張男吉 邵鵬程 楊興澤 林 波 鄒彩霞

(廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,南寧 530005)

青貯是一種利用微生物發(fā)酵青綠飼料,使其pH下降,從而長期保存青綠飼料的方法。由于廣西地區(qū)氣候濕熱,許多青貯微生物添加劑在南方高溫環(huán)境下使用時(shí),不能達(dá)到預(yù)期效果[1-2],所以適應(yīng)于南方濕熱環(huán)境的微生物添加劑亟待開發(fā)。Cao等[3]發(fā)現(xiàn),植物附生乳酸菌比商業(yè)乳酸菌在提高青貯品質(zhì)上有更好的效果;也有許多研究發(fā)現(xiàn),從西南地區(qū)植物表面篩選出的乳酸菌添加劑對(duì)青貯品質(zhì)有更好的改善效果[4-6]。而由新鮮牧草制備的乳酸菌發(fā)酵汁[7-8]和預(yù)發(fā)酵汁[9-10]作為添加劑接種于青貯時(shí),觀察到的結(jié)果不一致,這可能是由于微生物組成隨植物來源而異[11]。青貯發(fā)酵品質(zhì)很大程度上取決于附生微生物群落組成,不同作物的附生微生物有很大差異。Mogodiniyai等[12]對(duì)比了幾種廉價(jià)的滅菌方法,發(fā)現(xiàn)高溫干燥滅菌對(duì)原料的化學(xué)組成影響最小,并成功地重構(gòu)青貯,且發(fā)現(xiàn)青貯的發(fā)酵質(zhì)量主要與牧草來源有關(guān),有氧穩(wěn)定性受微生物的影響[13]。甘蔗尾葉和象草是廣西地區(qū)重要的青貯原料,甘蔗尾葉的青貯中通常發(fā)現(xiàn)有大量的乙醇[14],同時(shí)有大量的干物質(zhì)(DM)損失。象草青貯通常有較高的青貯品質(zhì),但也有報(bào)道發(fā)現(xiàn),象草青貯過程中有乳酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐宜岷投∷岬默F(xiàn)象,導(dǎo)致青貯品質(zhì)較差[15]。但謝華德等[16]研究發(fā)現(xiàn),甘蔗尾葉和象草的混合青貯品質(zhì)優(yōu)于單獨(dú)青貯。這說明這2種青綠飼料的附生微生物在對(duì)青貯品質(zhì)的影響上可能互補(bǔ)。因此,本試驗(yàn)采用滅菌后重構(gòu)青貯的方法,探究交換、組合甘蔗尾葉和象草的附生微生物對(duì)青綠飼料青貯品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性的影響,為專用微生物添加劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用甘蔗尾葉和象草均采自廣西大學(xué)實(shí)驗(yàn)田,采集時(shí)間為2021年1月12日,2種牧草采集后用機(jī)器切割成2～3 cm長度,備用。將備用的原料分成2份,一份進(jìn)行滅菌,另一份用于收集附生微生物。

1.2 附生微生物的收集

根據(jù)Mogodiniyai等[17]改良方法來收集植物表面的附生微生物,操作步驟如下:取每種青貯原料3.5 kg,按原料與林格氏液重量1∶9進(jìn)行浸泡,浸泡時(shí)間1 h,實(shí)驗(yàn)室振蕩器振蕩2 min。用3層紗布過濾懸浮液,過濾的紗布浸泡在無菌超純水中,置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。將過濾后的懸浮液進(jìn)行離心,15 000×g離心90 min。丟棄上層液體,將沉淀重新溶解于50 mL林格試液中。

1.3 滅菌材料制備

根據(jù)Mogodiniyai等[13]方法進(jìn)行青貯原料滅菌。操作步驟如下:取預(yù)先干燥好的青貯原料放入滅菌的錐形瓶中,每個(gè)錐形瓶約可放80 g,用錫箔紙對(duì)錐形瓶進(jìn)行封口(不密封),在烘箱中60 ℃干燥3 h,接著105 ℃干燥15 h。滅菌完成后,用錫箔紙立即將錐形瓶口密封,材料冷卻至室溫備用。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將滅菌后的甘蔗尾葉(S)和象草(E)分別接種甘蔗尾葉附生微生物(MS)、象草附生微生物(ME)以及兩者混合附生微生物(1∶1)(MES)進(jìn)行青貯。試驗(yàn)共6個(gè)處理,分別為E×ME、E×MS、E×MES、S×ME、S×MS和S×MES,每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。

將附生微生物懸浮液經(jīng)超純水稀釋后按比例添加到青貯滅菌原料中,使其DM含量達(dá)40% FM,在超凈臺(tái)混合均勻后,置于250 mL青貯瓶中青貯,每個(gè)罐子樣品重量約200 g(80 g滅菌材料+220 g材料表面收集的附生微生物),每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。用封口膜纏繞密封青貯瓶,避光放置于室內(nèi)100 d。開罐后,去除表層取樣,立即測定相應(yīng)指標(biāo),并進(jìn)行為期12 d的有氧穩(wěn)定性測定,采樣時(shí)間分別為2、4、6、8、10、12 d。各處理主要附生微生物數(shù)量如表1所示。

表1 各處理主要附生微生物數(shù)量Table 1 Main microorganisms number in each treatment lg(CFU/g FM)

1.5 測定指標(biāo)

測定滅菌前后及青貯后甘蔗尾葉和象草的常規(guī)養(yǎng)分和微生物數(shù)量,及青貯后和有氧暴露期間的發(fā)酵指標(biāo)。常規(guī)養(yǎng)分包括DM、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、酸性洗滌不溶氮(ADIN)、粗纖維(CF)、粗灰分(Ash)、粗蛋白質(zhì)(CP)、可溶性碳水化合物(WSC)含量及緩沖容量(BC);微生物計(jì)數(shù)包括乳酸菌(LAB)、酵母菌(yeast)、霉菌(mold)和大腸桿菌(ET)數(shù)量。發(fā)酵指標(biāo)包括pH及乳酸(LA)、氨態(tài)氮(NH3-N)、乙醇(ET)、乙酸(AA)、丙酸(PA)和丁酸(BA)含量。

1.6 測定方法

1.6.1 青貯品質(zhì)測定

青貯后各組樣品混勻,取樣20 g,加入180 mL林格氏液,攪拌30 min后用4層紗布過濾得浸提液,立即用pH計(jì)測定浸提液的pH。將浸提液收集至15 mL離心管,于-20 ℃冰箱冷凍保存,用于后續(xù)指標(biāo)測定。

將浸提液解凍、離心后,采用對(duì)羥基聯(lián)苯法測定浸提液中乳酸含量[18];用苯酚-次氯酸法測定氨態(tài)氮含量[19];用Erwin等[20]方法,使用氣相色譜儀測定揮發(fā)性脂肪酸和乙醇含量。

1.6.2 常規(guī)養(yǎng)分測定

取切碎后的新鮮甘蔗尾葉和象草和青貯結(jié)束后的青貯樣品約100 g,置于烘箱105 ℃烘干2 h后轉(zhuǎn)65 ℃烘48 h,取出放至室溫后稱重,計(jì)算得DM含量。CP和ADIN含量由全自動(dòng)凱氏定氮儀(Gerhardt)測定[21]。ADF、NDF及CF含量由半自動(dòng)纖維儀(ANKOM A200i)測定[22]。Ash含量由馬弗爐550 ℃灼燒2 h后稱重測定。WSC含量利用葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,采用蒽酮法比色測定[23]。緩沖容量根據(jù)Plane等[24]的方法測定。

1.6.3 有氧穩(wěn)定性測定

將青貯開封時(shí)樣品取50 g左右置于250 mL潔凈塑料罐中,不封口,不壓實(shí),罐口覆蓋2層紗布,每組21個(gè)重復(fù)。每2 d取樣1次,每次3個(gè)重復(fù)。每個(gè)重復(fù)取20 g樣品與滅菌后180 mL林格氏液混合,晃動(dòng)0.5 h后4層紗布過濾。浸提液用于測定pH及乳酸、氨態(tài)氮、揮發(fā)性脂肪酸、乙醇含量和青貯相關(guān)微生物數(shù)量。pH用于分析青貯有氧穩(wěn)定性,當(dāng)pH變化小于0.5個(gè)單位時(shí),青貯被認(rèn)為是穩(wěn)定的[25]。

1.6.4 微生物數(shù)量測定

將浸提液用滅菌純水按梯度從102稀釋至10-6,選取適當(dāng)含量菌液,取200 μL進(jìn)行涂布培養(yǎng)。乳酸菌選用MRS固體培養(yǎng)基(含納他霉素),酵母和霉菌選用馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(含氯霉素),大腸桿菌選用紫紅膽鹽培養(yǎng)基。乳酸菌于37 ℃培養(yǎng)48 h,酵母和霉菌于28 ℃培養(yǎng)48 h,大腸桿菌于31 ℃培養(yǎng)48 h。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2019整理數(shù)據(jù),微生物數(shù)量由微生物計(jì)數(shù)后進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換進(jìn)行計(jì)數(shù),使用SPSS 21.0的一般線性模型對(duì)原料和附生微生物進(jìn)行雙因素方差分析,其他數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫滅菌對(duì)青貯原料常規(guī)養(yǎng)分和微生物數(shù)量的影響

由表2可知,新鮮甘蔗尾葉的DM含量為33.23%,CP含量為5.09% DM,WSC含量為24.57% DM,緩沖容量為141.55 mE/kg DM,ADIN含量為2.16% DM,NDF、ADF含量分別為69.70% DM和35.14% DM,CF含量為33.18% DM,Ash含量為5.83% DM,乳酸菌、酵母菌、霉菌和大腸桿菌數(shù)量分別為7.75、6.75、4.05和6.89 lg(CFU/g FM)。高溫滅菌顯著降低了甘蔗尾葉的WSC含量(P<0.05),同時(shí)顯著增加了ADIN含量(P<0.05),對(duì)其他常規(guī)養(yǎng)分含量無顯著影響(P>0.05)。高溫滅菌后未培養(yǎng)出微生物群落。

表2 高溫滅菌對(duì)不同青貯原料常規(guī)養(yǎng)分和微生物數(shù)量的影響Table 2 Effects of high temperature sterilization on conventional nutrients and microorganisms number of different silage materials

象草的DM含量為21.15%,CP含量為7.14%DM,WSC含量為18.70%DM,緩沖容量為240.13 mE/kg DM,ADIN含量為3.07% DM,NDF、ADF含量分別為64.53% DM和37.45% DM,CF含量為36.84% DM,Ash含量為4.56% DM,乳酸菌、酵母菌、霉菌和大腸桿菌數(shù)量分別為6.54、6.47、5.00和5.44 lg(CFU/g FM),經(jīng)高溫滅菌后,ADIN含量顯著增加(P<0.05),WSC含量顯著減少(P<0.05),對(duì)其他常規(guī)養(yǎng)分含量無顯著影響(P>0.05)。高溫滅菌后未培養(yǎng)出微生物群落。

2.2 不同處理對(duì)青貯飼料常規(guī)養(yǎng)分的影響

由表3可知,青貯原料對(duì)青貯DM、NDF、ADF、CP和Ash含量有顯著影響(P<0.05),附生微生物對(duì)青貯DM、CF、Ash含量有顯著影響(P<0.05)。青貯原料與附生微生物的交互作用對(duì)青貯DM、NDF、CP、CF和Ash含量有顯著影響(P<0.05)。

表3 不同處理對(duì)青貯飼料常規(guī)養(yǎng)分的影響Table 3 Effects of different treatments on conventional nutrients of silage %

在以滅菌象草為原料的青貯中,象草和甘蔗尾葉混合附生微生物發(fā)酵顯著降低了DM和CP含量(P<0.05),同時(shí)也顯著增加了NDF含量(P<0.05)。象草附生微生物發(fā)酵的青貯有著更低的NDF、ADF和CF含量,同時(shí)有更高的WSC含量(P<0.05),甘蔗尾葉附生微生物發(fā)酵的青貯WSC含量最低。

在以滅菌甘蔗尾葉為原料的青貯中,甘蔗尾葉附生微生物發(fā)酵的青貯CF含量顯著高于象草附生微生物發(fā)酵的青貯和混合附生微生物發(fā)酵的青貯(P<0.05)。附生微生物對(duì)甘蔗尾葉為原料的青貯中其他常規(guī)養(yǎng)分含量無顯著影響(P>0.05)。

2.3 不同處理對(duì)青貯發(fā)酵指標(biāo)和微生物數(shù)量的影響

由表4可知,青貯原料對(duì)青貯的pH及乳酸、氨態(tài)氮、乙醇、乙酸、丙酸和丁酸含量均有顯著影響(P<0.05)。附生微生物對(duì)青貯的pH及乳酸、氨態(tài)氮、乙醇、乙酸、丙酸、和丁酸含量均有顯著影響(P<0.05)。青貯原料與附生微生物的交互作用對(duì)青貯的pH及乳酸、氨態(tài)氮、乙醇、乙酸、丙酸和丁酸含量也同樣有顯著影響(P<0.05)。

表4 不同處理對(duì)青貯發(fā)酵指標(biāo)的影響Table 4 Effects of different treatments on fermentation parameters of silage

在以滅菌象草為原料的青貯中,象草和甘蔗尾葉混合附生微生物發(fā)酵顯著增加了青貯的pH及乙醇、丙酸和丁酸含量(P<0.05),顯著降低了青貯的乳酸含量(P<0.05)。甘蔗尾葉附生微生物和混合附生微生物發(fā)酵的青貯的乙酸含量顯著高于象草附生微生物發(fā)酵的青貯(P<0.05)。

在以滅菌甘蔗尾葉為原料的青貯中,混合附生微生物發(fā)酵青貯的乳酸含量顯著高于其他2個(gè)處理發(fā)酵P<0.05);氨態(tài)氮和丁酸含量低于其他2個(gè)處理發(fā)酵,但差異不顯著(P>0.05)。象草附生微生物和混合附生微生物發(fā)酵青貯的乙醇含量顯著高于甘蔗尾葉附生微生物發(fā)酵的青貯(P<0.05),乙酸含量顯著低于甘蔗尾葉附生微生物發(fā)酵的青貯(P<0.05)。

象草附生微生物發(fā)酵時(shí),滅菌甘蔗尾葉青貯的pH及乳酸和丁酸含量顯著低于滅菌象草青貯(P<0.05);乙醇和乙酸含量顯著高于滅菌象草青貯(P<0.05)。甘蔗尾葉附生微生物發(fā)酵時(shí),滅菌甘蔗尾葉青貯的pH及乳酸和丁酸含量顯著低于滅菌象草青貯(P<0.05),乙醇和乙酸含量顯著高于滅菌象草青貯(P<0.05)?；旌细缴⑸锴噘A時(shí),滅菌甘蔗尾葉青貯的pH及氨態(tài)氮、丙酸和丁酸含量顯著低于滅菌象草青貯(P<0.05),乙醇和乙酸含量顯著高于滅菌象草青貯(P<0.05)。

由表5可知,青貯原料對(duì)乳酸菌、酵母菌和霉菌數(shù)量有顯著影響(P<0.05),附生微生物對(duì)青貯乳酸菌、酵母菌和霉菌數(shù)量有顯著影響(P<0.05),青貯原料與附生微生物的交互作用對(duì)青貯乳酸菌、酵母菌和霉菌數(shù)量有顯著影響(P<0.05)。

表5 不同處理對(duì)青貯微生物數(shù)量的影響Table 5 Effects of different treatments on microorganisms number of silage lg(CFU/g FM)

在以滅菌象草為原料的青貯中,象草和甘蔗尾葉混合附生微生物發(fā)酵顯著減少了青貯開封時(shí)乳酸菌和霉菌數(shù)量(P<0.05),甘蔗尾葉附生微生物發(fā)酵后青貯的乳酸菌和酵母菌數(shù)量顯著高于其他2個(gè)處理發(fā)酵(P<0.05)。

在以滅菌甘蔗尾葉為原料的青貯中,混合附生微生物發(fā)酵后的霉菌數(shù)量顯著高于其他2個(gè)處理發(fā)酵(P<0.05);乳酸菌數(shù)量增加,但差異不顯著(P>0.05)。象草附生微生物發(fā)酵后的酵母菌數(shù)量顯著高于其他2個(gè)處理(P<0.05),霉菌數(shù)量顯著低于其他2個(gè)處理(P<0.05)。

象草附生微生物發(fā)酵時(shí),滅菌象草青貯的乳酸菌數(shù)量顯著高于滅菌甘蔗尾葉青貯(P<0.05),酵母菌數(shù)量顯著低于滅菌甘蔗尾葉青貯(P<0.05),霉菌數(shù)量差異不顯著(P>0.05)。甘蔗尾葉附生微生物發(fā)酵時(shí),滅菌象草青貯的乳酸菌和酵母菌數(shù)量顯著高于滅菌甘蔗尾葉青貯(P<0.05),霉菌數(shù)量顯著低于滅菌甘蔗尾葉青貯(P<0.05)。混合附生微生物發(fā)酵時(shí),滅菌象草青貯的酵母菌數(shù)量顯著高于滅菌甘蔗尾葉青貯(P<0.05),霉菌數(shù)量顯著低于霉菌甘蔗尾葉青貯(P<0.05),乳酸菌數(shù)量差異不顯著(P>0.05)。

各組合青貯開封時(shí)的大腸桿菌數(shù)量均小于可檢數(shù)量[2.00 lg(CFU/g FM)]。

2.4 有氧暴露過程不同處理對(duì)青貯pH的影響

有氧暴露期間,各處理青貯的pH變化如圖1所示。在有氧暴露4 d內(nèi),各處理pH均較穩(wěn)定。E×MS和E×MES處理青貯在有氧暴露第12天時(shí),pH與青貯剛結(jié)束時(shí)的變化量超過0.5,其他處理青貯均在第6天時(shí)pH變化量超0.5,即有氧不穩(wěn)定[25],有氧不穩(wěn)定時(shí),pH增加迅速。

E表示滅菌象草原料,S表示滅菌甘蔗尾葉原料。ME表示象草附生微生物,MS表示甘蔗尾葉附生微生物,MES表示象草和甘蔗尾葉混合附生微生物(1∶1)。E stands for sterilized elephant grass material, S stands for sterilized Sugarcane tops material. ME represents epiphytes of elephant grass, MS represents epiphytes of Sugarcane tops, MES represents mixed epiphytes of elephant grass and Sugarcane tops (1∶1).圖1 有氧暴露期間青貯的pHFig.1 pH of silage during aerobic exposure

2.5 不同處理對(duì)有氧不穩(wěn)定時(shí)青貯發(fā)酵指標(biāo)和微生物數(shù)量的影響

由表6可知,有氧不穩(wěn)定時(shí),青貯原料對(duì)青貯的pH及乳酸、氨態(tài)氮、乙醇、乙酸、丙酸和丁酸含量均有顯著影響(P<0.05)。附生微生物對(duì)青貯的pH及乳酸、氨態(tài)氮、乙醇、乙酸、丙酸和丁酸含量均有顯著影響(P<0.05)。青貯原料與附生微生物的交互作用對(duì)青貯的pH及乳酸、氨態(tài)氮、乙醇、乙酸、丙酸和丁酸含量也同樣有顯著影響(P<0.05)。

表6 不同處理對(duì)有氧不穩(wěn)定時(shí)青貯發(fā)酵指標(biāo)的影響Table 6 Effects of different treatments on fermentation parameters of silage under aerobic instability

在以滅菌象草為原料的青貯中,甘蔗尾葉附生微生物和混合附生微生物發(fā)酵延長了有氧暴露穩(wěn)定時(shí)間,同時(shí)也顯著降低了乳酸含量(P<0.05)。在有氧不穩(wěn)定時(shí),甘蔗尾葉附生微生物發(fā)酵的青貯乙酸和丁酸含量顯著高于其他2個(gè)處理(P<0.05),乙醇含量顯著低于其他2個(gè)處理(P<0.05);混合附生微生物發(fā)酵的青貯丙酸含量顯著高于其他2個(gè)處理(P<0.05)。

在以滅菌甘蔗尾葉為原料的青貯中,有氧不穩(wěn)定時(shí),甘蔗尾葉附生微生物發(fā)酵的乳酸含量最低,但差異不顯著(P>0.05),氨態(tài)氮和乙醇含量顯著高于其他2個(gè)處理(P<0.05),混合附生微生物發(fā)酵的乙酸含量顯著低于其他2個(gè)處理(P<0.05)。

象草附生微生物發(fā)酵的青貯,在有氧不穩(wěn)定時(shí),滅菌象草青貯的乳酸、氨態(tài)氮、乙醇、乙酸含量顯著高于滅菌甘蔗尾葉青貯(P<0.05)。甘蔗尾葉附生微生物發(fā)酵的青貯,在有氧不穩(wěn)定時(shí),滅菌象草青貯的乳酸、乙酸和丁酸含量顯著高于滅菌甘蔗尾葉青貯(P<0.05),滅菌象草青貯的氨態(tài)氮和乙醇含量高于滅菌甘蔗尾葉青貯,但差異不顯著(P>0.05)。混合附生微生物發(fā)酵的青貯,在有氧不穩(wěn)定時(shí),滅菌象草青貯的乳酸、氨態(tài)氮、乙醇、乙酸、丙酸和丁酸含量顯著高于滅菌甘蔗尾葉青貯(P<0.05)。

由表7可知,青貯原料對(duì)乳酸菌、酵母菌、霉菌和腸桿菌數(shù)量有顯著影響(P<0.05),附生微生物對(duì)青貯乳酸菌、酵母菌和霉菌數(shù)量有顯著影響(P<0.05),青貯原料與附生微生物的交互作用對(duì)青貯酵母菌和霉菌數(shù)量有顯著影響(P<0.05)。

表7 不同處理對(duì)有氧不穩(wěn)定時(shí)青貯微生物數(shù)量的影響Table 7 Effects of different treatments on microorganisms number of silage under aerobic instability lg(CFU/g FM)

在以滅菌象草為原料的青貯中,有氧不穩(wěn)定時(shí),象草附生微生物發(fā)酵處理乳酸菌數(shù)量最少,顯著低于其他2個(gè)處理(P<0.05),霉菌數(shù)量最多,顯著高于其他2個(gè)處理(P<0.05)?；旌细缴⑸锇l(fā)酵處理酵母菌數(shù)量最多,顯著高于其他2個(gè)處理(P<0.05)。各處理間大腸桿菌數(shù)量無顯著差異(P>0.05)。

在以滅菌甘蔗尾葉為原料的青貯中,有氧不穩(wěn)定時(shí),象草附生微生物發(fā)酵處理霉菌數(shù)量顯著高于其他2個(gè)處理(P<0.05),混合附生微生物發(fā)酵處理的乳酸菌數(shù)量最多,酵母菌數(shù)量最少。各處理間大腸桿菌數(shù)量無顯著差異(P>0.05)。

象草附生微生物發(fā)酵的青貯,在有氧不穩(wěn)定時(shí),滅菌甘蔗尾葉青貯的酵母菌和霉菌數(shù)量顯著多于滅菌象草青貯(P<0.05)。甘蔗尾葉附生微生物發(fā)酵的青貯,在有氧不穩(wěn)定時(shí),滅菌甘蔗尾葉青貯的乳酸菌數(shù)量顯著低于滅菌象草青貯(P<0.05),酵母菌、霉菌和大腸桿菌數(shù)量顯著多于滅菌象草青貯(P<0.05)?；旌细缴⑸锇l(fā)酵的青貯,在有氧不穩(wěn)定時(shí),滅菌象草青貯的霉菌和大腸桿菌數(shù)量顯著低于其他2個(gè)處理(P<0.05),酵母菌數(shù)量顯著多于其他2個(gè)處理(P<0.05)。

3 討 論

3.1 高溫滅菌對(duì)青貯原料的影響

高溫滅菌對(duì)青貯原料有一定影響,主要表現(xiàn)在甘蔗尾葉和象草的的WSC和ADIN含量上,對(duì)其余常規(guī)養(yǎng)分含量無顯著影響。Mogodiniyai等[13]在探索廉價(jià)滅菌方法時(shí),也同樣發(fā)現(xiàn)高溫滅菌情況下,牧草的WSC含量有顯著降低,同時(shí)ADIN含量顯著增加。且高溫滅菌后,原料上未檢測到微生物,說明高溫滅菌是個(gè)可行的滅菌方法。且高溫滅菌對(duì)青貯原料的緩沖容量無顯著影響,這說明了高溫滅菌后的原料在發(fā)酵特性上,與未滅菌原料相似[26]。由于參照Mogodiniyai等[17]的方法不能完全收集植物的附生微生物,收集的數(shù)量約為實(shí)際的90%,為保證相似的初始菌群數(shù)量,和相似的WSC底物含量,故適當(dāng)增加了重構(gòu)青貯的DM含量至40%。

3.2 不同原料和附生微生物組合對(duì)青貯常規(guī)養(yǎng)分的影響

DM含量的降低是青貯過程中常見的現(xiàn)象,主要由異型發(fā)酵乳酸菌、酵母菌、梭菌等微生物在發(fā)酵過程中將底物轉(zhuǎn)變?yōu)闅怏w、水等成分所引起的,造成青貯DM損失。本試驗(yàn)中,滅菌甘蔗尾葉為原料時(shí),象草附生微生物的添加顯著增加了青貯的DM含量,說明象草附生微生物可以減少甘蔗尾葉青貯的DM損失。不同附生微生物也同樣對(duì)滅菌象草青貯的DM含量有顯著影響,甘蔗尾葉附生微生物增加了滅菌象草青貯的DM含量,但混合附生微生物降低了滅菌象草青貯的DM含量。許多研究發(fā)現(xiàn),甘蔗尾葉青貯有更高的DM損失,這可能與甘蔗尾葉附生微生物中較多的釀酒酵母有關(guān)[14]。接種附生微生物的不同還顯著影響了青貯的CF含量,這可能與附生微生物對(duì)CF的降解作用有關(guān)。青貯前滅菌象草的CF含量更高,而青貯開封時(shí),原料來源對(duì)青貯的CF含量無顯著影響,說明微生物接種于象草上,有更強(qiáng)的CF降解能力,青貯原料的不同,會(huì)顯著影響到微生物對(duì)CF的降解作用。乳酸菌在青貯發(fā)酵過程中,會(huì)產(chǎn)生纖維素酶[27],從而減少纖維素的含量。這說明乳酸菌在象草青貯上更易繁殖,本試驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)滅菌象草青貯后的乳酸含量較滅菌甘蔗尾葉青貯高。青貯的NDF、ADF和CP含量主要與青貯原料有關(guān)。盡管不同附生微生物處理對(duì)各組合青貯的NDF、ADF含量無顯著差異,但滅菌甘蔗尾葉青貯的NDF、ADF含量較青貯前降低幅度更大。許留興等[28]研究發(fā)現(xiàn),添加蔗糖的青貯會(huì)有更低的NDF含量。

本試驗(yàn)中混合附生微生物接種于滅菌象草的青貯組合,相較于其他2個(gè)滅菌象草青貯組合,有著最高的NDF、ADF含量,同時(shí)有最低的CP含量,說明該組合的蛋白質(zhì)損失更大。而混合附生微生物發(fā)酵的滅菌甘蔗尾葉青貯的NDF含量相較于其他2個(gè)組合的甘蔗尾葉青貯更低,CP含量更高,說明該組合青貯品質(zhì)更優(yōu)。在以滅菌象草為原料時(shí),用象草附生微生物發(fā)酵有更低的NDF、ADF和CF含量,而在以滅菌甘蔗尾葉為原料時(shí),用甘蔗尾葉附生微生物發(fā)酵有更低的ADF含量。這說明了來源于原料本身的附生微生物對(duì)該原料ADF的降解更有效。接種象草附生微生物和混合附生微生物的甘蔗尾葉青貯,相較于接種自身附生微生物的甘蔗尾葉青貯有更高的DM、ADF和CP含量,更低的CF含量。這說明象草附生微生物可以減少青貯蛋白質(zhì)損失,有效降解原料的CF,且添加了象草附生微生物的甘蔗尾葉青貯有更低的DM損失。同型乳酸菌可以降低青貯的DM損失[29],推測象草的附生微生物中可能有較多的同型乳酸菌。

3.3 不同原料和附生微生物組合對(duì)青貯發(fā)酵指標(biāo)和微生物數(shù)量的影響

青貯的原料和接種的附生微生物對(duì)青貯發(fā)酵指標(biāo)和微生物數(shù)量均有顯著影響,原料不同時(shí),相同的附生微生物接種對(duì)發(fā)酵指標(biāo)和微生物數(shù)量也有不同的影響[30]。

青貯開封時(shí)的滅菌象草有更高的pH和丁酸含量,更低的乙醇和乙酸含量,這可能是由于滅菌甘蔗尾葉原料有更高的WSC含量,更易使乳酸菌發(fā)酵,使得青貯pH更低[31-32]。同時(shí),pH的下降使得生成丁酸的腐敗菌受到抑制,使滅菌甘蔗尾葉青貯的丁酸含量降低[33]。許多研究發(fā)現(xiàn),甘蔗尾葉青貯有較高的乙醇含量[14,34-35],也有研究發(fā)現(xiàn),青貯原料中較高的WSC含量,會(huì)促進(jìn)酵母菌和霉菌的發(fā)酵,使青貯中乙醇含量升高[36]。黃峰[26]也同樣研究發(fā)現(xiàn),不同處理的滅菌甘蔗尾葉青貯中的乙酸含量較高。滅菌象草青貯有更多的乳酸菌數(shù)量,這可能是滅菌象草青貯的pH更高造成的[33]。滅菌甘蔗尾葉青貯有更多的霉菌數(shù)量,這可能與原料中較高的WSC含量有關(guān)[14]。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),接種象草附生微生物的青貯有著更低的pH和乙酸含量。而接種甘蔗尾葉附生微生物的青貯,相較于其他處理,乙醇含量更低。乙酸的生成通常與異型發(fā)酵乳酸菌或大腸桿菌的活動(dòng)有關(guān)[37],甘蔗尾葉附生微生物中,大腸桿菌的數(shù)量多于象草附生微生物可能解釋了這個(gè)原因,也有可能是甘蔗尾葉附生微生物中有更多的異型發(fā)酵乳酸菌的數(shù)量。乙醇的產(chǎn)生主要與酵母菌和霉菌的發(fā)酵有關(guān),象草附生微生物的霉菌數(shù)量更多。

混合附生微生物的發(fā)酵使滅菌象草青貯的乳酸含量更低,氨態(tài)氮和丁酸含量更高,而同樣混合附生微生物發(fā)酵的滅菌甘蔗尾葉卻恰恰相反,該組合青貯乳酸含量高于接種其他2種附生微生物的組合,氨態(tài)氮和丁酸含量也更低。這可能是由于滅菌象草原料的WSC含量相對(duì)較低,使得多種微生物在發(fā)酵初期競爭激烈[32],限制了青貯的進(jìn)程。Dong等[38]將苜蓿附生微生物接種于未滅菌的象草,同樣發(fā)現(xiàn)該組青貯品質(zhì)低于單一附生微生物的青貯。而滅菌甘蔗尾葉仍有較高的WSC含量,足夠微生物的發(fā)酵活動(dòng),且青貯初始微生物多樣性較高時(shí),青貯品質(zhì)傾向于更佳[39]。

3.4 不同原料和附生微生物組合對(duì)有氧不穩(wěn)定時(shí)發(fā)酵指標(biāo)和微生物數(shù)量的影響

青貯的微生物在有氧暴露條件下激活后,表現(xiàn)出與青貯狀態(tài)不一樣的規(guī)律。而微生物組成的變化,尤其是乳酸菌和霉菌的大量繁殖,會(huì)造成青貯的營養(yǎng)損失和發(fā)酵指標(biāo)的改變。Ashbell等[25]認(rèn)為,青貯pH的增加小于0.5時(shí),青貯被認(rèn)為是穩(wěn)定的。本試驗(yàn)中,E×MS和E×MES處理青貯在有氧暴露第12天時(shí)pH的增加量相較于初始狀態(tài)大于0.5,其余處理青貯在有氧暴露第6天時(shí),pH的變化量大于0.5。這說明了甘蔗尾葉附生微生物可延長象草青貯的有氧穩(wěn)定時(shí)間。一般乙酸的含量與青貯的有氧穩(wěn)定性相關(guān),表現(xiàn)為乙酸含量越高,有氧穩(wěn)定性越強(qiáng)[40-41],滅菌甘蔗尾葉青貯有較高的乙酸含量,但均在第6天時(shí)有氧不穩(wěn)定,這是由于高糖的青貯有氧穩(wěn)定性更差[42]。

有氧暴露不穩(wěn)定時(shí),各處理青貯乳酸、乙醇、丙酸和丁酸含量均明顯下降,除E×MS處理乙酸含量有所上升外,其余各處理乙酸含量均下降,且有氧不穩(wěn)定時(shí),各處理的乳酸菌、酵母菌、霉菌和大腸桿菌數(shù)量均有明顯增加,與前人研究結(jié)果[26]一致。

4 結(jié) 論

① 甘蔗尾葉附生微生物會(huì)增加滅菌甘蔗尾葉和象草青貯的乙酸含量;象草附生微生物會(huì)增加滅菌甘蔗尾葉和象草青貯的乙醇含量,且降解纖維的能力更強(qiáng)。

② 滅菌甘蔗尾葉青貯相較于滅菌象草青貯的pH更低,乙醇、乙酸含量更高。

③ 甘蔗尾葉附生微生物以及甘蔗尾葉和象草混合附生微生物會(huì)提高象草青貯的有氧穩(wěn)定性,甘蔗尾葉和象草混合附生微生物的發(fā)酵會(huì)提高甘蔗尾葉青貯的品質(zhì)。