李艷茹, 周麗瑩, 董 笛, 劉亞玲, 李舒文, 王夢(mèng)迪, 晁躍輝*

(1.北京林業(yè)大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院, 北京 100083; 2. 北京理工大學(xué)生命學(xué)院, 北京 100081; 3. 內(nèi)蒙古草業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心有限公司, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

近年來(lái)隨著功能基因組學(xué)研究的深入推進(jìn),分子生物學(xué)領(lǐng)域蛋白質(zhì)相互作用的相關(guān)研究成為一個(gè)備受關(guān)注熱點(diǎn)問(wèn)題[1]。研究蛋白質(zhì)之間的相互作用是探究基因功能的重要方面,通過(guò)該研究可以深入分析基因編碼產(chǎn)物的作用機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。酵母雙雜交技術(shù)是一種分子生物學(xué)技術(shù),主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)相互作用研究[2]。該技術(shù)基于酵母菌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能,通過(guò)激活報(bào)告基因的表達(dá)來(lái)進(jìn)行目的蛋白的篩選[3]。同時(shí),酵母雜交技術(shù)也可以在一定程度上反映細(xì)胞內(nèi)部的真實(shí)情況[4]。構(gòu)建高容量的cDNA酵母文庫(kù)是利用酵母雙雜交技術(shù)篩選目的基因以及研究蛋白互作關(guān)系的基礎(chǔ),也是揭示蛋白功能及其作用基礎(chǔ)的前提,所以構(gòu)建高質(zhì)量cDNA酵母文庫(kù)具有重要意義[5-6]。近年來(lái),酵母雜交技術(shù)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)互作篩選,并在新基因挖掘及基因調(diào)控相關(guān)分子機(jī)制探究方面發(fā)揮了重要作用[7]。

日本結(jié)縷草(Zoysiajaponica)適應(yīng)性廣,抗逆性強(qiáng),地下根系發(fā)達(dá),密度高,覆蓋面廣,是一種優(yōu)良的禾本科草坪草品種[8-9]。日本結(jié)縷草具有極強(qiáng)的逆境適應(yīng)能力,不僅適應(yīng)潮濕的沿海地區(qū),還能適應(yīng)內(nèi)陸的干旱極端氣候[10]。這些優(yōu)良特性使得日本結(jié)縷草在城市綠化、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)建設(shè)以及水土保持等方面有重要的應(yīng)用價(jià)值[11-12]。高容量的日本結(jié)縷草酵母雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建,為更深層次的探索日本結(jié)縷草相關(guān)基因提供便利。本研究挑選了來(lái)源于不同組織的日本結(jié)縷草,并進(jìn)行不同的脅迫處理或激素誘導(dǎo),再經(jīng)過(guò)SMART技術(shù)進(jìn)行了高容量的日本結(jié)縷草酵母雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建,該文庫(kù)能夠用作篩選試驗(yàn),可作為基礎(chǔ)進(jìn)一步進(jìn)行蛋白與DNA互作或蛋白質(zhì)互作等基礎(chǔ)生物學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所使用的酵母文庫(kù)構(gòu)建試劑盒購(gòu)自Invitrogen(美國(guó)),包括CloneMinerTMII cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒、FastTrack MAG mRNA分離試劑盒、PureLinktm快速凝膠提取和PCR純化組合試劑,以及質(zhì)粒DNA純化試劑盒。此外,于日本TaKaRa公司購(gòu)買(mǎi)了MatchmakerTM酵母篩庫(kù)試劑盒、實(shí)驗(yàn)菌株大腸桿菌DH10B菌株和Y187菌株,以及DNA連接酶、DNA聚合酶和T4 DNA連接酶。實(shí)驗(yàn)藥物乙醇、瓊脂、異戊醇、LB培養(yǎng)基購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 日本結(jié)縷草總RNA的提取及mRNA分離純化

選取結(jié)縷草種子、生長(zhǎng)30天的日本結(jié)縷草的根莖葉植物組織進(jìn)行取樣。首先,取0.1 g樣品,將取出的樣品置于液氮中并進(jìn)行充分研磨直至樣品變成粉末狀。用Trizol法進(jìn)行總RNA的提取,之后對(duì)提取的mRNA進(jìn)行分離和純化。最后,采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。

1.3 cDNA初級(jí)文庫(kù)的構(gòu)建及檢測(cè)

將質(zhì)量合格的日本結(jié)縷草總RNA作為模板,進(jìn)行第一鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成。在E.coliDNA Ligase (10 U·μL-1)、E.coliDNA PolymeraseⅠ(10 U·μL-1)、E.coliRNaseH (2 U·μL-1)和T4 DNA Polymerase的催化下,利用合成的第一鏈cDNA作為模板合成第二鏈cDNA。將三框attB1重組接頭連接至獲得的第二鏈cDNA,隨后進(jìn)行cDNA分級(jí)分離并收集。對(duì)收集到的cDNA進(jìn)行BP重組反應(yīng),并將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化階段完成后,將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到SOC培養(yǎng)基中,在37℃、搖床速度為225～250 r·min-1的條件下培養(yǎng)60分鐘左右。隨后,將菌液原液分為兩部分,一部分原液取出進(jìn)行后續(xù)的測(cè)定庫(kù)容、重組率和插入片段長(zhǎng)度。剩余原液則加入甘油至終濃度為20%,存儲(chǔ)在-80℃的環(huán)境中進(jìn)行長(zhǎng)期保存。

1.4 酵母雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及保存

首先,需要進(jìn)行初級(jí)文庫(kù)質(zhì)粒的提取,然后將提取好的質(zhì)粒稀釋到300 ng·μL-1。之后,進(jìn)行LR重組反應(yīng),將質(zhì)粒與載體pGADT7-DEST相結(jié)合。然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。最后細(xì)胞培育需要在SOC培養(yǎng)基上進(jìn)行,用以獲得酵母雙雜交cDNA文庫(kù)。隨后,文庫(kù)質(zhì)量鑒定需要取出10 μL轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌原液進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。將甘油加入到剩余的菌液中直至濃度達(dá)到20%,并且需要將菌液在-80℃長(zhǎng)期存放,以備后續(xù)使用。

1.5 Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備

為了獲得Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞,需要取少量菌株,在YPDA培養(yǎng)基上劃線。隨后,將其倒放在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5天。接著,在YPDA培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)多次挑選好的酵母單菌落,直至菌液OD600達(dá)到0.4～0.5。用單獨(dú)的離心管分裝最終的菌液,然后將分裝好的菌液進(jìn)行離心并把上清液棄掉,之后需要用無(wú)菌去離子水將沉淀進(jìn)行重懸,再次離心后重懸沉淀需要加入TE/LiAc溶液。最后使用TE/LiAc溶液懸浮細(xì)胞,可以得到Y(jié)187酵母感受態(tài)細(xì)胞的懸浮液。

1.6 cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞

首先,將cDNA文庫(kù)質(zhì)粒取出5 μL,并將其轉(zhuǎn)化到制備好的Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞原液取出10 μL,分別稀釋到原來(lái)的10,100,1 000,10 000倍,然后將稀釋后的液體涂布于SD/-Leu平板上,之后在30℃培養(yǎng)箱中將SD/-Leu平板倒放并將其培養(yǎng)3～5天。最后進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的收集,并計(jì)算細(xì)胞密度和進(jìn)行文庫(kù)的滴定數(shù)的確定。在SD/-Leu平板上隨機(jī)挑選24個(gè)克隆,用來(lái)鑒定菌落PCR。挑選單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)以及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),并進(jìn)行文庫(kù)重組率的相關(guān)計(jì)算。

1.7 轉(zhuǎn)錄自激活驗(yàn)證

將轉(zhuǎn)化好的pGBKT7-ZjCCD7和pGBKT7載體的酵母菌液點(diǎn)涂在SD/-Trp,SD/-Trp/X-α-Gal和SD/-Trp/X-α-Gal/AbA培養(yǎng)基上,放入30℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行2～3天的培養(yǎng),之后對(duì)pGBKT7和pGBKT7-ZjCCD7出現(xiàn)的菌落狀態(tài)進(jìn)行觀察驗(yàn)證,看其是否具有轉(zhuǎn)錄自激活活性。

1.8 ZjCCD7互作蛋白的篩選及驗(yàn)證

按照MatchmakerTM酵母篩庫(kù)試劑盒的要求進(jìn)行ZjCCD7蛋白的篩庫(kù)。將pGBKT7-ZjCCD7和pGADT7-atpG一起轉(zhuǎn)化至酵母感受態(tài)細(xì)胞中作為實(shí)驗(yàn)組,并設(shè)置pGBKT7-53+pGADT7-T作為陽(yáng)性對(duì)照,pGBKT7-53+pGADT7-atpG,pGADT7-T+pGBKT7-ZjCCD7共同作為陰性對(duì)照,將搖好的酵母菌液在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-Gal固體培養(yǎng)基上點(diǎn)涂,并放入30℃培養(yǎng)箱下進(jìn)行2～3 d的培養(yǎng),之后對(duì)菌落狀態(tài)進(jìn)行觀察記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 日本結(jié)縷草mRNA分離質(zhì)量良好

用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)(圖1),檢測(cè)結(jié)果顯示,純化后的mRNA條帶呈現(xiàn)為一條模糊的拖帶,大于500 bp的部分是該拖帶最亮的部分。該結(jié)果表明,分離純化后的mRNA沒(méi)有發(fā)生分解,且質(zhì)量良好,能夠用作建庫(kù)起始樣品。

圖1 mRNA分離結(jié)果Fig.1 mRNA separation results

2.2 初步構(gòu)建cDNA初級(jí)文庫(kù)

將純化后的ds-cDNA取出5 μL,用以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示,ds-cDNA的條帶呈現(xiàn)為一條彌散狀,該條帶大小在250～2 000 bp之間(圖2)。表明純化后的cDNA滿足下一步建庫(kù)試驗(yàn)的要求,可以用于進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 二鏈合成結(jié)果Fig.2 Two-strand synthesis results

2.2.1初級(jí)文庫(kù)重組率鑒定 從該克隆文庫(kù)中隨機(jī)挑選24個(gè)克隆,并將挑選好的克隆進(jìn)行菌落PCR的鑒定。經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),并對(duì)其重組率和插入片段長(zhǎng)度進(jìn)行了分析(圖3)。結(jié)果表明該初級(jí)文庫(kù)擁有100%的重組率,并且其平均插入片段長(zhǎng)度在1 000 bp之上,因此該文庫(kù)符合高質(zhì)量初級(jí)文庫(kù)的要求。

圖3 重組率鑒定Fig.3 Identification on the reorganization rates of primary library注:初級(jí)文庫(kù)的24 個(gè)克隆的菌落PCR鑒定Note:PCR identification on the colonies of 24 clones of primary libraries

2.2.2初級(jí)文庫(kù)庫(kù)容量鑒定 取10 μL轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌原液,并對(duì)其進(jìn)行稀釋至原來(lái)的100倍,之后從稀釋好的液體中取50 μL,并將其均勻涂布在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基上。根據(jù)公式計(jì)算得到,初級(jí)文庫(kù)總克隆數(shù)為cfu=2.6×106×4=1.04×107(圖4)。

圖4 初級(jí)文庫(kù)庫(kù)容量鑒定Fig.4 Capacity identification of the primary library

2.3 次級(jí)文庫(kù)構(gòu)建

2.3.1次級(jí)文庫(kù)插入片段重組率鑒定 從文庫(kù)中隨機(jī)挑選了24個(gè)克隆,并對(duì)選取的24個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定,還進(jìn)行了重組率和插入片段長(zhǎng)度的分析。該凝膠電泳結(jié)果顯示,隨機(jī)挑選好的24個(gè)克隆擁有100%重組率,且平均插入片段長(zhǎng)度在1 000 bp以上(圖5)。結(jié)果表明滿足構(gòu)建該酵母雜交cDNA文庫(kù)的高質(zhì)量要求條件,后續(xù)的日本結(jié)縷草酵母雜交相關(guān)試驗(yàn)可以使用該酵母雜交cDNA文庫(kù)。

圖5 次級(jí)文庫(kù)重組率鑒定Fig.5 Identification on reorganization rates of the secondary library注:次級(jí)文庫(kù)的24 個(gè)克隆的菌落PCR鑒定Note:PCR identification on the colonies of 24 clones of the secondary library

2.3.2次級(jí)文庫(kù)庫(kù)容量鑒定 將轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌原液取出10 μL,并將其稀釋至原來(lái)溶液的100倍,之后在LR培養(yǎng)基上均勻涂布取出的50 μL稀釋好的溶液,將該培養(yǎng)皿倒放在恒溫培養(yǎng)箱中,并在第二天對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)(圖6),根據(jù)公式進(jìn)行計(jì)算,得到次級(jí)文庫(kù)總克隆數(shù)為cfu=4.0×106×4=1.6×107(圖6)。

圖6 次級(jí)文庫(kù)庫(kù)容量鑒定Fig.6 Capacity identification of the secondary library

2.4 cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化Y187 酵母感受態(tài)細(xì)胞

取出100 μL液體,將其在稀釋度為1∶10 000的SD/-Leu培養(yǎng)基上均勻涂布。該培養(yǎng)基克隆數(shù)為300,且細(xì)胞密度大于3×107cells·mL-1(圖7)。

圖7 文庫(kù)滴度鑒定Fig.7 Titer identification on the library

隨機(jī)挑選該SD/-Leu培養(yǎng)基上的24個(gè)單菌落,并將這些單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),之后完成PCR檢測(cè)(圖8)。結(jié)果顯示其中可擴(kuò)增出條帶的單克隆有23個(gè),平均插入片段長(zhǎng)度大于1 000 bp,根據(jù)公式可得文庫(kù)重組率>95%。

圖8 酵母克隆鑒定Fig.8 Identification on the yeast clones注:酵母克隆的24個(gè)克隆的菌落PCR鑒定Note:PCR identification on the colonies of 24 clones of yeast clones

2.5 ZjCCD7自激活檢測(cè)與蛋白互作

2.5.1ZjCCD7自激活檢測(cè) 為了對(duì)構(gòu)建的日本結(jié)縷草酵母文庫(kù)進(jìn)行檢測(cè),選擇類(lèi)胡蘿卜素裂解雙加氧酶7進(jìn)行驗(yàn)證。將轉(zhuǎn)化成功的pGBKT7-ZjCCD7誘餌表達(dá)載體的酵母菌株,在SD/-Trp,SD/-Trp/X-α-Gal,SD/-Trp/X-α-Gal/AbA這3種缺陷固體培養(yǎng)上點(diǎn)涂并觀察生長(zhǎng)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,有酵母菌落在SD/-Trp培養(yǎng)基上并且正常生長(zhǎng)。而且轉(zhuǎn)入的pGBKT7-ZjCCD7酵母菌株在SD/-Trp/X-α-Gal培養(yǎng)基上酵母菌落沒(méi)有顯示藍(lán)色且正常生長(zhǎng),在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA培養(yǎng)基上沒(méi)有酵母菌落生長(zhǎng)且無(wú)顏色變化(圖9)。因此構(gòu)建成功的pGBKT7-ZjCCD7誘餌表達(dá)載體沒(méi)有自激活活性,可應(yīng)用于酵母雙雜交系統(tǒng)的蛋白篩選試驗(yàn)。

圖9 pGBKT7-ZjCCD7酵母轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)錄自激活檢測(cè)Fig.9 Transcriptional self-activation assay of pGBKT7-ZjCCD7 yeast transformation

2.5.2ZjCCD7互作蛋白篩選及驗(yàn)證 將ZjCCD7蛋白按照MatchmakerTM酵母篩庫(kù)試劑盒的要求進(jìn)行篩庫(kù)。篩選得到了28個(gè)變藍(lán)的克隆,通過(guò)初步篩選和生物信息學(xué)分析后,對(duì)其中一個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行了鑒定和酵母互作驗(yàn)證。將pGBKT7-53+pGADT7-T作為陽(yáng)性對(duì)照,pGBKT7-53+pGADT7-atpG,pGADT7-T+pGBKT7-ZjCCD7作為陰性對(duì)照,pGBKT7-ZjCCD7+ pGADT7-atpG作為實(shí)驗(yàn)組。將它們轉(zhuǎn)化好的酵母菌液均勻點(diǎn)涂在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-Gal培養(yǎng)基上并放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3天,之后發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性對(duì)照pGBKT7-53+pGADT7有菌落生長(zhǎng)且顏色變藍(lán),陰性對(duì)照pGBKT7-53+pGADT7-atpG和pGADT7-T+pGBKT7-ZjCCD7未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)且沒(méi)有顏色變化,作為實(shí)驗(yàn)組的pGBKT7- ZjCCD7+ pGADT7-atpG在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-Gal培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)且變藍(lán)(圖10),說(shuō)明ZjCCD7與ZjatpG互作能激活GAL4酵母雙雜交系統(tǒng)的報(bào)告基因MEL1的表達(dá)。應(yīng)用所構(gòu)建的日本結(jié)縷草酵母文庫(kù)成功篩選得到了ZjCCD7的互作蛋白,這表明文庫(kù)可用于后續(xù)的日本結(jié)縷草互作蛋白篩選實(shí)驗(yàn)以及功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

圖10 ZjCCD7蛋白互作Fig.10 ZjCCD7 protein interactions

3 討論與結(jié)論

生物技術(shù)領(lǐng)域目前的各項(xiàng)研究已經(jīng)廣泛應(yīng)用了cDNA文庫(kù),所以,構(gòu)建高容量的cDNA文庫(kù)至關(guān)重要,有效研究的進(jìn)行需要高容量的cDNA文庫(kù)。文庫(kù)中所含cDNA種類(lèi)的完整性可用來(lái)體現(xiàn)文庫(kù)的代表性,文庫(kù)質(zhì)量的高低可以用建庫(kù)來(lái)源組織中所表達(dá)的遺傳信息完整性來(lái)反映[13]。同時(shí),高質(zhì)量的cDNA文庫(kù)也對(duì)文庫(kù)插入片段的大小有一定要求,文庫(kù)插入片段的長(zhǎng)度應(yīng)高于0.3 kb[14],高質(zhì)量的文庫(kù)插入片段應(yīng)高于1 kb[15],此外文庫(kù)插入片段長(zhǎng)度應(yīng)當(dāng)接近于cDNA長(zhǎng)度,過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)均會(huì)造成文庫(kù)質(zhì)量下降[16]。文庫(kù)質(zhì)量降低是由于平均插入片段過(guò)小,而過(guò)度篩除cDNA片段則會(huì)造成初始文庫(kù)滴度過(guò)低或丟失部分基因信息[17]。本研究成功構(gòu)建了高容量的日本結(jié)縷草酵母雜交cDNA文庫(kù),可用于日本結(jié)縷草中進(jìn)行互作蛋白篩選或調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析。該文庫(kù)包含豐富的cDNA克隆和完整的遺傳信息。日本結(jié)縷草為暖季型禾本科草地植物[18],其基因組大小為334 Mb,含有59 271個(gè)蛋白編碼基因[19]。構(gòu)建的日本結(jié)縷草初級(jí)文庫(kù)總克隆數(shù)為1.04×107,為蛋白編碼基因的175倍,該文庫(kù)插入片段平均長(zhǎng)度在1 000 bp以上,cDNA片段擁有>95%的重組率,滿足cDNA文庫(kù)的高質(zhì)量、完整性要求條件,符合進(jìn)行蛋白互作篩選的文庫(kù)要求,后續(xù)的酵母雜交試驗(yàn)可以使用該cDNA文庫(kù)。

酵母雜交系統(tǒng)主要包括酵母雙雜交技術(shù)和酵母單雜交技術(shù)。酵母雙雜交技術(shù)可用于互作蛋白的篩選,酵母雙雜交篩選技術(shù)是確定兩個(gè)蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)鍵技術(shù)之一,具有高度靈敏性和完善的報(bào)告系統(tǒng)[20],酵母雙雜交技術(shù)可研究抗原與抗體的相互作用,可用作藥物作用位點(diǎn)的篩選,在藥物的發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)過(guò)程中起著重要的作用[21],也可用于蛋白和藥物相互作用以及基因組蛋白連鎖圖等方面。而酵母單雜交技術(shù)則主要用于探究蛋白質(zhì)與DNA的相互作用[22-23]。本研究利用酵母雜交技術(shù),進(jìn)行了日本結(jié)縷草ZjCCD7和atpG蛋白互作篩選試驗(yàn)。

構(gòu)建植物cDNA文庫(kù)已成為研究基因功能最常用的技術(shù)手段之一,cDNA文庫(kù)是研究某一生物特定器官、組織和發(fā)育階段基因表達(dá)的前提和基礎(chǔ),這需要在基因組水平上進(jìn)行研究[24],構(gòu)建成功的cDNA文庫(kù)可用于研究基因的功能、篩選互作蛋白以及探究蛋白質(zhì)與DNA的相互作用。因此,高質(zhì)量植物cDNA文庫(kù)的構(gòu)建具有重要意義,該文庫(kù)不僅能夠深入研究植物基因和蛋白質(zhì)功能,還可以用來(lái)發(fā)掘潛在蛋白功能[25]。本研究成功構(gòu)建了日本結(jié)縷草cDNA文庫(kù),為了驗(yàn)證構(gòu)建的日本結(jié)縷草酵母文庫(kù),以實(shí)驗(yàn)室克隆的日本結(jié)縷草類(lèi)胡蘿卜素裂解雙加氧酶為誘餌,進(jìn)行互作蛋白質(zhì)的篩選。利用酵母雙雜交技術(shù)篩選ZjCCD7互作蛋白,最終篩選到日本結(jié)縷草ZjatpG蛋白。已知類(lèi)胡蘿卜素裂解雙加氧酶7(CCD7)是類(lèi)胡蘿卜素降解以及獨(dú)角金內(nèi)酯合成途徑中的關(guān)鍵酶,在植物生長(zhǎng)過(guò)程中起著重要作用[26],而atpG編碼ATP合酶γ亞基與質(zhì)子運(yùn)輸ATP合成酶有密切的關(guān)系[27]。本研究進(jìn)行的ZjCCD7和atpG蛋白互作篩選試驗(yàn),表明日本結(jié)縷草酵母文庫(kù)可應(yīng)用于蛋白篩選實(shí)驗(yàn),互作結(jié)果顯示日本結(jié)縷草類(lèi)胡蘿卜素裂解雙加氧酶行使功能過(guò)程可能與ATP合酶相關(guān),相關(guān)通路的調(diào)控模式仍需更深層次的探究,從而為后續(xù)ZjCCD7的調(diào)控機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

本研究進(jìn)行了高容量日本結(jié)縷草酵母雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建,日本結(jié)縷草互作蛋白的酵母雙雜交篩選和蛋白質(zhì)與DNA互作的酵母單雜交試驗(yàn)都可以用到該文庫(kù),具有廣泛的應(yīng)用前景。本研究成功構(gòu)建了高容量的日本結(jié)縷草cDNA酵母文庫(kù),滿足高質(zhì)量、完整性的cDNA文庫(kù)要求,以該文庫(kù)的高質(zhì)量和完整性作為試驗(yàn)基礎(chǔ),可繼續(xù)通過(guò)后續(xù)酵母雜交深入挖掘日本結(jié)縷草生長(zhǎng)發(fā)育的基因功能。