陳虹， 崔婧， 羅晨， 李峰

（1山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，山西 太原 030001；2山西省腫瘤醫(yī)院中心實驗室，山西 太原 030013）

胃癌是一種侵襲性和異質性的惡性腫瘤，是全球乃至東亞地區(qū)最常見的腫瘤之一［1-2］。盡管胃癌已經(jīng)不再是第二大常見腫瘤了，死亡人數(shù)近幾年也緩步下降，但因我國人口基數(shù)大，人口老齡化日益加劇，而胃癌的高發(fā)年齡在70歲左右，它在我國的死亡率依舊占據(jù)高地［3-4］。因此，在早期和可治愈的階段尋找新的診斷和治療方法，并從中了解胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，以更好的獲知晚期胃癌新的治療靶點，在臨床上的作用和意義也是十分重要的。微小RNA（microRNA， miRNA， miR）是一類非編碼蛋白的單鏈RNA分子（22~26個核苷酸），參與了許多細胞過程中的表觀遺傳機制，對細胞的增殖、分化和凋亡有重要的調節(jié)作用，在正常組織和腫瘤組織中的表達顯著不同，參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［5］。過往研究表明，miR-433-3p在大多數(shù)腫瘤中起到抑制作用［6-7］。miR-433-3p靶向MAPK8抑制肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移［6］。上調miR-433-3p可顯著抑制膠質瘤細胞增殖、侵襲和遷移，促進細胞凋亡［7］。在線數(shù)據(jù)庫預測結果顯示，異染色質蛋白1結合蛋白3（heterochromatin protein 1 binding protein 3， HP1BP3）mRNA與miR-433-3p有結合位點，其基因是miR-433-3p的潛在靶基因。HP1BP3是一種新的染色質結合蛋白，具有獨特的染色質結合決定因子，參與了基因表達的調節(jié)，在細胞的生存和生長中起重要作用［8］。有研究發(fā)現(xiàn)，HP1BP3在肝癌細胞株中表達上調，促進肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展，而沉默HP1BP3基因可抑制肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移［9］。從已有的報道中，我們發(fā)現(xiàn)miR-433-3p和HP1BP3在腫瘤中發(fā)揮調控作用并且影響腫瘤細胞的生物學功能［6-7，9］，但二者在胃癌的研究中甚是少見。本研究旨在探索miR-433-3p對胃癌細胞生物學行為的影響以及miR-433-3p是否通過靶向HP1BP3調控胃癌細胞的增殖和遷移，以期為胃癌的診療尋找新的靶點。

材料和方法

1 細胞、組織和主要試劑

人正常胃黏膜上皮細胞系GES-1及人胃癌細胞系HGC-27和AGS由山西省腫瘤醫(yī)院中心實驗室提供。收集于2021年1月至2022年12月，臨床確診的胃癌患者組織由山西省腫瘤醫(yī)院生物樣本庫提供（山西省重點研發(fā)計劃項目樣本采集，倫理編號：202007）。胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)液（Hy-Clone）；青/鏈霉素混合液和胰蛋白酶消化液（Solarbio）；LipofectamineTM2000試劑盒和TRIzol（Invitrogen）；miR-433-3p mimic（序列為5′-AUCAUGAUGGGCUCCUCGGUGU-3′）和陰性對照（negative control，NC）mimic（序列為5′-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3′）由上海生物工程有限公司提供；HP1BP3siRNA （si-HP1BP3；序列為5′-GUCCAAACCUGCACCUAAATT-3′）和NC siRNA （si-NC；序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′）由上海吉瑪公司提供；HP1BP3抗體和GAPDH抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；雙螢光素酶報告基因實驗試劑盒（Abcam）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) HGC-27、AGS和GES-1細胞在完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)，該培養(yǎng)液配比是10%的胎牛血清、1%的青-鏈霉素和89%的RPMI-1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。

2.2 細胞分組和處理 將HGC-27和AGS細胞分為NC mimic組、miR-433-3p mimic組、si-NC組和si-HP1BP3組。按照Lipofectamine 2000的說明書，對應組別進行轉染。2種細胞共8組，每組設置3個復孔。

2.3 RT-qPCR檢測HGC-27和AGS細胞miR-433-3p mimic和mimic NC的轉染效率 將2.2中轉染的各組細胞培養(yǎng)48 h，用Trizol試劑從HGC-27和AGS細胞中提取總RNA。使用NanoDrop 2000分光光度計測定RNA濃度和純度后，將RNA逆轉錄為cDNA。在ViiA7 PCR儀上進行PCR擴增。miR-433-3p的上游引物序列為5′-GCCGAGGAGCCCATCATGAT-3′，下游引物序列為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；U6的上游引物序列為5′-CATGCTTGCTGCTGCCC-3′，下游引物序列為5′-GAGTACTGGGTCCGTTT-3′。每組設3個復孔。通過2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)分析。

2.4 CCK-8法檢測HGC-27和AGS細胞活力 將2.2中轉染的各組細胞培養(yǎng)24 h后以每孔3×103個接種至96孔板。等到細胞貼壁狀態(tài)穩(wěn)定后加入10 μL CCK-8，于37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)2 h。使用酶標儀測定450 nm波長的吸光度（A）。后續(xù)分別在24、48、72和96 h測定A值。每組設4個復孔。

2.5 劃痕愈合實驗檢測HGC-27和AGS細胞遷移能力 將2.2中轉染的各組細胞以每孔1×103個接種于6孔板，細胞鋪滿板內90%的空間時，用200 μL槍頭對細胞進行垂直水平劃線，PBS清洗后，加入新的培養(yǎng)液。熒光顯微鏡拍攝0、12和24 h細胞劃痕照片。用軟件計算細胞劃痕愈合情況。每組設3個復孔。

2.6 Transwell實驗檢測HGC-27和AGS細胞侵襲能力 取45 μL基質膠加入Transwell小室，37 ℃凝固2 h。將2.2中轉染的各組細胞用無血清的培養(yǎng)液重懸，細胞密度調整至2×105mL-1，取100 μL重懸液垂直加入上室中，在下室中加入600 μL 10%培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h左右。使用4%多聚甲醛固定30~60 min，0.1%結晶紫染色15 min，顯微鏡下隨機挑選3個視野拍攝并計數(shù)遷移細胞數(shù)目。

2.7 細胞集落形成實驗檢測HGC-27和AGS細胞增殖能力 將2.2中轉染的各組細胞以每孔2×103個接種于6孔板中，2~3 d更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)時長約為8~14 d。顯微鏡下觀察，當細胞團接近50個細胞或者培養(yǎng)時長已達14 d時，4%多聚甲醛固定30~60 min，結晶紫染色15 min，PBS清洗后晾干并拍照。

2.8 雙螢光素酶報告基因實驗 轉染前1 d，細胞按照每孔（2~3）×105個接種于24孔板，使用完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）；第2天轉染時觀察細胞匯合度約70%~75%，將舊培養(yǎng)液棄除，PBS洗滌2~3次，加入培養(yǎng)液（5%胎牛血清）；將miR-433-3p與HP1BP3質粒載體共轉染細胞，每組重復3次；轉染24~36 h后，將舊培養(yǎng)液棄除，用PBS洗滌2~3次收集細胞后裂解細胞，將10 μL細胞裂解液加入96孔板中，通過酶標儀檢測螢火蟲和海腎螢光素酶活性。

2.9 Western blot檢測HP1BP3蛋白表達 將2.2中轉染的細胞培養(yǎng)至72~96 h，RIPA溶液提取各組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，95 ℃煮沸10 min使蛋白變性。每孔蛋白上樣量40 μg，通過10% SDSPAGE分離蛋白，全濕轉膜法將蛋白轉移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉1~2 h。Ⅰ抗（HP1BP3抗體，1∶2 000稀釋；內參照GAPDH抗體，1∶10 000稀釋）4 ℃搖床孵育過夜。Ⅱ抗IgG（1∶20 000稀釋）室溫孵育1 h。加入ELC顯影液，避光顯影，曝光拍照。

2.10 免疫組化檢測HP1BP3的表達 取胃癌組織及癌旁5 cm以上的正常組織20例，將取得的胃癌腫瘤組織塊投入預先配好的10%福爾馬林固定液中。通過固定、脫水、包埋、切片及脫蠟過程，再進行抗原修復和牛血清白蛋白封閉，Ⅰ抗、Ⅱ抗處理后進行染色，封片處理。顯微鏡下觀察表達結果。

3 統(tǒng)計學處理

所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）描述，兩組數(shù)據(jù)的分析采用雙尾t檢驗或校正t檢驗，多組數(shù)據(jù)的分析使用單因素方差分析、秩和檢驗等。P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 胃癌細胞系中miR-433-3p的相對表達量

RT-qPCR結果顯示，miR-433-3p在人胃癌HGC-27、MGC-803和AGS細胞中表達明顯低于人胃黏膜上皮細胞系GES-1（圖1A），我們選取HGC-27和AGS細胞進行后續(xù)實驗。與轉染了NC mimic的細胞相比，轉染miR-433-3p mimic的HGC-27和AGS細胞中miR-433-3p表達水平顯著升高（P<0.05），表明miR-433-3p mimic轉染成功，見圖1B。

Figure 1. The transfection efficiency of miR-433-3p mimic in HGC-27 and AGS cells. A： the expression of miR-433-3p in different gastric cancer cell lines； B： the expression of miR-433-3p in HGC-27 and AGS cells after miR-433-3p mimic transfection.Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs GES-1 group； ##P<0.01 vs NC mimic group.圖1 miR-433-3p mimic在胃癌細胞系HGC-27和AGS中的轉染效率

2 過表達miR-433-3p抑制胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移

與NC mimic組相比，miR-433-3p mimic組HGC-27和AGS細胞活力、集落形成數(shù)目、侵襲細胞數(shù)目和劃痕愈合率均顯著降低（P<0.05），見圖2~5。

Figure 2. Effect of miR-433-3p mimic on the viability of HGC-27 （A） and AGS （B） cells assessed by CCK-8 assay. Mean±SD. n=4.*P<0.05， **P<0.01 vs NC mimic group.圖2 CCK-8法檢測過表達miR-433-3p對胃癌細胞活力的影響

Figure 3. Effect of miR-433-3p mimic on the proliferation of HGC-27 and AGS cells assessed by colony formation assay. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs NC mimic group.圖3 集落形成實驗檢測過表達miR-433-3p對胃癌細胞增殖的影響

Figure 4. Effect of miR-433-3p mimic on the invasive ability of HGC-27 （A） and AGS （B） cells detected by Transwell assay（scale bar=100 μm）. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs NC mimic group.圖4 Transwell法檢測過表達miR-433-3p對胃癌細胞侵襲能力的影響

Figure 5. Effect of miR-433-3p mimic on the migratory ability of HGC-27 （A） and AGS （B） cells assessed by wound-healing assay（scale bar=200 μm）. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs NC mimic group.圖5 劃痕愈合實驗檢測過表達miR-433-3p對胃癌細胞遷移的影響

3 通過雙螢光素酶報告基因實驗驗證miR-433-3p的潛在靶點

TargetScan預測顯示，miR-433-3p的靶基因可能為HP1BP3，見圖6A。雙螢光素酶報告基因實驗結果顯示，在轉染克隆有HP1BP3基因3′UTR質粒的胃癌細胞中，miR-433-3p mimic組螢火蟲螢光素酶/海腎螢光素酶活性比顯著低于NC mimic組（P<0.05），說明miR-433-3p mimic能阻礙其與HP1BP3基因3′UTR結合降低其螢光活性改變；而在轉染克隆有突變HP1BP3基因3′UTR質粒的胃癌細胞中，miR-433-3p mimic組螢火蟲螢光素酶/海腎螢光素酶活性比與NC mimic組相比無顯著差異（P>0.05），說明miR-433-3p不能通過結合突變的HP1BP3基因3′UTR而影響螢光素酶活性，見圖6B、C。

Figure 6. Dual-luciferase reporter assay was performed to validate the relationship between miR-433-3p and HP1BP3. A： predicted HP1BP3 3′UTR binding site for miR-433-3p； B and C： relative luciferase activity in miR-433-3p mimic-transfected HGC-27 （B） and AGS （C） cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs NC mimic group.圖6 雙螢光素酶報告基因實驗檢測miR-433-3p與靶基因HP1BP3的相互關系

4 HP1BP3在胃癌組織中高表達

20例胃癌樣本及癌旁組織的免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，HP1BP3在17例胃癌樣本中高表達，我們從中隨機各選取3例進行比較分析，見圖7。

Figure 7. The expression of HP1BP3 in gastric cancer and adjacent tissues （scale bar=100 or 50 μm）.圖7 HP1BP3在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達

HP1BP3表達在不同性別和年齡分組中差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），在不同腫瘤大小和病理分級分組中差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

表1 不同臨床病理特征的胃癌組織中HP1BP3的表達Table 1. The expression of HP1BP3 in gastric cancer tissues with different clinicopathological features

5 胃癌及其癌旁組織HE染色

胃癌組織中腺體形態(tài)受到破壞，細胞核異常增大，細胞形態(tài)呈現(xiàn)腫瘤形態(tài)；癌旁組織中腺體形態(tài)未受破壞，細胞核正常，細胞形態(tài)正常，見圖8。

Figure 8. HE staining of gastric cancer and adjacent tissues （scale bar=50 or 100 μm）.圖8 胃癌及其癌旁組織HE染色

6 過表達miR-433-3p和敲減HP1BP3能下調HP1BP3蛋白表達

與NC mimic組相比，miR-433-3p mimic組HGC-27和AGS細胞HP1BP3蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）；與si-NC組相比，si-HP1BP3組HGC-27和AGS細胞HP1BP3蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），見圖9、10。

Figure 9. The protein expression of HP1BP3 in HGC-27 （A）and AGS（B） cells after miR-433-3p mimic transfection was detected by Western blot. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs NC mimic group.圖9 Western blot檢測miR-433-3p mimic轉染后HGC-27和AGS細胞中HP1BP3蛋白表達

Figure 10. The protein expression of HP1BP3 in HGC-27 （A）and AGS （B） cells after si-HP1BP3 transfection was detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05，**P<0.01 vs si-NC group.圖10 Western blot檢測si-HP1BP3轉染后AGS和HGC-27細胞中HP1BP3蛋白表達

7 rescue實驗驗證miR-433-3p對HP1BP3表達的調控作用

為了進一步研究在胃癌進展中miR-433-3p調節(jié)HP1BP3的表達，我們在胃癌細胞中進行了過表達HP1BP3的rescue實驗。如圖11所示，過表達HP1BP3在一定程度上恢復了miR-433-3p過表達（miR-433-3p mimic）所導致的HP1BP3表達降低。這證明了miR-433-3p介導了HP1BP3對胃癌細胞的調控作用。

Figure 11. Rescue experiment of HP1BP3 regulated by miR-433-3p. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs NC mimic group； ##P<0.01 vs miR-433-3p mimic group.圖11 miR-433-3p調控HP1BP3的rescue實驗

8 敲減HP1BP3抑制胃癌細胞的活力和遷移能力

與si-NC組相比，si-HP1BP3組HGC-27和AGS細胞活力和劃痕愈合率均顯著降低（P<0.01），見圖12、13。

Figure 12. Effect of si-HP1BP3 on the viability of HGC-27 （A） and AGS （B） cells assessed by CCK-8 assay. Mean±SD. n=4. *P<0.01 vs si-NC group.圖12 CCK-8法檢測si-HP1BP3對HGC-27和AGS細胞活力的影響

Figure 13. Effect of si-HP1BP3 on the migratory ability of HGC-27 （A） and AGS （B） cells assessed by wound-healing assay （scale bar=200 μm）. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs si-NC group.圖13 劃痕愈合實驗檢測si-HP1BP3對胃癌細胞遷移能力的影響

討論

最新的GLOBOCAN 2020統(tǒng)計研究發(fā)現(xiàn)，全球的胃癌發(fā)病率和死亡率在近幾年有所下降，從癌癥第二大常見疾病降為第五，癌癥第二大死亡原因降為第四［3］。胃癌的發(fā)病率與地區(qū)、年齡、性別、社會經(jīng)濟地位和幽門螺桿菌等因素有明顯相關［2］。特別是在社會經(jīng)濟地位和地區(qū)分布上，發(fā)展中國家對比發(fā)達國家發(fā)病率更高，85%的胃癌發(fā)生在發(fā)展中國家，超過60%的病例在東亞和東南亞［2］。胃癌患者的死亡率與其疾病的分期密切相關，早期胃癌無明顯特異性癥狀，大部分患者發(fā)現(xiàn)罹患癌癥時已是胃癌晚期［10］。因此，尋找新的、有效的早期胃癌診斷生物標志物或是診斷手段對降低胃癌死亡率和提高患者生存質量是至關重要的。

眾所周知，miRNA參與轉錄后基因表達調控，具有多種重要的調節(jié)作用［11］。隨著更多深入的研究，我們發(fā)現(xiàn)不同腫瘤中miRNA表達譜的改變，將會對腫瘤的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生不同的影響［12］。前期的研究發(fā)現(xiàn)，miR-433-3p通過不同的調控機制在食管癌、胃癌和結直腸癌中發(fā)揮著抑制腫瘤惡性行為的重要作用：miR-433-3p通過靶向GRB2抑制食管鱗狀細胞癌的增殖和侵襲［13］；沉默POU2F1可促進miR-433-3p表達進而抑制胃癌細胞的增殖和遷移［14］；miR-433-3p靶向調控RAP1A而抑制結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲［15］。另外，Zhang等［16］的研究表明，miR-433-3p通過下調AJUBA的表達來調節(jié)膠質瘤的生物學功能。本研究選擇miR-433-3p作為研究對象，探究其對胃癌細胞功能的調控作用。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-433-3p在多種胃癌細胞株中表達下調，過表達miR-433-3p后胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲明顯受到抑制，與已報道的研究結果相符合。進一步實驗表明，在胃癌中miR-433-3p與HP1BP3呈負相關，rescue實驗也顯示，過表達HP1BP3可逆轉miR-433-3p導致的HP1BP3表達降低，證明了miR-433-3p可介導HP1BP3對胃癌細胞的調控作用。

HP1BP3是一種普遍存在的核蛋白，它的基因位于染色體1p36上，在進化和結構上與組蛋白H1家族相關，因此HP1BP3與H1組蛋白作用相似，與許多核蛋白協(xié)同作用維持染色質的動態(tài)結構，是細胞生長所必需的重要條件［8］。HP1BP3還與腫瘤的發(fā)生有關。研究證明該蛋白在缺氧時介導染色質凝聚，這種效應增加了腫瘤細胞的活力［17］。此外，有研究表明在食管鱗狀細胞癌中HP1BP3表達增加，敲減HP1BP3可以抑制食管癌細胞的生長和轉移［18］。在對膠質母細胞瘤的最新研究中，過表達HP1BP3能夠促進膠質母細胞瘤細胞的增殖［19］。這些報道給我們提供了HP1BP3是否對胃癌細胞功能有影響的思路。為了驗證HP1BP3對胃癌細胞的調控作用，我們通過敲減HP1BP3基因以驗證其對胃癌細胞生物學行為的影響。結果表明，在胃癌細胞中敲減HP1BP3基因可抑制細胞的活力和遷移。

綜上所述，過表達miR-433-3p抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲，miR-433-3p通過靶向調控HP1BP3進而抑制胃癌細胞的生長。