文 鈞 熊東煒 龍 淼

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院,重要家畜疫病研究教育部重點實驗室,沈陽 110161)

玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)是由Stob等[1]從玉米中發(fā)現(xiàn)的一種由鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。ZEA作為一種常見的飼料及糧食污染物,不僅會給畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失,還會通過農(nóng)產(chǎn)品對人體健康造成極大危害。因此,對ZEA污染的飼料和糧食進行脫毒非常重要。

脫毒的方法一般包括物理脫毒法、化學(xué)脫毒法和生物脫毒法,其中生物脫毒法包括微生物吸附、微生物降解和酶降解,該方法有效規(guī)避了物理脫毒法和化學(xué)脫毒法的缺點,并因其高效、穩(wěn)定、安全環(huán)保和對食品品質(zhì)影響小的特點,已成為目前公認(rèn)的最優(yōu)脫毒法。研究表明,有些微生物細(xì)胞壁中的特殊結(jié)構(gòu)和物質(zhì)使它們能夠吸附ZEA,例如其中的碳水化合物(肽聚糖、甘露糖和葡聚糖)、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等,同時由于它們可能存在各種不同的吸附中心,因此可能涉及到各種吸附機制,包括氫鍵、離子相互作用或疏水相互作用[2]。微生物降解是指微生物在其生命活動的過程中產(chǎn)生某種產(chǎn)物,這些物質(zhì)會改變ZEA的原始結(jié)構(gòu),并將其轉(zhuǎn)化為低毒或完全無毒的物質(zhì)[3]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多可以脫去ZEA的真菌和細(xì)菌,包括黑曲霉[4]、酵母菌[5]、芽孢桿菌、乳酸菌[6]和不動桿菌[7]等。此外,酶對ZEA的降解具有出色的特異性和較高的安全性,它的反應(yīng)溫和可控,效率比菌體吸附高,是未來ZEA脫毒應(yīng)用中最具商業(yè)價值和最有效的技術(shù)手段。不過,對ZEA的酶促降解研究仍處于初級階段,在發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化新降解酶方面仍然有很長的路要走[8]。

因此,本研究的主要目的是分離出一株可高效降解ZEA的菌株,通過對其生長特性和降解條件進行優(yōu)化,初步分離鑒定降解酶,并探究該菌株降解毒素的可能反應(yīng),為后續(xù)純化ZEA降解酶并應(yīng)用于生產(chǎn)實踐奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株來源

本試驗菌株選擇來自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院臨床獸醫(yī)實驗室-80 ℃保存的25株菌,代號分別如下:A-1、A3、A10、B2、B4、B-7、B8、C-2、C253、C257、D-1、F6、FC、WY19、XY15、XY19、XY32、XY96、XY125、XY126、XY129、XY130、XY132、XY133和XY137。

1.2 試驗材料與試驗設(shè)備

試驗試劑:ZEA,武漢瀚香生物科技有限公司提供;甲醇(分析純),上海麥克林生化科技股份有限公司提供;LB肉湯、LB固體培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基、BHI培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒、磷酸鹽緩沖液(PBS)干粉,北京索萊寶科技有限公司提供;TaKaRa Mini BEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver 3.0,寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司提供;2×Accurate Taq Master Mix(Dye Plus),湖南艾科瑞生物工程有限公司提供;聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)快速制備試劑盒(12.5%),上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司提供。

試驗儀器:LDZX-75KBS型高壓蒸汽滅菌鍋,SorvallTMLegendTMMicro 21R微量離心機,UltiMate 3000快速分離雙系統(tǒng)液相色譜儀,ZORBAX SB-C18色譜柱,HZQ-B恒溫培養(yǎng)搖床,Mini-PROTEAN?Tetra Biorad伯樂電泳儀,ChemiDOCXRS凝膠成像儀。

1.3 試驗方法

1.3.1 ZEA降解菌株的篩選

將25種待測菌接種到LB肉湯中進行復(fù)蘇培養(yǎng)。將復(fù)蘇好的菌株加入含有ZEA的LB肉湯中,ZEA終濃度為5 μg/mL,進行菌株-ZEA共培養(yǎng)試驗。樣品在37 ℃、160 r/min的恒溫?fù)u床中孵育96 h,每組重復(fù)3次。樣品中的ZEA殘留量通過高效液相色譜(HPLC)法進行檢測[9],色譜柱為ZORBAX SB-C18,流動相為80%甲醇,流速為1.0 mL/min,進樣量20 μg/mL,柱溫為30 ℃,波長為274 nm[3]。計算ZEA降解率,公式如下:

ZEA降解率=100×(對照樣品ZEA濃度-
共培養(yǎng)樣品ZEA濃度)/
對照樣品ZEA濃度。

1.3.2 降解菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定:將復(fù)蘇好的降解菌菌液稀釋106倍,取50 μL均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基中,在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h,觀察菌落形態(tài);挑取培養(yǎng)好的單菌落進行革蘭氏染色。

16S rDNA鑒定:使用DNA提取試劑盒提取降解菌株的DNA;降解菌株DNA擴增選用16S rDNA通用引物進行,上游引物為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′),下游引物為1492R(5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′);反應(yīng)體系為模版DNA 2.0 μL、27F 1.0 μL、1492R 1.0 μL、Taq Master Mix 25 μL以及ddH2O 21 μL;擴增程序為94 ℃預(yù)變性30 s,98 ℃變性10 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,循環(huán)34次,72 ℃終延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳120 V、40 min進行驗證,將陽性條帶的PCR樣品送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序,測序的結(jié)果在美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)上進行序列比對,并利用MEGA-X構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進行分析。

1.3.3 蔬菜芽孢桿菌(Bacillusoleronius)GX01培養(yǎng)條件優(yōu)化

培養(yǎng)基條件優(yōu)化:將復(fù)蘇好的蔬菜芽孢桿菌GX01按1%接菌量分別接種至裝有20 mL LB肉湯、20 mL MRS培養(yǎng)基、20 mL NB培養(yǎng)基和20 mL BHI培養(yǎng)基的50 mL錐形瓶中,在pH 7.0、37 ℃條件下160 r/min培養(yǎng)12 h。

生長曲線:將復(fù)蘇好的蔬菜芽孢桿菌GX01按1%接菌量接種至裝有20 mL LB肉湯的50 mL錐形瓶中,在pH 7.0、37 ℃條件下160 r/min培養(yǎng)45 h,分別在0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42和45 h取菌液樣品。

pH:將復(fù)蘇好的蔬菜芽孢桿菌GX01按1%接菌量接種至裝有20 mL LB肉湯的50 mL錐形瓶中,將培養(yǎng)基的pH分別調(diào)整為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0,并在37 ℃條件下160 r/min培養(yǎng)12 h。

溫度:將復(fù)蘇好的蔬菜芽孢桿菌GX01按1%接菌量接種至裝有20 mL LB肉湯的50 mL錐形瓶中,將恒溫培養(yǎng)箱的溫度分別調(diào)整為25、30、37、40和45 ℃,并在pH 7.0條件下160 r/min培養(yǎng)12 h。

取上述菌液200 μL至96孔板中,通過酶標(biāo)儀測定菌液的吸光度(OD)值,并進行記錄。

1.3.4 蔬菜芽孢桿菌GX01降解ZEA條件優(yōu)化

將復(fù)蘇好的蔬菜芽孢桿菌GX01以1%接菌量接入250 mL LB肉湯中,在160 r/min、37 ℃下培養(yǎng)72 h。將ZEA加入活化菌液中,ZEA終濃度為5 μg/mL。

降解時間優(yōu)化:上述樣品用渦旋振蕩器混合后放入37 ℃、160 r/min恒溫?fù)u床中,共同孵育24、48、72和96 h。

降解溫度優(yōu)化:上述樣品用渦旋振蕩器混合后放入160 r/min恒溫?fù)u床中,共同孵育72 h,恒溫?fù)u床溫度分別設(shè)置為25、30、37、40和45 ℃。

降解pH優(yōu)化:上述樣品用渦旋振蕩器混合后放入37 ℃、160 r/min恒溫?fù)u床中,共同孵育72 h,pH分別設(shè)定為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0。

降解毒素濃度優(yōu)化:將ZEA加入活化菌液中,ZEA終濃度分別為5、10、15和20 μg/mL,后用渦旋振蕩器混合后放入37 ℃、160 r/min恒溫?fù)u床中,共同孵育72 h。

設(shè)立LB肉湯替代菌液的對照組,通過HPLC法檢測ZEA殘留量(峰面積),計算ZEA降解率,公式如下:

ZEA降解率=100×(對照樣品ZEA濃度-
孵育樣品ZEA濃度)/對照樣品ZEA濃度。

1.3.5 蔬菜芽孢桿菌GX01降解ZEA活性物質(zhì)定位

將活化好的蔬菜芽孢桿菌GX01菌液在8 000 r/min下離心10 min,上清液用0.22 μm針式濾器過濾后,取一部分備用,另一部分放入水浴鍋100 ℃ 15 min備用。沉淀菌體用PBS沖洗后,取一部分菌體進行破碎,8 000 r/min離心10 min,破碎菌體上清液用0.22 μm針式濾器過濾,破碎菌體用PBS沖洗,另一部分放入高壓蒸汽滅菌鍋121 ℃ 30 min高壓后備用。上述樣品中加入ZEA(5 μg/mL)孵育72 h,檢測ZEA殘留量(峰面積),計算ZEA降解率。在上述試驗的基礎(chǔ)上,取降解率最高的部位添加十二烷基硫酸鈉(SDS)(終濃度1%)和蛋白酶K(1 mg/mL),并與ZEA(5 μg/mL)共同孵育72 h,檢測ZEA殘留量(峰面積),計算ZEA降解率。

1.3.6 粗酶液降解效果

將復(fù)蘇好的蔬菜芽孢桿菌GX01以1%接菌量接入3份含有250 mL LB肉湯的錐形瓶中,在160 r/min、37 ℃條件下培養(yǎng)72 h。采用硫酸銨(80%)沉淀法提取蔬菜芽孢桿菌GX01上清液中的粗酶液,透析和超濾后進行蛋白質(zhì)濃度檢測。將粗酶液與ZEA(5 μg/mL)共同孵育。此外,還對粗酶液進行100 ℃煮沸15 min和蛋白酶K(1 mg/mL)處理。上述樣品充分混勻后放入37 ℃、160 r/min的恒溫?fù)u床中孵育72 h。通過HPLC法檢測ZEA殘留量(峰面積),計算ZEA降解率。

1.3.7 金屬離子對粗酶液降解ZEA的影響

樣品中分別加入鈉離子(Na+)、亞鐵離子(Fe2+)、鐵離子(Fe3+)、銅離子(Cu2+)、鉀離子(K+)、錳離子(Mn2+)、鎂離子(Mg2+)、鈣離子(Ca2+)、鋅離子(Zn2+)和乙二胺四乙酸(EDTA),終濃度為100 mmol/L,充分混勻后放入37 ℃、160 r/min恒溫?fù)u床中,共同孵育72 h。通過HPLC法檢測ZEA殘留量(峰面積),計算ZEA降解率。

1.3.8 粗酶液液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)蛋白條帶檢測

取20 μL粗酶液點入膠板的凹槽中,將電泳儀設(shè)定為80 V 60 min、120 V 60 min。電泳結(jié)束后通過考馬斯亮藍(lán)染色與脫色顯示蛋白條帶,并將全蛋白條帶切下裝入含有ddH2O的EP管中,委托深圳華大基因科技有限公司進行LC-MS/MS氨基酸測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZEA降解菌株的篩選

如圖1所示,在25種菌株中,B4、F6和XY133對ZEA的脫毒效果較好,其中F6脫毒效果最優(yōu),ZEA降解率為75.9%(圖1-A),因此,后續(xù)試驗選擇降解率最高的F6進行研究。HPLC法檢測的結(jié)果表明,對照組中ZEA的檢測峰出現(xiàn)在5.21 min(圖1-B);而在相同的出峰時間內(nèi),F6共培養(yǎng)組ZEA的檢測峰面積明顯減小(圖1-C)。以上結(jié)果證明F6對ZEA具有良好的降解作用。

A:25種菌株對ZEA的降解率;B:對照組高效液相色譜圖;C:F6共培養(yǎng)組高效液相色譜圖。A: degradation rates of ZEA by 25 strains; B: HPLC chromatogram of control group; C: HPLC chromatogram of the F6 co-culture group.圖1 降解菌株篩選Fig.1 Degradative strain screening

2.2 降解菌株的鑒定

如圖2所示,F6菌株在LB固體培養(yǎng)基上為乳白色圓形菌落,邊緣整齊,表面光滑,菌落中心有圓形凸起,不透明(圖2-A)。顯微鏡下革蘭氏染色為陽性菌,菌體成桿狀,排列不規(guī)則(圖2-B)。序列系統(tǒng)發(fā)育進化分析發(fā)現(xiàn),F6與蔬菜芽孢桿菌55N3-2、30N2-10、PD3、C13DMVR和PCSB2菌株屬于同一分支(圖2-C),序列同源性最高,且與蔬菜芽孢桿菌GX01(GenBank登錄號為KP297896.1)的16S rDNA相似度為99.86%。綜上結(jié)果確定,該菌株為實驗室前期分離的蔬菜芽孢桿菌GX01。

A:F6菌落形態(tài)(48 h);B:F6細(xì)菌革蘭氏染色(10×100);C:F6序列系統(tǒng)發(fā)育進化樹。A: F6 colony morphology (48 h); B: F6 bacterial gram stain (10×100); C: F6 sequence phylogenetic evolutionary tree.Bacillus oleronius strain:蔬菜芽孢桿菌株;Bacterium strain:細(xì)菌株;Uncultured bacterium clone:未培養(yǎng)菌克隆;Bacillus oleronius:蔬菜芽孢桿菌。圖2 F6菌株鑒定Fig.2 F6 strain identification

2.3 蔬菜芽孢桿菌GX01培養(yǎng)條件優(yōu)化

如圖3所示,蔬菜芽孢桿菌GX01的對數(shù)生長期為3～12 h(圖3-A);其在LB肉湯中的OD值最高(圖3-B),說明LB肉湯是蔬菜芽孢桿菌GX01的最適培養(yǎng)基,后續(xù)試驗均選擇LB肉湯為研究培養(yǎng)基。當(dāng)pH為3.0～5.0時,蔬菜芽孢桿菌GX01沒有生長;當(dāng)pH為6.0～9.0時,蔬菜芽孢桿菌GX01生長良好;當(dāng)pH為10.0時,蔬菜芽孢桿菌GX01沒有生長繁殖;其中,當(dāng)pH為9.0時,OD值最高,說明pH 9.0是蔬菜芽孢桿菌GX01的最適生長pH(圖3-C)。當(dāng)溫度為25、30和37 ℃時,OD值穩(wěn)步上漲,蔬菜芽孢桿菌GX01生長繁殖能力逐漸增強;當(dāng)溫度為40和45 ℃時,OD值明顯下降,菌株生長受到抑制;當(dāng)溫度為37 ℃時,OD值最高,說明37 ℃為蔬菜芽孢桿菌GX01的最適生長溫度(圖3-D)。

A:蔬菜芽孢桿菌GX01生長曲線;B:培養(yǎng)基優(yōu)化;C:pH優(yōu)化;D:溫度優(yōu)化。A: Bacillus oleronius GX01 growth curve; B: medium optimization; C: pH optimization; D: temperature optimization.圖3 蔬菜芽孢桿菌GX01培養(yǎng)條件優(yōu)化Fig.3 Optimization of culture conditions for Bacillus oleronius GX01

2.4 蔬菜芽孢桿菌GX01降解ZEA條件優(yōu)化

如圖4所示,蔬菜芽孢桿菌GX01在48 h時,ZEA降解率為85.39%;在48 h后,ZEA降解率上升趨勢趨于平緩;在96 h時,ZEA降解率為91.07%(圖4-A)。當(dāng)溫度為25～45 ℃時,蔬菜芽孢桿菌GX01對ZEA的降解率處于先升高后降低的變化趨勢,最適溫度為37 ℃,ZEA降解率為83.32%;其次為40 ℃,在此溫度下的ZEA降解率為83.01%。由此可知,當(dāng)溫度為37～40 ℃時,蔬菜芽孢桿菌GX01產(chǎn)生的降解ZEA的物質(zhì)活性較高(圖4-B)。當(dāng)pH為4.0～10.0時,ZEA降解率呈先升高后降低的趨勢;當(dāng)pH為9.0時ZEA降解率達(dá)到最高,為84.28%。由此可見,降解ZEA的活性物質(zhì)在強酸和強堿條件下活性明顯降低,在弱酸和中性條件下活性良好,在弱堿環(huán)境下活性最高,降解率最高(圖4-C)。當(dāng)毒素濃度為5～20 μg/mL時,ZEA降解率呈緩慢下降趨勢;當(dāng)毒素濃度為5 μg/mL時,ZEA降解效果最優(yōu),降解率為82.30%;當(dāng)毒素濃度為20 μg/mL時,蔬菜芽孢桿菌GX01依然有很強的降解ZEA的能力,ZEA降解率為71.47%(圖4-D)。

A:時間優(yōu)化;B:溫度優(yōu)化;C:pH優(yōu)化;D:毒素濃度。A: time optimization; B: temperature optimization; C: pH optimization; D: toxin concentration.圖4 蔬菜芽孢桿菌GX01降解ZEA條件優(yōu)化Fig.4 Optimization of ZEA degradation conditions by Bacillus oleronius GX01

2.5 蔬菜芽孢桿菌GX01降解ZEA活性物質(zhì)定位

如圖5所示,蔬菜芽孢桿菌GX01上清液降解ZEA的效果最佳,ZEA降解率為87.53%;其次為破碎菌體上清液,ZEA降解率為50.70%;活菌體、滅活菌體和破碎菌體沉淀的ZEA降解率分別為31.47%、35.79%和35.13%;此外,上清液煮沸15 min后的ZEA降解率為42.54%,這說明活性物質(zhì)隨著溫度的升高而降低(圖5-A)。在上清液中單獨添加SDS和蛋白酶K,ZEA降解率均有下降,分別為53.51%和58.69%,而SDS和蛋白酶K一同添加,ZEA降解率下降為10.09%;由此推斷,蔬菜芽孢桿菌GX01對ZEA的降解活性物質(zhì)為胞外降解酶(圖5-B)。

A:蔬菜芽孢桿菌GX01不同組分對ZEA降解率的影響;B:SDS與蛋白酶K對蔬菜芽孢桿菌GX01上清液降解ZEA的影響。A: effects of different components of Bacillus oleronius GX01 on degradation rates of ZEA; B: effects of SDS and protease K on ZEA degradation in Bacillus oleronius GX01 supernatant.圖5 蔬菜芽孢桿菌GX01降解ZEA活性物質(zhì)定位Fig.5 Localization of ZEA active substances degraded by Bacillus oleronius GX01

2.6 粗酶液降解效果

如圖6所示,通過二喹啉甲酸(BCA)蛋白質(zhì)濃度檢測試劑盒得出,后續(xù)試驗粗酶液蛋白質(zhì)濃度為2.60 mg/mL,且2.60 mg/mL的粗酶液在72 h時可降解48.76%的ZEA(5 μg/mL)。在粗酶液經(jīng)過高溫處理后,ZEA降解率降低到13.16%;而經(jīng)過蛋白酶K處理后,ZEA降解率降低到22.17%,這進一步說明了降解ZEA的物質(zhì)為胞外酶。

圖6 高溫和蛋白酶K對降解酶降解ZEA的影響Fig.6 Effects of high temperature and proteinase K on ZEA degradation by degradative enzymes

2.7 金屬離子對粗酶液降解ZEA效果的影響

如圖7所示,與其他金屬離子相比,Fe2+和Mn2+對粗酶液的ZEA降解率影響不明顯;Fe3+和Cu2+輕微抑制了粗酶液的ZEA降解率,分別下降了9.92和7.10個百分點;Ca2+和Zn2+嚴(yán)重抑制了粗酶液對ZEA的降解能力,ZEA降解率分別下降了18.11和17.49個百分點;Na+、K+和Mg2+促進了粗酶液對ZEA的降解,ZEA降解率分別上升了20.12、6.31和10.67個百分點。此外,EDTA的引入也會影響粗酶液對ZEA的降解效果,ZEA降解率下降了24.94個百分點。EDTA是一種金屬螯合劑,當(dāng)引入EDTA時,體系溶液中的金屬離子減少。由此可見,蔬菜芽孢桿菌GX01中的降解酶對金屬離子較為敏感,并且會因為金屬離子的減少導(dǎo)致降解活性降低。

圖7 金屬離子對粗酶液降解ZEA效果的影響Fig.7 Effects of metal ions on ZEA degradation in crude enzyme solution

2.8 LC-MS/MS檢測結(jié)果及降解酶分析

膠條切下后,進行LC-MS/MS檢測,檢測總離子流色譜圖見圖8。蛋白粗提物測序后,根據(jù)數(shù)據(jù)庫進行比對,選擇可能性高的蛋白進行信息羅列和基因本體(GO)分析,結(jié)果如表1所示,結(jié)果顯示,降解酶以水解酶和脫羧酶為主,還包括一些硫酯酶。

表1 降解酶分析結(jié)果Table 1 Analysis results of degradative enzymes

圖8 LC-MS/MS檢測降解酶的總離子流色譜圖Fig.8 Total ion chromatograms of degradative enzymes by LC-MS/MS detection

3 討 論

ZEA作為一種常見的飼料及糧食污染物,不僅會給畜牧業(yè)帶來巨大損失,還會通過蓄積對人體健康造成極大危害。因此,對污染的飼料和糧食進行脫毒的研究已經(jīng)變成國內(nèi)外熱門趨勢。芽孢桿菌擁有厚而含水量低的多層結(jié)構(gòu),具有優(yōu)秀的穩(wěn)定性。在對ZEA脫毒的研究中,已被證實可脫毒的芽孢桿菌有枯草芽孢桿菌[10-11]、地衣芽孢桿菌[12-13]、貝萊斯芽孢桿菌[3,14]和解淀粉芽孢桿菌[15-16]等。吳宗芮等[17]從霉變的土壤和飼料中發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌G-6對ZEA(1 μg/mL)的降解率最高為81.19%。Lee等[15]在發(fā)霉的玉米樣品中分離出解淀粉芽孢桿菌LN,并通過試驗證明,解淀粉芽孢桿菌LN可以作為一種飼料添加劑來降低飼料中ZEA的濃度。耿海榮等[18]在酸性、高溫的溫泉環(huán)境下篩選出枯草芽孢桿菌Y-33,該菌對2 μg/mL的ZEA的降解率高達(dá)93.79%。段錦等[19]分離發(fā)霉飼料和動物糞便等樣品中的菌株,篩選出解淀粉芽孢桿菌NA-J21和枯草芽孢桿菌MLS-H32,對ZEA均有一定降解效果。Hsu等[12]發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌CK1具有益生菌的特性,并且可以去除ZEA,其在開發(fā)去除ZEA的飼料添加劑方面具有很大的潛力。鄧鳳如等[20]從微生態(tài)制劑中篩選出能高效降解ZEA的菌株,鑒定為貝萊斯芽孢桿菌PA26-7。本試驗通過菌株-ZEA(5 μg/mL)共培養(yǎng)的方法篩選出了1株ZEA降解率為75.9%的菌株F6,通過16S rDNA鑒定其為蔬菜芽孢桿菌GX01。此外,本試驗對該菌的生長條件和降解ZEA條件進行優(yōu)化,在48 h時可降解85.39%的ZEA(5 μg/mL),其對數(shù)生長期為3～12 h,最適培養(yǎng)基為LB肉湯,最適培養(yǎng)和降解的溫度和pH分別為37 ℃和9.0。

為了確定蔬菜芽孢桿菌GX01對ZEA的脫毒方法,挖掘其降解酶,本試驗對蔬菜芽孢桿菌GX01降解ZEA的活性物質(zhì)進行定位。這種活性物質(zhì)定位的方法也被劉晨等[21]用過,該試驗發(fā)現(xiàn)菌株A.lwoffi.Haut.1的上清液、菌懸液和胞內(nèi)提取物對ZEA的降解率分別為82.31%、21.33%和6.67%,由此確定菌株活性物質(zhì)在上清液中。本試驗的菌液上清液對ZEA的降解效果最優(yōu),這表明菌體外的活性物質(zhì)起到主要的降解作用,同時這種活性物質(zhì)的活性會被高溫破壞從而降低降解率,證明了這種活性物質(zhì)的成分可能是胞外酶。為了進一步確認(rèn)活性物質(zhì)是酶的可能性,本試驗通過采用化學(xué)變性和生物變性的方法,分別向上清液中加入SDS和蛋白酶K,發(fā)現(xiàn)在上清液中單獨添加SDS或蛋白酶K降解率均有下降,而SDS和蛋白酶K一同添加,與對照組相比降解率降低了77.44個百分點。

微生物分泌的酶對真菌毒素的生物降解是減少其負(fù)面影響的一種有吸引力的方法。降解酶通過改變ZEA的結(jié)構(gòu),降低或去除ZEA的毒性。ZEA及其衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與天然雌激素相似,因此表現(xiàn)出雌激素活性。ZEA內(nèi)酯環(huán)中的酯基容易被酯酶或酸堿水解,然后開環(huán),從而改變ZEA現(xiàn)有的內(nèi)酯結(jié)構(gòu),使其不再具有雌激素作用[22]。內(nèi)脂水解酶ZHD101是一種由Takahashi-Ando等[23]發(fā)現(xiàn)的ZEA乳酸水解酶,這種酶破壞了ZEA結(jié)構(gòu)中的內(nèi)酯鍵,將其環(huán)形結(jié)構(gòu)打開變成直鏈結(jié)構(gòu),最后進行脫羧反應(yīng)[24-25]。本試驗對上清液中的粗酶液進行提取,并通過LC-MS/MS檢測,篩選和鑒定出了一些水解酶和脫羧酶。筆者推測,這些水解酶可以對大環(huán)內(nèi)酯環(huán)進行水解,并通過脫羧酶進行脫羧,最后產(chǎn)生低毒或無毒的產(chǎn)物。硫酯酶存在于所有活細(xì)胞中,通過催化存在于各種細(xì)胞底物中的硫酯鍵的裂解來執(zhí)行廣泛的重要生物學(xué)功能[26]。已有研究表明,在解淀粉芽孢桿菌H6中篩選出了一種硫酯酶,這種硫酯酶可以裂解ZEA的內(nèi)酯鍵,破壞大環(huán)內(nèi)酯,從而起到降解ZEA的作用[16]。在本試驗中,同樣也篩選出了一種硫酯酶,這可能是ZEA降解的關(guān)鍵酶。

4 結(jié) 論

本研究篩選出的蔬菜芽孢桿菌GX01是一株新的ZEA降解菌,其在48 h時可降解85.39%的ZEA,該菌的胞外酶是降解ZEA的關(guān)鍵;根據(jù)LC-MS/MS檢測結(jié)果,推測蔬菜芽孢桿菌GX01降解ZEA的關(guān)鍵酶為水解酶、脫羧酶和硫酯酶。