huì)導(dǎo)致肝臟出現(xiàn)糖代謝重編程,我們檢測(cè)了小鼠肝臟糖酵解和糖異生相關(guān)酶的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),HFD組小鼠肝臟HK1、HK2、PKM2和LDHA蛋白表達(dá)在16周時(shí)明顯升高,對(duì)隨飲食時(shí)間梯度的HFD組小鼠肝臟糖酵解酶蛋白表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),HK2、PKM2和LDHA與NAFL向NASH的進(jìn)展趨勢(shì)相同,而后兩者與NAFLD進(jìn)展存在顯著相關(guān)性,特別是PKM2,提示HFD會(huì)持續(xù)誘導(dǎo)肝臟的有氧糖酵解。研究表明,有氧糖酵解的多種底物可以促進(jìn)脂肪從頭生成[12],抑制脂肪從頭合成也會(huì)導(dǎo)致糖酵解和血糖的降低[13-14]。此外,PKM2的增加與肝巨噬細(xì)胞和特異性Kupffer細(xì)胞的M1極化密切相關(guān)[15]。M1型巨噬細(xì)胞釋放的腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素6(interleukin-6, IL-6)和IL-1β會(huì)刺激肝星狀細(xì)胞活化,促進(jìn)脂肪分解,與HCC發(fā)病有關(guān)[16-17]。PKM2的共價(jià)抑制會(huì)促進(jìn)巨噬細(xì)胞從M1型向M2型極化的轉(zhuǎn)變,對(duì)抗NAFLD的發(fā)展[17]。NAFLD患者Rouxen-Y胃繞道手術(shù)后肝脂肪含量和炎癥的減少也與肝臟和血清中PKM2的減少有關(guān)[18]。而HK2和乳酸表達(dá)增加導(dǎo)致的組蛋白乳酸化是肝星狀細(xì)胞激活的關(guān)鍵[19]。這些研究表明,HK2、PKM2和乳酸是肝臟脂肪生成、炎癥、纖維化及HCC進(jìn)展的重要共同因素。因此,在不去除外源性脂肪攝入的情況下,肝臟脂質(zhì)攝入和有氧糖酵解可能互相加重,共同導(dǎo)致NAFL向NASH甚至HCC進(jìn)展。

        在肝臟的糖異生代謝方面,我們發(fā)現(xiàn),HFD組小鼠肝臟糖異生關(guān)鍵酶G6PC、FBP1和PCK1蛋白在16周時(shí)表達(dá)水平均下降,表明在NASH的早期階段空腹時(shí)抑制了糖異生酶的表達(dá),但HFD組小鼠空腹血糖并沒有明顯降低,提示糖異生通量是增加的。隔夜禁食后空腹血糖的來源主要為肝糖異生[20],糖異生通量是胰島素、升糖激素和糖異生底物共同作用的結(jié)果,NASH進(jìn)展中的胰島素抵抗會(huì)導(dǎo)致胰島素分泌的增加,而胰島素可以抑制G6PC、PCK1和FBP1表達(dá)[21-23]。同時(shí),胰島素抵抗也會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致白色脂肪組織脂解釋放甘油和游離脂肪酸增加[24]。Kalemba等[25]研究發(fā)現(xiàn),甘油的糖異生作用要顯著高于丙酮酸和乳酸,同時(shí)還會(huì)促進(jìn)G6PC和抑制PCK1,與本研究中G6PC和葡萄糖增長(zhǎng)趨勢(shì)一致,這也解釋了為什么PCK1蛋白表達(dá)明顯低于G6PC和FBP1。最近也有研究發(fā)現(xiàn),特異性敲除小鼠肝臟PCK1基因會(huì)導(dǎo)致以3-磷酸甘油為底物的脂質(zhì)合成和攝取途徑明顯增加并促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的激活[5],表明甘油的肝內(nèi)糖異生與丙酮酸的肝內(nèi)糖異生在某些情況下可能存在相互抑制。此外,PC主要受底物乙酰輔酶A的調(diào)節(jié)[26],而肝臟脂肪的不斷蓄積和胰島素抵抗的增加使肝臟中脂肪酸β氧化不斷增加,乙酰輔酶A濃度也不斷增加[27],因此甘油和脂肪酸不斷增加使PCK1逐漸下降和PC逐漸上升,這與本研究發(fā)現(xiàn)的PC和PCK1分別與NAFLD的進(jìn)展存在正負(fù)相關(guān)性的結(jié)果一致。

        本研究所用的小鼠模型可部分代表人類NAFLD的肝臟病理生理改變[28],一定程度上也表明了單純HFD對(duì)肝臟糖代謝酶蛋白水平的改變,但現(xiàn)代社會(huì)食物中包含著大量的葡萄糖/果糖,這可能導(dǎo)致代謝模式的差異,而在腫瘤中的差異可能更明顯[29-30]??傊?,高脂喂養(yǎng)的小鼠在NAFL向NASH進(jìn)展中發(fā)生了糖酵解和糖異生關(guān)鍵酶的改變,這些酶的改變可能進(jìn)一步促進(jìn)了肝臟脂質(zhì)蓄積、炎癥和纖維化的進(jìn)展,甚至可能與肝臟的脂質(zhì)蓄積和炎癥共同作用而導(dǎo)致HCC的發(fā)生發(fā)展;對(duì)表達(dá)有明顯差異的酶的調(diào)控,特別是PKM2和PCK1,可能有助于抑制NAFL向NASH的進(jìn)展。

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