李超波， 楊麗媛， 王春梅， 宋井一， 郝艷艷， 曹立瀛， 馬向明

（華北理工大學(xué)附屬開灤總醫(yī)院 肝膽外科，河北 唐山 063000）

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease， NAFLD）是目前最常見的慢性肝病，影響了全球約30%的人口［1］。約20%~30%的NAFLD患者會(huì)從早期的非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver， NAFL）進(jìn)展為非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis， NASH），并最終可能發(fā)展為不可逆的肝硬化和肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）［2］。NAFLD的發(fā)病機(jī)制最初被描述為“雙重打擊”學(xué)說，最近的研究結(jié)果描述了一種“多重打擊”學(xué)說，其中多個(gè)平行的致病事件協(xié)同作用［3］，糖代謝重編程導(dǎo)致的脂質(zhì)沉積、纖維化和肝星狀細(xì)胞的激活可以作為平行事件來推動(dòng)NAFLD的進(jìn)展［4-5］。流行病學(xué)研究表明，代謝相關(guān)疾病也是NAFLD患者發(fā)生HCC的高危因素［6］，因此高脂飲食（high-fat diet， HFD）誘導(dǎo)的肝臟脂代謝紊亂與糖代謝重編程可能是促進(jìn)NAFLD發(fā)生的因素之一。目前，對(duì)NAFL向NASH進(jìn)展的糖代謝變化的了解并不完整，我們構(gòu)建了一個(gè)NAFLD模型，探討糖代謝途徑在NAFL向NASH進(jìn)展過程中的變化及意義。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

48只3周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠購買于北京華阜康生物科技股份有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證編號(hào)：110322220101862816，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008］，飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)附屬開灤總醫(yī)院肝膽病研究所動(dòng)物飼養(yǎng)室，環(huán)境溫度控制在（23±2） ℃，濕度控制在40%~60%，自由進(jìn)食進(jìn)水。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都是在華北理工大學(xué)附屬開灤總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)下進(jìn)行的。

2 主要試劑

總膽固醇（total cholesterol， TC）、甘油三酯（triglyceride， TG）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase， ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase， AST）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）；葡萄糖檢測(cè)試劑盒（上海榮盛生物技術(shù)有限公司）；改良油紅O染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒和超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（河北瑞帕特生物科技有限公司）；RIPA裂解液（強(qiáng)）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Immobilon?-P PVDF膜（Millipore）；丙酮酸激酶M1（pyruvate kinase M1， PKM1）和β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（Cell Signaling Technology）；丙酮酸羧化酶（pyruvate carboxylase， PC）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（phosphoenolpyruvate carboxykinase 1， PCK1）和葡萄糖-6-磷酸酶催化亞基（glucose-6-phosphatase catalytic subunit， G6PC）抗體（ABclonal）；磷酸果糖激酶B（phosphofructokinase B， PFKB）、乳酸脫氫酶A（lactate dehydrogenase A， LDHA）、果糖-1，6-二磷酸酶1（fructose-1，6-bisphosphatase 1， FBP1）、PKM2、己糖激酶1（hexokinase 1， HK1）和HK2抗體（杭州華安生物技術(shù)有限公司）。

3 主要儀器

HistoStar石蠟包埋機(jī)和Gemini AS全自動(dòng)染色機(jī)（Thermo Fisher）；Sunrise酶標(biāo)儀（Tecan）；低溫離心機(jī)（無錫德凡儀器有限公司）；HistoCore PEARL組織脫水機(jī)、HistoCore BIOCUT旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)、CM1950型冰凍切片機(jī)（Leica）；全自動(dòng)凝膠成像儀（上海嘉鵬科技有限公司）；Axio Scope.A1光學(xué)顯微鏡（Carl Zeiss）。

4 分組、造模及取材

所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為對(duì)照飲食（control diet， CD）組（n=24）和HFD組（n=24）。CD組給予10%脂肪供能的普通對(duì)照飼料（XTCON50J：10%脂肪、70%碳水化合物和20%蛋白質(zhì)；江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司），HFD組給予60%脂肪供能的膽堿缺乏飼料（XTCD60：60%脂肪、20%碳水化合物和20%蛋白質(zhì)；江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司）。兩組均在給予相應(yīng)飼料喂養(yǎng)后8、12、16和20周分4批次處死小鼠，每次6只，處死前禁食12 h，予七氟烷吸入麻醉后摘除眼球取血，室溫靜置3 h后4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清，分裝后-80 ℃凍存?zhèn)溆?。頸椎脫臼法處死小鼠，取出肝臟后稱重，取部分肝臟組織制備石蠟塊以及冰凍切片。剩余組織分裝后-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

5 主要方法

5.1 肝組織HE染色 小鼠肝臟在4%中性甲醛溶液中固定24 h以上，進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，包埋后的石蠟塊切成4 um的厚度，烤片30 min，使用全自動(dòng)染色機(jī)進(jìn)行HE染色，用光學(xué)顯微鏡閱片并進(jìn)行NAFLD活動(dòng)度評(píng)分（NAFLD activity score，NAS），NAS≥5時(shí)可診斷為NASH［7］。

5.2 肝組織油紅O染色 新鮮肝組織在冰凍切片機(jī)中切成8 um的厚度，根據(jù)油紅O染色試劑盒說明書進(jìn)行油紅O染色，染色完成后光學(xué)顯微鏡觀察及拍攝。

5.3 小鼠血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 取適量血清根據(jù)試劑盒說明書檢測(cè)TC、TG、ALT、AST和葡萄糖水平。

5.4 Western blot檢測(cè) 取約40 mg肝組織，加入10倍體積RIPA裂解液及1% PMSF，使用玻璃勻漿器冰上勻漿；冰上靜置30 min后4 ℃、12 000 r/min離心10 min；取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度；加入5× loading buffer和RIPA裂解液進(jìn)行濃度均一化，使用SDSPAGE分離蛋白；電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用TBST稀釋的5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；將PVDF膜和封閉液稀釋的Ⅰ抗在4 ℃下孵育過夜；次日，TBST洗膜后使用封閉液稀釋的Ⅱ抗室溫孵育1 h；TBST洗膜后ECL發(fā)光液進(jìn)行免疫印跡可視化并拍攝；使用Photoshop 2021軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行組圖并使用ImageJ軟件對(duì)蛋白灰度值進(jìn)行測(cè)量。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 9.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖。對(duì)計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 HFD喂養(yǎng)的小鼠16周時(shí)出現(xiàn)明顯的肝臟脂質(zhì)蓄積

HFD組小鼠在喂食HFD后第4周體重開始明顯增加，到第16周顯著高于CD組（P<0.01），見圖1A。HFD組小鼠肝重到16周顯著高于CD組（P<0.01），見圖1B。HFD組肝臟指數(shù)（肝重/體重）在16周后大于CD組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖1C。相比CD組，HFD組喂食16周時(shí)可見肝臟變大且顏色變淺，見圖1D。HE染色顯示，16周CD組肝細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，胞內(nèi)無脂肪空泡出現(xiàn)，而16周HFD組存在分布廣泛的大小不等的脂肪空泡；油紅O染色顯示，16周HFD組中存在大量橘紅色脂滴，見圖1E。這些數(shù)據(jù)表明，HFD喂養(yǎng)的小鼠到16周時(shí)表現(xiàn)出明顯的肝臟脂質(zhì)蓄積。

Figure 1. Mouse body weight （A）， liver weight （B）， liver index （C）， liver gross appearance at 16 weeks （D）， and HE and oil red O staining of liver tissues at 16 weeks （E， ×200）. CD： control diet； HFD： high-fat diet. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs CD group.圖1 小鼠體重、肝重、肝臟指數(shù)、16周肝臟外觀及16周肝組織HE和油紅O染色圖

2 HFD組小鼠在16周時(shí)出現(xiàn)外周血糖脂代謝紊亂并大部分進(jìn)展為NASH

HFD組小鼠血清TC水平在16周后顯著高于CD組（P<0.05），而血清ALT和血糖水平在12周以后較CD組顯著升高（P<0.05），見圖2A~C。另外在所有實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)兩組血清TG和AST水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖2D、E。小鼠肝臟在第8周時(shí)出現(xiàn)大-微泡性脂肪變性，并在隨后的實(shí)驗(yàn)期間進(jìn)展到更嚴(yán)重的地步（圖2G），這些結(jié)果與之前的研究類似［8］。根據(jù)NAS評(píng)估小鼠肝脂肪變性、小葉炎癥和氣球樣變［7］，結(jié)果顯示HFD組小鼠在16周時(shí)大部分表現(xiàn)為NASH（圖2F），與肝重（圖1B）增長(zhǎng)時(shí)間一致，HFD組各階段的油紅O染色（圖2G）與此表現(xiàn)一致。這些數(shù)據(jù)表明，高脂喂養(yǎng)的小鼠外周血主要在16周后發(fā)生糖脂紊亂，而肝組織脂肪病變?cè)?周甚至更早期就已經(jīng)開始，在16周時(shí)大部分進(jìn)展為NASH。

Figure 2. Serum levels of total cholesterol （TC； A）， alanine aminotransferase （ALT； B）， glucose （C）， triglyceride （TG； D） and aspartate aminotransferase （AST； E）， hepatic NAFLD activity score （NAS； F）， and representative images of HE and oil red O staining （G， ×200） in mice at different time points. CD： control diet； HFD： high-fat diet. Mean±SD. n=6. *P<0.05，**P<0.01 vs CD group.圖2 小鼠各階段血清TC、ALT、葡萄糖、TG、AST水平及肝臟NAS、HFD組HE染色和油紅O染色圖片

3 小鼠糖酵解酶表達(dá)水平

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示HFD組小鼠在16周時(shí)出現(xiàn)明顯的NASH改變并伴隨外周血糖脂紊亂，通過Western blot檢測(cè)16周CD組和HFD組小鼠肝糖酵解酶的蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，與16周CD組相比，HFD組小鼠肝糖酵解關(guān)鍵酶HK1、HK2、PKM2和LDHA蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05或P<0.01），PFKB和PKM1蛋白表達(dá)基本不變（P>0.05），見圖3A。HK2和PKM2亞型的表達(dá)與有氧糖酵解密切相關(guān)［9］，為了進(jìn)一步明確糖酵解酶的表達(dá)趨勢(shì)，對(duì)第8、12、16和20周HFD組小鼠肝糖酵解酶表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)HK2、PKM2和LDHA蛋白表達(dá)水平都隨著NAFLNASH進(jìn)展而升高（P<0.01），見圖3B。這些結(jié)果提示，HFD誘導(dǎo)的小鼠肝內(nèi)有氧糖酵解增加且與NAFL向NASH進(jìn)展有關(guān)。

Figure 3. Protein expression levels of glycolytic enzymes， hexokinase 1 （HK1）， HK2， phosphofructokinase B （PFKB）， pyruvate kinase M1 （PKM1）， PKM2 and lactate dehydrogenase A （LDHA）， in mouse liver tissues. CD： control diet； HFD： high-fat diet. Mean±SD. n=6. *P<0.05， **P<0.01 vs CD group； ##P<0.01 vs 8 weeks.圖3 小鼠肝組織糖酵解酶蛋白表達(dá)水平

4 小鼠糖異生關(guān)鍵酶表達(dá)水平

與糖酵解關(guān)鍵酶表達(dá)水平的升高相反，與16周CD組相比，HFD組小鼠肝糖異生關(guān)鍵酶G6PC、FBP1和PCK1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），PC蛋白表達(dá)水平基本不變（P>0.05），見圖4A。同樣，對(duì)第8、12、16和20周HFD組小鼠肝糖異生關(guān)鍵酶表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，在NAFL向NASH的進(jìn)展中，PCK1蛋白表達(dá)水平逐漸降低（P<0.01），PC蛋白表達(dá)水平逐漸升高（P<0.05），F(xiàn)BP1蛋白表達(dá)水平未出現(xiàn)顯著改變（P>0.05），與LDHA類似，G6PC蛋白表達(dá)水平主要從第12周就顯著升高（P<0.05），見圖4B。這些結(jié)果提示，HFD誘導(dǎo)的小鼠肝內(nèi)糖異生酶表達(dá)水平降低且與NAFL向NASH進(jìn)展有關(guān)。

Figure 4. Protein expression levels of key gluconeogenic enzymes， glucose-6-phosphatase catalytic subunit （G6PC）， fructose-1，6-bisphosphatase 1 （FBP1）， phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 （PCK1） and pyruvate carboxylase （PC）， in mouse liver tissues. CD： control diet； HFD： high-fat diet. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs CD group； #P<0.05， ##P<0.01 vs 8 weeks.圖4 小鼠肝組織糖異生關(guān)鍵酶蛋白表達(dá)水平

5 NAFLD小鼠肝組織糖代謝酶蛋白表達(dá)水平與NAS的相關(guān)性

小鼠肝組織糖代謝酶PKM2、LDHA、G6PC、PCK1和PC在NAFL向NASH進(jìn)展中的表達(dá)水平與NAS存在顯著相關(guān)性（P<0.05或P<0.01），而HK2與NAS的相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），其中PKM2、PCK1和PC與NAS存在強(qiáng)的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，見表1。

表1 NAS與糖代謝酶蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性Table 1. Correlations between NAFLD activity score （NAS） and the protein levels of glucose metabolism enzymes

討論

NAFLD通常合并有代謝綜合征，如2型糖尿病、全身性高血壓、血脂異常和胰島素抵抗等，而代謝重編程在NAFLD中導(dǎo)致了脂質(zhì)在肝臟內(nèi)的異常積累、炎癥反應(yīng)的增加以及肝細(xì)胞受損［10］。本研究中HFD組小鼠飲水中并未添加果糖/葡萄糖，HFD組數(shù)據(jù)可準(zhǔn)確反映HFD對(duì)糖代謝的影響。同時(shí)，HFD中缺乏膽堿，這會(huì)導(dǎo)致極低密度脂蛋白生成障礙，從而加快肝臟中甘油三酯蓄積，但外周血中甘油三酯并不會(huì)明顯增加，這與我們的研究一致。本研究發(fā)現(xiàn)，12周后在HFD組小鼠中觀察到外周血糖脂代謝紊亂，在16周時(shí)肝臟變大且顏色變淺，NAS提示肝臟在16周時(shí)大部分進(jìn)展為NASH，而肝臟脂肪變性>50%時(shí)才會(huì)表現(xiàn)出明顯的肝臟肥大［11］，表明隨著NAFL向NASH的進(jìn)展，除了肝臟脂質(zhì)蓄積明顯增加外，也會(huì)導(dǎo)致外周血糖脂紊亂。

為了進(jìn)一步明確HFD是否會(huì)導(dǎo)致肝臟出現(xiàn)糖代謝重編程，我們檢測(cè)了小鼠肝臟糖酵解和糖異生相關(guān)酶的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HFD組小鼠肝臟HK1、HK2、PKM2和LDHA蛋白表達(dá)在16周時(shí)明顯升高，對(duì)隨飲食時(shí)間梯度的HFD組小鼠肝臟糖酵解酶蛋白表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HK2、PKM2和LDHA與NAFL向NASH的進(jìn)展趨勢(shì)相同，而后兩者與NAFLD進(jìn)展存在顯著相關(guān)性，特別是PKM2，提示HFD會(huì)持續(xù)誘導(dǎo)肝臟的有氧糖酵解。研究表明，有氧糖酵解的多種底物可以促進(jìn)脂肪從頭生成［12］，抑制脂肪從頭合成也會(huì)導(dǎo)致糖酵解和血糖的降低［13-14］。此外，PKM2的增加與肝巨噬細(xì)胞和特異性Kupffer細(xì)胞的M1極化密切相關(guān)［15］。M1型巨噬細(xì)胞釋放的腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素6（interleukin-6， IL-6）和IL-1β會(huì)刺激肝星狀細(xì)胞活化，促進(jìn)脂肪分解，與HCC發(fā)病有關(guān)［16-17］。PKM2的共價(jià)抑制會(huì)促進(jìn)巨噬細(xì)胞從M1型向M2型極化的轉(zhuǎn)變，對(duì)抗NAFLD的發(fā)展［17］。NAFLD患者Rouxen-Y胃繞道手術(shù)后肝脂肪含量和炎癥的減少也與肝臟和血清中PKM2的減少有關(guān)［18］。而HK2和乳酸表達(dá)增加導(dǎo)致的組蛋白乳酸化是肝星狀細(xì)胞激活的關(guān)鍵［19］。這些研究表明，HK2、PKM2和乳酸是肝臟脂肪生成、炎癥、纖維化及HCC進(jìn)展的重要共同因素。因此，在不去除外源性脂肪攝入的情況下，肝臟脂質(zhì)攝入和有氧糖酵解可能互相加重，共同導(dǎo)致NAFL向NASH甚至HCC進(jìn)展。

在肝臟的糖異生代謝方面，我們發(fā)現(xiàn)，HFD組小鼠肝臟糖異生關(guān)鍵酶G6PC、FBP1和PCK1蛋白在16周時(shí)表達(dá)水平均下降，表明在NASH的早期階段空腹時(shí)抑制了糖異生酶的表達(dá)，但HFD組小鼠空腹血糖并沒有明顯降低，提示糖異生通量是增加的。隔夜禁食后空腹血糖的來源主要為肝糖異生［20］，糖異生通量是胰島素、升糖激素和糖異生底物共同作用的結(jié)果，NASH進(jìn)展中的胰島素抵抗會(huì)導(dǎo)致胰島素分泌的增加，而胰島素可以抑制G6PC、PCK1和FBP1表達(dá)［21-23］。同時(shí)，胰島素抵抗也會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致白色脂肪組織脂解釋放甘油和游離脂肪酸增加［24］。Kalemba等［25］研究發(fā)現(xiàn)，甘油的糖異生作用要顯著高于丙酮酸和乳酸，同時(shí)還會(huì)促進(jìn)G6PC和抑制PCK1，與本研究中G6PC和葡萄糖增長(zhǎng)趨勢(shì)一致，這也解釋了為什么PCK1蛋白表達(dá)明顯低于G6PC和FBP1。最近也有研究發(fā)現(xiàn)，特異性敲除小鼠肝臟PCK1基因會(huì)導(dǎo)致以3-磷酸甘油為底物的脂質(zhì)合成和攝取途徑明顯增加并促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的激活［5］，表明甘油的肝內(nèi)糖異生與丙酮酸的肝內(nèi)糖異生在某些情況下可能存在相互抑制。此外，PC主要受底物乙酰輔酶A的調(diào)節(jié)［26］，而肝臟脂肪的不斷蓄積和胰島素抵抗的增加使肝臟中脂肪酸β氧化不斷增加，乙酰輔酶A濃度也不斷增加［27］，因此甘油和脂肪酸不斷增加使PCK1逐漸下降和PC逐漸上升，這與本研究發(fā)現(xiàn)的PC和PCK1分別與NAFLD的進(jìn)展存在正負(fù)相關(guān)性的結(jié)果一致。

本研究所用的小鼠模型可部分代表人類NAFLD的肝臟病理生理改變［28］，一定程度上也表明了單純HFD對(duì)肝臟糖代謝酶蛋白水平的改變，但現(xiàn)代社會(huì)食物中包含著大量的葡萄糖/果糖，這可能導(dǎo)致代謝模式的差異，而在腫瘤中的差異可能更明顯［29-30］?？傊?，高脂喂養(yǎng)的小鼠在NAFL向NASH進(jìn)展中發(fā)生了糖酵解和糖異生關(guān)鍵酶的改變，這些酶的改變可能進(jìn)一步促進(jìn)了肝臟脂質(zhì)蓄積、炎癥和纖維化的進(jìn)展，甚至可能與肝臟的脂質(zhì)蓄積和炎癥共同作用而導(dǎo)致HCC的發(fā)生發(fā)展；對(duì)表達(dá)有明顯差異的酶的調(diào)控，特別是PKM2和PCK1，可能有助于抑制NAFL向NASH的進(jìn)展。