劉倩， 楊姣▲， 石西南， 徐悅， 杜曉華△

（1昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650032；2云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease， COPD）是一種漸發(fā)性疾病，主要由吸入刺激性物質(zhì)引起呼吸道炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致氣流受阻和氣管粘膜上皮病變［1-2］。該病在全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率較高，且目前只有對(duì)癥的保守治療方法，例如減少吸入刺激物、增加適量運(yùn)動(dòng)、減輕炎癥反應(yīng)等［3］。COPD發(fā)病的分子機(jī)制很復(fù)雜，多種炎性細(xì)胞參與了COPD的發(fā)病過程。研究顯示，在COPD患者的呼吸道組織中，巨噬細(xì)胞數(shù)量比健康組織高5-10倍，并且巨噬細(xì)胞的極化對(duì)于COPD的炎癥反應(yīng)有決定性作用［1，4］。進(jìn)一步的研究觀察，巨噬細(xì)胞中CD86的表達(dá)增加是許多炎性疾病發(fā)展的重要因素［5］。同時(shí)，CD86和iNOS等的增加，CD11b和CD45等的減少與M0巨噬細(xì)胞向M1型的轉(zhuǎn)化有關(guān)［6］。研究報(bào)道，在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷中，巨噬細(xì)胞的Toll樣受體4（Toll-like receptor 4， TLR4）表達(dá)顯著增強(qiáng)［7］。此外，巨噬細(xì)胞還可與香煙煙霧中的某些提取物相結(jié)合誘導(dǎo)TLR2和TLR4通路的激活，加重肺細(xì)胞的損傷，提高炎癥水平［8］。呼吸道內(nèi)TLR4信號(hào)通路激活會(huì)釋放炎性物質(zhì)，誘導(dǎo)大量炎性因子釋放，并聚集巨噬細(xì)胞使其向促炎型的M1型極化，加重COPD的病情［9］。由于COPD患者肺組織中的巨噬細(xì)胞吞噬功能存在缺陷，未被清除的細(xì)菌、凋亡的細(xì)胞和一些化學(xué)物質(zhì)持續(xù)刺激呼吸系統(tǒng)，導(dǎo)致炎癥持續(xù)存在［10］。

N-乙?；彼?甘氨酸-脯氨酸（N-acetylated proline-glycine-proline， N-Ac-PGP）是由肺部的慢性炎癥和肺泡損傷過程中由膠原蛋白經(jīng)基質(zhì)蛋白酶降解產(chǎn)生的活性三肽［11］。腰椎間盤中的N-Ac-PGP誘導(dǎo)軟骨終板干細(xì)胞骨架重排和促炎表型分化，最終促進(jìn)退行性椎間盤的炎癥反應(yīng)［12］。此外，在COPD患者的痰液和血清中均檢測(cè)到N-Ac-PGP的表達(dá)［13］，同時(shí)被發(fā)現(xiàn)N-Ac-PGP存在于COPD的炎癥反應(yīng)中，因此將N-Ac-PGP視為COPD潛在的生物標(biāo)志［14］。研究表明，N-Ac-PGP與IL-8的結(jié)構(gòu)和功能相似，可以通過趨化作用將炎性細(xì)胞聚集到損傷組織，進(jìn)一步加重組織的炎癥反應(yīng)促進(jìn)COPD的發(fā)展［15］。據(jù)報(bào)道，中性粒細(xì)胞是慢性炎癥的先天免疫細(xì)胞，可以被N-Ac-PGP誘導(dǎo)到肺組織炎癥部位。但是，N-Ac-PGP在COPD中調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型促進(jìn)炎癥的研究還未見報(bào)道。

人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP-1被廣泛運(yùn)用于巨噬細(xì)胞功能、機(jī)制和通路的研究中。根據(jù)以前的實(shí)驗(yàn)研究，使用佛波脂（phorbol 12-myristate 13-acetate， PMA）誘導(dǎo)處理便能將THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M0型巨噬細(xì)胞［6］。本研究采用N-Ac-PGP處理M0型巨噬細(xì)胞，分析N-Ac-PGP對(duì)M1型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的機(jī)制。TLR4的異常表達(dá)與COPD的炎癥有關(guān)，故探究N-Ac-PGP是否通過TLR4誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1極化從而促進(jìn)COPD炎癥反應(yīng)，為減輕COPD的炎癥和免疫失調(diào)提供參考資料。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

THP-1細(xì)胞購于中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所細(xì)胞庫；10%胎牛血清、雙抗、DMEM培養(yǎng)液和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；TRIzol RNA提取液和脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）購自Invitrogen；PMA購于Sigma-Aldrich；N-AC-PGP購自南京肽谷生物科技有限公司；TLR4抑制劑TAK-242購自AbMole BioScience；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、ECL試劑、Ⅰ抗、Ⅱ抗和ELISA檢測(cè)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 痰液樣本納入及分組 收集2022年8~12月我院呼吸內(nèi)科因COPD而入院治療病人13例作為研究對(duì)象，納入符合以下標(biāo)準(zhǔn)的患者：（1）患者病情穩(wěn)定，近3月病情未惡化；（2）無嚴(yán)重心腦血管疾??；（3）無自身免疫疾??；（4）無惡性腫瘤放化療。對(duì)照組納入經(jīng)肺功能和電子支氣管鏡檢查無異常發(fā)現(xiàn)者10例作為研究對(duì)象，兩組在年齡和性別方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。根據(jù)痰液誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)方法［16］，霧化前生理鹽水清理鼻腔，誘導(dǎo)前15 min吸入200 μg沙丁胺醇，霧化吸入3%高滲鹽水以5 min微間隔持續(xù)15~20 min，咳出痰液，收集于無菌干燥培養(yǎng)皿中。合格痰液標(biāo)本使用0.9%的鹽水按1∶1稀釋，置于-80 ℃冰箱保存。所有受試者均遵循自愿參加原則，簽署知情同意書，并經(jīng)過昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2.2 電噴霧離子化-液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜（electrospray ionization-liquid chromatrography-mass spectrum/mass spectrum， ESI-LC-MS/MS）檢測(cè)人痰液中N-Ac-PGP含量 取痰液樣本進(jìn)行質(zhì)譜分析。使用配備Shimadzu HPLC的MDS Sciex API-4000光譜儀（Aplied Biosystems）測(cè)量N-Ac-PGP。采用2.1×150 mm Develosil C30色譜柱進(jìn)行HPLC（緩沖液A：0.1%甲酸，緩沖液B：乙腈加0.1%甲酸；0~0.6 min內(nèi)80%緩沖液A/20%緩沖液B，0.6~5 min內(nèi)0%緩沖液A/100%緩沖液B）。用100%異丙醇/0.1%甲酸沖洗去除背景。N-Ac-PGP的正電噴霧質(zhì)量躍遷為312-140和312-112。

2.3 ELISA檢測(cè)COPD患者痰液炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1α（interleukin-1α， IL-1α）和IL-12的表達(dá) 痰液離心，取上清液，用ELISA試劑盒按說明書測(cè)量細(xì)胞因子IL-1α和IL-12的表達(dá)量。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 THP-1細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、1%抗生素（1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞分成THP-1組（正常培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞）、PMA組/M0組（使用10 μg/L的PMA處理THP-1細(xì)胞24 h，誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化為M0型巨噬細(xì)胞［17］）、PMA+LPS組/LPS組（使用100 μg/L LPS處理M0型巨噬細(xì)胞24 h，進(jìn)一步誘導(dǎo)M0型巨噬細(xì)胞極化為M1型巨噬細(xì)胞［18］）、N-Ac-PGP組（使用1 μg/L N-Ac-PGP處理M0型巨噬細(xì)胞24 h）和N-Ac-PGP+TAK-242組（使用TLR4抑制劑TAK-242和N-Ac-PGP同時(shí)處理M0型巨噬細(xì)胞，培養(yǎng)24 h）。

2.5 RT-qPCR檢測(cè)CD11b、CD45、CD86和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase， iNOS）的mRNA表達(dá)水平 Trizol法提取收集各組細(xì)胞總RNA，DNA酶處理后按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄。取2 μL cDNA放入EP管為模板，采用SYBR Green Master Mix反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參照，檢測(cè)目的基因的相對(duì)表達(dá)。測(cè)定模板Ct值，2-ΔΔCt法定量相對(duì)表達(dá)量。引物由昆明擎科生物科技有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列Table 1. Sequences of the primers

2.6 Western blot檢測(cè)CD11b、CD45、CD86和iNOS蛋白表達(dá)水平 收集各組巨噬細(xì)胞，用含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液裂解細(xì)胞，加入胰酶裂解蛋白，用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。10%SDS-PAGE分離蛋白樣本，電轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，加入5%脫脂奶粉封膜處理1小時(shí)。加入稀釋好的Ⅰ抗4 ℃孵育過夜；次日，去除Ⅰ抗，TBST清洗3次后，加入Ⅱ抗室溫孵育2小時(shí)。最后進(jìn)行ECL顯色，凝膠成像采集儀收集圖像，使用ImageJ分析圖像灰度值。

2.7 ELISA檢測(cè)腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、IL-1β、IL-23和IL-6的水平 收集各組細(xì)胞上清液，使用ELISA檢測(cè)試劑盒，按說明書對(duì)細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-23的含量進(jìn)行檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各個(gè)細(xì)胞因子的含量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所得數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。使用Pearson相關(guān)系數(shù)（r）測(cè)試痰液樣本中變量之間的關(guān)系。兩組間差異比較采用t檢驗(yàn)，多組間差異比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 COPD患者痰液中檢測(cè)到N-Ac-PGP，且與患者痰液中細(xì)胞因子IL-α和IL-12顯著相關(guān)

ESI-LC-MS/MS檢查10名對(duì)照者和13名COPD患者的誘導(dǎo)痰中的N-Ac-PGP，有11名COPD患者痰液中N-Ac-PGP高出檢出限呈陽性，而對(duì)照者痰液中N-Ac-PGP呈陰性（圖1A）。ELISA檢測(cè)觀察到IL-1α和IL-12在COPD患者中高表達(dá)（圖1B、C）。COPD患者痰液中的N-Ac-PGP水平與IL-1α和IL-12的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)（圖1D、E）。

Figure 1. The detection results of sputum samples. A： N-Ac-PGP was measured by ESI-LC-MS/MS with a detection limit of 10 ng/L（dashed line）； B and C： the expression of IL-1α and IL-12 in the sputum was detected by ELISA； D and E： the correlation between N-Ac-PGP and IL-12/IL-1α in the sputum of COPD patients was measured by Pearson analysis. Mean±SD. n=10 in control group； n=13 in COPD group. *P<0.05， **P<0.01 vs control group.圖1 痰液樣本檢測(cè)結(jié)果

2 M0和M1型巨噬細(xì)胞模型的構(gòu)建情況

RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示，與THP-1和PMA+LPS組相比，PMA組M0型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白CD11b和CD45的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）；PMA組M1型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白CD86和iNOS的mRNA和蛋白表達(dá)水平與THP-1組相比無顯著差異（P>0.05），但PMA+LPS組CD86和iNOS的mRNA和蛋白表達(dá)水平均較其他兩組顯著升高（P<0.01），見圖2。

Figure 2. The mRNA and protein expression levels of M0 and M1 macrophage surface markers. A： the mRNA expression levels detected by RT-qPCR； B： the protein expression levels detected by Western blot. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs THP-1 group； #P<0.05， ##P<0.01 vs PMA group.圖2 M0和M1型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物的mRNA和蛋白表達(dá)

3 N-Ac-PGP促進(jìn)M0型巨噬細(xì)胞向M1型極化

RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示，與M0組相比，LPS和N-Ac-PGP處理M0型巨噬細(xì)胞后M1型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物CD86和iNOS的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），見圖3A、B。ELISA結(jié)果顯示，LPS組和N-Ac-PGP組細(xì)胞上清液中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-23的含量與M0組相比均顯著增多（P<0.01），見圖3C。

Figure 3. Treatment with N-Ac-PGP promoted the polarization of M0 macrophages to M1-type. A： the mRNA expression levels detected by RT-qPCR； B： the protein expression levels detected by Western blot； C： the expression of cytokines detected by ELISA. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs M0 group.圖3 N-Ac-PGP處理促進(jìn)M0型巨噬細(xì)胞的M1極化

4 N-Ac-PGP通過TLR4促進(jìn)M0型巨噬細(xì)胞的M1極化

RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示，與N-Ac-PGP組相比，N-Ac-PGP與TAK-242聯(lián)合處理后M0型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白CD86和iNOS的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下降（P<0.05或P<0.01），見圖4A、B。ELISA結(jié)果顯示，N-Ac-PGP與TAK-242聯(lián)合處理后細(xì)胞上清液中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-23的含量較N-Ac-PGP組均顯著減少（P<0.05或P<0.01），見圖4C。

Figure 4. Inhibition of the TLR4 pathway by TAK-242 attenuated the promoting effect of N-Ac-PGP on M0 macrophage polarization to M1-type. A： the mRNA expression levels tested by RT-qPCR； B： the protein expression levels detected by Western blot；C： the expression of cytokines detected by ELISA. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs N-Ac-PGP group.圖4 抑制TLR4通路減弱N-Ac-PGP促進(jìn)M0型巨噬細(xì)胞向M1型極化的作用

討論

COPD是一種慢性疾病，早期癥狀不明顯，確診時(shí)往往已發(fā)展至中晚期，嚴(yán)重影響患者的身心健康和家庭生活［19］。COPD發(fā)病由炎癥、細(xì)胞生長、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞異常修復(fù)等多種因素引起［2］。COPD患者的痰液和肺中觀察到的巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，表明巨噬細(xì)胞與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)［20］。研究表明，吸入的刺激物會(huì)激活呼吸道內(nèi)的巨噬細(xì)胞M1型極化促進(jìn)炎癥增加，M1巨噬細(xì)胞在分泌炎性細(xì)胞因子引起炎癥反應(yīng)的同時(shí)，其較強(qiáng)的吞噬功能也會(huì)持續(xù)損傷組織［20］。肺部疾病的慢性炎癥會(huì)導(dǎo)致肺組織破壞，從而導(dǎo)致趨化性膠原蛋白片段N-Ac-GPG的形成。有學(xué)者觀察到香煙煙霧刺激機(jī)體產(chǎn)生N-Ac-PGP，NAc-PGP特異性趨化嗜中性粒細(xì)胞入侵肺組織，加速肺組織穩(wěn)態(tài)的破壞［24］，但尚未有N-Ac-PGP與巨噬細(xì)胞相互作用在COPD中的研究。

本研究初步探討N-Ac-PGP通過激活TLR4促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1極化促進(jìn)COPD的炎癥發(fā)生。通過檢測(cè)COPD患者痰液樣本中的N-Ac-PGP和M1巨噬細(xì)胞的表達(dá)情況，觀察到COPD患者痰液中N-Ac-PGP和M1型標(biāo)志物的表達(dá)升高，并且N-Ac-PGP的水平與M1分泌的炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平顯著相關(guān)，表明N-Ac-PGP可能通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1極化促進(jìn)COPD的炎癥發(fā)生。為了進(jìn)一步探究N-Ac-PGP與COPD炎癥中巨噬細(xì)胞M1型極化的聯(lián)系，使用LPS和N-Ac-PGP處理M0巨噬細(xì)胞，結(jié)果表明LPS和NAc-PGP對(duì)巨噬細(xì)胞M1極化均有促進(jìn)作用。巨噬細(xì)胞M1極化后會(huì)釋放IL-23、IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性細(xì)胞因子從而引起一系列炎癥反應(yīng)［25］。同樣實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-23等炎性因子表達(dá)上調(diào)，可見N-Ac-PGP誘導(dǎo)M0巨噬細(xì)胞向M1型極化。已有研究表明，TLR4的高表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞M1極化有促進(jìn)作用，例如香煙煙霧中的提取物可以通過直接或間接作用與TLR4受體結(jié)合，激活TLR4/NF-κB信號(hào)通路參與巨噬細(xì)胞的M1極化［26］。此外，在COPD中，紫蘇葉提取物或一些藥物通過抑制TLR4通路減輕COPD的氣道炎癥［27］。綜合以上因素，接下來探究TLR4通道對(duì)于N-Ac-PGP促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1極化的影響。在N-Ac-PGP處理的基礎(chǔ)上采用TLR4抑制劑處理M0細(xì)胞，檢測(cè)對(duì)比巨噬細(xì)胞M1極化情況，結(jié)果表明TLR4抑制劑對(duì)N-Ac-PGP促進(jìn)的巨噬細(xì)胞M1極化有顯著的抑制作用，綜上所述，N-Ac-PGP激活巨噬細(xì)胞M1極化促進(jìn)炎癥需要通過TLR4受體通道。

總之，本研究使用N-Ac-PGP處理M0型巨噬細(xì)胞，結(jié)果表明N-Ac-PGP對(duì)M0型巨噬細(xì)胞向M1型極化的有正向調(diào)節(jié)作用，并通過TLR4通路抑制劑驗(yàn)證了N-Ac-PGP通過TLR4通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1極化。