黃代濤 王 波 陸 穎 張錦標(biāo) 和曉明 高振東 王 楷 李 雯 趙東祥 種玉晴 鄧衛(wèi)東

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,昆明 650201)

蘭坪烏骨綿羊作為世界上珍稀的遺傳資源品種之一,于2009年被列入《國家畜禽遺傳資源名錄》。從外貌特征來看,蘭坪烏骨綿羊的毛色與蘭坪本地普通綿羊非常相似,需通過內(nèi)部明顯的“烏骨烏肉”特征進(jìn)行區(qū)分。鄧衛(wèi)東等[1]報道,屠宰后的蘭坪烏骨綿羊的內(nèi)皮、肌肉、骨膜、腎臟、心臟、肺臟和氣管等組織器官呈現(xiàn)烏黑色,與蘭坪本地普通綿羊的鮮紅色有所不同,這是因為蘭坪烏骨綿羊體內(nèi)存在大量的黑色素沉積[2]。通過對蘭坪烏骨綿羊的遺傳性能雜交試驗證實了其烏質(zhì)性狀是可以遺傳的,且紅外光譜定性分析表明蘭坪烏骨綿羊的黑色素與烏骨雞相似,都屬于真黑色素[3]。烏骨雞在我國清代已有相關(guān)論述證明,其作為一種藥食兩用的滋補品,具有益氣、滋陰和延緩衰老的功效[4],引起烏骨雞和烏骨綿羊烏質(zhì)性狀的黑色素具有抗氧化和抗病性等作用[5]。蘭坪烏骨綿羊因其肉質(zhì)細(xì)膩、鮮美而不膻以及富含蛋白質(zhì)、天然黑色素等極高的營養(yǎng)保健價值,具有學(xué)術(shù)研究價值,在中國享有“黃金羊”“藥羊”等獨特美譽,食用可延緩衰老、抑制腫瘤細(xì)胞形成、保護(hù)視力以及預(yù)防阿爾茨海默癥等慢性炎癥性疾病的發(fā)生[3],因此備受眾多養(yǎng)殖戶和消費者的青睞。鄧衛(wèi)東等[3]對蘭坪烏骨綿羊和普通綿羊的血液生理生化指標(biāo)進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示蘭坪烏骨綿羊的總抗氧化能力為(10.02±7.77) U/mL,顯著高于普通綿羊的(5.30±1.68) U/mL;此外,蘭坪烏骨綿羊的谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和抗超氧陰離子(O2-·)水平顯著低于普通綿羊,說明蘭坪烏骨綿羊相對于普通綿羊具有更強的抗氧化能力。盡管代謝組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用越來越先進(jìn),但關(guān)于解決這一現(xiàn)象的代謝機制的信息仍然非常有限。

目前,對于蘭坪烏骨綿羊血漿的非靶向代謝組學(xué)方面的研究較少,可用于分析的數(shù)據(jù)匱乏。因此,本研究旨在通過代謝組學(xué)剖析蘭坪烏骨綿羊和普通綿羊血漿代謝物差異,探究蘭坪烏骨綿羊和普通綿羊之間的種間差異帶來的代謝機制變化,以期為中國特有的稀有烏質(zhì)畜禽資源蘭坪烏骨綿羊的繁殖育種和應(yīng)用提供相關(guān)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計及樣品采集

試驗動物來自云南省怒江州蘭坪縣,選擇體重30～40 kg、年齡2.5歲、健康體況良好的蘭坪烏骨綿羊(WG組)和蘭坪本地普通綿羊(PT組)各12只,在相同飼養(yǎng)管理條件下(放牧加補飼),采集血液樣品,靜置20 min后,4 000 r/min離心15 min獲取血漿樣本,低溫儲存,用于后續(xù)的非靶向代謝組學(xué)檢測。蘭坪烏骨綿羊和普通綿羊血漿黑色素指標(biāo)[酪氨酸酶(TYR)活性及真黑色素、總黑色素、褐黑色素]比較見表1,WG組血漿TYR活性顯著高于PT組(P<0.05),WG組血漿褐黑色素濃度極顯著高于PT組(P<0.01);WG組血漿真黑色素和總黑色素濃度高于PT組,但差異不顯著(P>0.05)。

1.2 測定方法

采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)的分析,所檢查的代謝物范圍涵蓋100～1 500 m/z。采用酶聯(lián)免疫吸附測定方法測定蘭坪烏骨綿羊和普通綿羊血漿黑色素指標(biāo)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對代謝物進(jìn)行多元統(tǒng)計分析,包括主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)、應(yīng)用層次聚類(HCA)、代謝物相關(guān)性分析、受試者工作特征(ROC)曲線和曲線下面積(AUC),以確定標(biāo)志性代謝物,并對這些標(biāo)志性代謝物的生物學(xué)意義進(jìn)行分析和解釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCA

如圖1所示,通過PCA模型得分散點圖分析表明,蘭坪烏骨綿羊和普通綿羊樣品之間明顯分離。樣品在主成分1(PC1)上的貢獻(xiàn)率為20.59%,在主成分2(PC2)上的貢獻(xiàn)率為9.89%,所有樣品均在95%的置信區(qū)間內(nèi)?；谶@些結(jié)果,可以進(jìn)一步對代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

圖1 蘭坪烏骨綿羊和普通綿羊樣品的PCA模型得分散點圖Fig.1 Scatter plot of PCA model scores of Lanping black-boned sheep and conventional sheep samples

2.2 PLS-DA

為了分析蘭坪烏骨綿羊和普通綿羊樣品之間的相似性和差異性,并篩選出差異的標(biāo)志物,本研究以24個樣品的峰面積值作為變量,建立了PLS-DA模型(圖2)。結(jié)果顯示,PLS-DA模型提取了2個主成分,其中R2Y(模型穩(wěn)定性參數(shù))為0.97,Q2Y(預(yù)測能力參數(shù))為0.80,R2Y大于Q2Y表示模型不僅具有較高的穩(wěn)定性和預(yù)測能力,同時該模型建立良好,能真實地反映客觀事實。因此,本研究可以進(jìn)一步探討2組之間的差異。

WG_PT代表比較對,Intercepts:R2=(0.0,0.79),Q2=(0.0,-0.52)代表R2與Q2與Y軸交點的坐標(biāo)。WG_PT represents comparison, and the Intercepts: R2=(0.0,0.79), Q2=(0.0, -0.52) represents the coordinates of the intersection of R2 and Q2 with the Y-axis.圖2 PLS-DA得分散點圖(A)和排序驗證圖(B)Fig.2 PLS-DA score scatter plot (A) and ranking verification plot (B)

2.3 差異代謝物篩選

依據(jù)變量投影重要性(variable importance in projection,VIP)>1、P<0.05以及|log2差異倍數(shù)(FC)|>1為篩選標(biāo)準(zhǔn),確定了在2組之間存在著181種具有顯著差異(P<0.05)的代謝物。在2組的比較中觀察到48種代謝物表達(dá)上調(diào),以及133種代謝物表達(dá)下調(diào),上調(diào)和下調(diào)前12差異代謝物名稱、分子質(zhì)量、保留時間、log2FC、P值、VIP見表2。通過層次聚類分析熱圖顯示,篩選出的181種差異代謝物能明顯區(qū)分2組(圖3),說明該差異代謝物可靠性高且能真實反映2組的情況。

圖下方的代碼代表羊只的編號。The code below represents the sheep’s number.圖3 蘭坪烏骨綿羊和普通綿羊顯著差異代謝物的層次聚類分析熱圖Fig.3 Hierarchical clustering analysis heat map of significantly different metabolites between Lanping black-boned sheep and conventional sheep

表2 蘭坪烏骨綿羊和普通綿羊差異代謝物(前12)Table 2 Differential metabolites of top12 between Lanping black-boned sheep and conventional sheep (top 12)

不同代謝物之間存在協(xié)同或拮抗關(guān)系,即某些代謝物在變化趨勢上呈正相關(guān),而另一些代謝物則呈負(fù)相關(guān)。通過對差異代謝物的相關(guān)性進(jìn)行分析(圖4),結(jié)果顯示共有139種代謝物關(guān)系呈正相關(guān),36種代謝物關(guān)系呈負(fù)相關(guān)。如2-(叔丁基)-1,3-噻唑烷-4-羧酸和N6-(2-呋喃甲基)-9H-嘌呤-6-胺呈正相關(guān),但與其他18種代謝物呈負(fù)相關(guān)。此外其他18種代謝物之間存在正相關(guān)或無相關(guān)性。

相關(guān)性最高為1,為完全的正相關(guān)(紅色);相關(guān)性最低為-1,為完全的負(fù)相關(guān)(藍(lán)色);沒有顏色的部分表示P值>0.05,圖中展示的是按P值從小到大排序的前20的差異代謝物的相關(guān)性。The highest correlation is 1, which is completely positive correlation (red); the lowest correlation is -1, which is completely negative correlation (blue); the part without color indicates P-value>0.05, and the figure shows the correlation of the differential metabolites of the top 20 sorted by P-value value from smallest to largest.圖4 差異代謝物相關(guān)性圖(前20)Fig.4 Differential metabolites correlation diagram (top 20)

2.4 相關(guān)網(wǎng)絡(luò)和代謝途徑分析

差異代謝物間的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示,差異代謝物在完整通路分析中主要富集于20條生物化學(xué)通路(圖5)。在這些富集通路中,觀察到9條差異代謝物數(shù)量多且富集程度高的通路,即膽汁分泌、藥物代謝-細(xì)胞色素P450、醛固酮調(diào)節(jié)鈉的重吸收、癌癥表達(dá)相關(guān)通路、前列腺癌、初級膽汁酸生物合成、α-亞麻酸代謝、泛醌和其他萜類醌生物合成以及類固醇激素生物合成;其余11條代謝通路差異代謝物數(shù)量較少。

圖中橫坐標(biāo)為相應(yīng)代謝通路中差異代謝物的數(shù)目/該通路中鑒定出總代謝物數(shù)目,值越大,表示該通路中差異代謝物富集程度越高。點的顏色代表超幾何檢驗的P值,P值越小,說明檢驗的可靠性越大、越具統(tǒng)計學(xué)意義。點的大小代表相應(yīng)通路中差異代謝物的數(shù)目,數(shù)目越大,代表該通路內(nèi)差異代謝物就越多。The abscissa in the figure is the number of differential metabolites in the corresponding metabolic pathway/number of total metabolites identified in the pathway, the higher the value, the higher the degree of differential metabolite concentration in the pathway. The color of the dots represents the P-value of the hypergeometry test, and the smaller the P-value, the greater and more statistically significant the reliability of the test. The size of the dot represents the number of differential metabolites in the corresponding pathway, and the larger the number, the more differential metabolites within that pathway.圖5 顯著差異調(diào)節(jié)代謝物的代謝途徑Fig.5 Significant differences regulate metabolic pathways of metabolites

這9條高度富集的代謝通路中,有的代謝物涉及了多條代謝通路。具體而言,膽汁分泌通路涉及了?；蛆Z去氧膽酸、嗎啡-3-葡糖苷酸、尿酸、膽酸、石膽酸等10種差異代謝物;嗎啡-3-葡糖苷酸和丙戌酸富集于藥物代謝-細(xì)胞色素P450通路;醛固酮調(diào)節(jié)鈉重吸收、癌癥途徑以及前列腺癌均涉及了可的松和氫化可的松;?；蛆Z去氧膽酸、膽酸和鵝去氧膽酸富集于初級膽汁酸生物合成通路;α-亞麻酸代謝通路中涉及了9S-羥基-10E,12Z,15Z-十八碳三烯酸[9(S)-HOTrE];泛醌和其他萜類醌生物合成通路中涉及了L-酪氨酸;最后,可的松、雌三醇、氫化可的松以及16-葡萄糖醛酸雌三醇富集于類固醇激素生物合成通路。

2.5 標(biāo)志代謝物的篩選

在蘭坪烏骨綿羊和普通綿羊的血漿代謝組學(xué)中,發(fā)現(xiàn)以下14種代謝物(?；蛆Z去氧膽酸、尿酸、膽酸、石膽酸、鵝去氧膽酸、哇巴因、可的松、氫化可的松、脫氧膽酸、丙戌酸、9(S)-HOTrE、L-酪氨酸、雌三醇和16-葡萄糖醛酸雌三醇)在2個羊種中具有較好的識別能力,其AUC大于0.5。其中去氧膽酸、膽酸、石膽酸、鵝去氧膽酸、氫化可的松和雌三醇的AUC超過0.8,表明這6種代謝物可以作為主要指標(biāo)來識別蘭坪烏骨綿羊的血漿代謝組學(xué)特征(圖6)。

Specificity:特異性;Sensitivity:靈敏度。圖6 蘭坪烏骨綿羊標(biāo)志代謝物ROC曲線Fig.6 ROC curve of marker metabolites in Lanping black-boned sheep

3 討 論

由于蘭坪烏骨綿羊在食用和藥用方面具有高度的價值,人們對該物種的興趣和需求大大增加,這引發(fā)了許多研究人員對蘭坪烏骨綿羊和普通綿羊之間差異的生物學(xué)機制的興趣。在過去的十多年中,家畜代謝組學(xué)研究取得了顯著的進(jìn)展。然而相對于牛、豬等其他家畜物種的研究,綿羊代謝組學(xué)的研究仍處于相對滯后的狀態(tài)。一項由Goldansaz等[6]利用LC-MS/MS技術(shù)對受孕前7 d到受孕后70 d的131份母羊血清樣本進(jìn)行了檢測,發(fā)現(xiàn)與受孕率和產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的L-精氨酸、尿素、蛋氨酸、L-乳酸和纈氨酸5種生物標(biāo)志物。此外Zhang等[7]發(fā)現(xiàn)過度放牧可顯著降低綿羊增重速度和與免疫反應(yīng)、營養(yǎng)代謝相關(guān)的血清生化指標(biāo),包括免疫球蛋白G、白蛋白、葡萄糖和非酯化脂肪酸含量。

目前對于蘭坪烏骨綿羊血漿非靶代謝組學(xué)的研究還非常有限。本研究旨在通過蘭坪烏骨綿羊和普通綿羊的血漿代謝組學(xué)分析,并確定2組之間的14種關(guān)鍵代謝物。通過識別這些代謝物,成功確定了6種可作為識別蘭坪烏骨綿羊血漿代謝組學(xué)的主要指標(biāo)的標(biāo)志代謝物。其中4種代謝物(脫氧膽酸、鵝去氧膽酸、膽酸、石膽酸)表現(xiàn)出上調(diào)的趨勢,而另外2種代謝物(氫化可的松、雌三醇)則呈現(xiàn)下調(diào)的變化。

3.1 膽酸類標(biāo)志代謝物對蘭坪烏骨綿羊營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收及抗病的影響

脫氧膽酸是一種與膽汁酸家族相關(guān)的膽酸類似物。在動物體內(nèi)由肝臟合成,并通過膽囊儲存和釋放到小腸中,發(fā)揮重要的生理功能。一方面脫氧膽酸作為膽汁的主要成分之一,在小腸中促進(jìn)脂肪的消化和吸收;另一方面脫氧膽酸還參與膽固醇(CHOL)代謝過程,并通過刺激膽囊收縮來調(diào)節(jié)膽囊功能。研究表明,高濃度的脫氧膽酸能夠促進(jìn)肝臟中CHOL的分泌。CHOL是機體重要的營養(yǎng)物質(zhì),作為細(xì)胞膜的主要組成成分,它在細(xì)胞膜的形成、維持細(xì)胞膜完整性和穩(wěn)定性以及信號傳導(dǎo)等方面發(fā)揮著重要的作用[8]。有研究顯示,脫氧膽酸對由金黃色葡萄球菌引起的小鼠乳腺組織病理性損傷具有劑量依賴性的緩解作用,不僅降低乳腺組織中髓過氧化物酶(MPO)的活性和炎癥評分,而且能有效保護(hù)乳腺腺泡結(jié)構(gòu)的完整性,并抑制炎性細(xì)胞的浸潤[9]。在本研究中,觀察到蘭坪烏骨綿羊血漿代謝中脫氧膽酸上調(diào),表明蘭坪烏骨綿羊在脂肪消化、CHOL代謝和抗炎能力方面強于普通綿羊。

鵝去氧膽酸是動物膽汁中最主要的天然初級膽汁酸[10],也是最豐富的親水性膽汁酸之一。它在腸道中具有增強脂類物質(zhì)和維生素的吸收能力,并在預(yù)防肝臟、腸道等器官疾病方面發(fā)揮重要作用。因此,鵝去氧膽酸是調(diào)節(jié)生命活動的重要因子之一[11]。Song等[12]研究顯示,補充鵝去氧膽酸可以提高斷奶仔豬的終生體重和平均體重,同時降低腹瀉發(fā)生率,這表明鵝去氧膽酸能夠改善仔豬的生長性能。在本研究中,觀察到蘭坪烏骨綿羊血漿代謝中鵝去氧膽酸上調(diào),表明相比普通綿羊,蘭坪烏骨綿羊在脂類吸收能力、腸道屏障功能以及幼齡時期的生長性能等方面具有更強的優(yōu)勢。

膽酸是一種存在于動物膽汁酸中的化合物,主要由肝臟通過直接合成CHOL而形成。早期的研究已證實膽酸具有抑菌和抗炎的特性[13]。進(jìn)一步的研究表明,膽酸具有乳化脂肪、輔助CHOL的分解和脂肪吸收的作用,通過增大脂肪與胰脂酶接觸的表面積,促進(jìn)脂肪的消化。將膽酸添加到高脂飼糧中可以有效抑制小鼠的肥胖發(fā)展[14-15]。膽酸在不同的組織器官中發(fā)揮多樣化的功能。在神經(jīng)系統(tǒng)中,膽酸具有鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛的作用;在呼吸系統(tǒng)中,膽酸能夠平喘鎮(zhèn)咳,并舒張平滑肌[16];在肌肉組織中,膽酸具有解痙的作用;在循環(huán)系統(tǒng)中,膽酸能夠降低血壓并調(diào)節(jié)心臟搏動。此外,膽酸還表現(xiàn)出抗病毒、抗真菌和解熱的特性[17]。在肌肉組織中,膽酸具有解痙的作用;在循環(huán)系統(tǒng)中,膽酸能夠降低血壓并調(diào)節(jié)心臟搏動。此外,膽酸還表現(xiàn)出抗病毒、抗真菌和解熱的特性。在本研究中,觀察到蘭坪烏骨綿羊血漿代謝中膽酸相比于普通綿羊上調(diào),表明蘭坪烏骨綿羊在脂肪的消化吸收能力、抑菌抗炎抗病等方面要強于普通綿羊。

石膽酸是哺乳動物排泄的一種重要膽汁酸之一,具備多種生理活性,包括抗菌和抗腫瘤等特性[18-19]。研究表明,膽汁酸與糖、脂代謝密切相關(guān),并在調(diào)節(jié)糖、脂代謝過程中發(fā)揮重要作用[20]。石膽酸不僅延長了酵母在時間上的老化進(jìn)程,還降低了來自不同組織和生物體的培養(yǎng)癌細(xì)胞的活力和增殖。這些有關(guān)CHOL衍生生物活性脂質(zhì)的強大抗衰老和抗腫瘤作用的分子和細(xì)胞機制已被揭示[21]。在本研究中,蘭坪烏骨綿羊血漿代謝中石膽酸上調(diào),說明蘭坪烏骨綿羊在抗菌、抗衰老和抗腫瘤等方面具有更強的能力。

3.2 激素類標(biāo)志代謝物對蘭坪烏骨綿羊健康和食用價值的影響

氫化可的松屬于糖皮質(zhì)類激素,對動物機體免疫過程的多個環(huán)節(jié)均具有抑制作用。它抑制巨噬細(xì)胞和其他抗原遞呈細(xì)胞的功能,減弱它們對抗原的反應(yīng),從而削弱機體的體液免疫能力。此外,氫化可的松還可破壞淋巴細(xì)胞和效應(yīng)B細(xì)胞,對機體的非特異性免疫和特異性免疫反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用[22]。先前的研究表明氫化可的松能夠抑制軟骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖能力,以及抑制成纖維細(xì)胞分泌膠原的過程[23]。另外,氫化可的松在一定范圍內(nèi)有利于奶牛乳腺上皮細(xì)胞合成乳蛋白,隨著氫化可的松劑量的增加,該能力逐漸減弱甚至抑制奶牛乳腺細(xì)胞的增長[24]。本試驗中,蘭坪烏骨綿羊血漿代謝中氫化可的松下調(diào),表明與普通綿羊相比,蘭坪烏骨綿羊在機體免疫和乳蛋白合成等方面的能力較強。

雌三醇是一種屬于天然雌激素的化合物[25],在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中廣泛使用。然而,由于食物鏈中存在殘留的天然雌激素,對人體健康可能產(chǎn)生危害,可能通過改變?nèi)藘?nèi)分泌系統(tǒng)的活動,對神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)造成損害[26]。過量攝入雌三醇可能導(dǎo)致多種不良效應(yīng),其中包括增加乳腺和子宮癌的風(fēng)險、對生殖健康產(chǎn)生影響(過量雌三醇可能導(dǎo)致生殖系統(tǒng)不平衡和功能紊亂)、增加血栓形成的風(fēng)險以及引發(fā)激素依賴性副作用。本試驗中,蘭坪烏骨綿羊的血漿中雌三醇含量低于普通綿羊,表明蘭坪烏骨綿羊在食用價值和生殖健康方面優(yōu)于普通綿羊。

4 結(jié) 論

通過解析蘭坪烏骨綿羊和普通綿羊血漿代謝物和整體代謝途徑及其調(diào)控差異,發(fā)現(xiàn)了9條顯著富集的代謝途徑和6種差異標(biāo)志性代謝物(脫氧膽酸、膽酸、石膽酸、鵝去氧膽酸、氫化可的松、雌三醇),這6種差異標(biāo)志性代謝物與蘭坪烏骨綿羊和普通綿羊的營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、抗炎、抗病、抗衰老、機體免疫等性狀有關(guān)。