周 澤, 付衛(wèi)剛, 雷 楊, 李青璞, 姚 拓

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅 蘭州 730070)

隨著市場經(jīng)濟(jì)的蓬勃發(fā)展,畜牧業(yè)得到了發(fā)展,規(guī)?；?、集中化、產(chǎn)業(yè)化的養(yǎng)殖水平不斷提高。畜禽養(yǎng)殖量不斷增加,甘肅省作為全國第三養(yǎng)羊大省,2019年末羊存欄量達(dá)到1 987.1萬只[1]。根據(jù)羊糞便排污指數(shù)估算[2],全國羊糞便產(chǎn)量達(dá)到了9 548.53萬噸,僅甘肅省占據(jù)其中的6.6%。全國近40%的畜禽糞便未得到無害化處理或資源化利用[3]。如果羊糞不加處理隨意堆放,會造成空氣、水體、土壤的污染[4],且造成羊糞內(nèi)的致病菌在空氣中傳播。大量未加處理的養(yǎng)殖廢棄物成為危害環(huán)境,破壞生態(tài)的源頭,廢棄物無害化處理成為當(dāng)前農(nóng)業(yè)面源污染治理的一大難題。

因此,遵循國務(wù)院“關(guān)于加快推進(jìn)畜禽養(yǎng)殖廢棄物資源化利用”的糞污治理原則,開展對羊糞資源化綜合利用、促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的研究具有重要實(shí)踐意義。資源化利用羊糞使其轉(zhuǎn)化為有機(jī)肥是目前比較理想的處理方法[5]。資源化利用不但能消除羊糞對環(huán)境的污染,滿足保護(hù)環(huán)境的需求,還能將羊糞再利用,使其轉(zhuǎn)化為有機(jī)肥,加快傳統(tǒng)畜牧業(yè)向新型現(xiàn)代循環(huán)農(nóng)業(yè)模式的轉(zhuǎn)變。新鮮羊糞中含有大量的寄生蟲卵、病原菌、重金屬和有毒有害物質(zhì),且植物可利用營養(yǎng)元素N,P,K釋放緩慢,容易造成“燒苗”,不宜直接施用[6,7]。將其好氧堆肥化處理,使其轉(zhuǎn)變?yōu)樾再|(zhì)穩(wěn)定的有機(jī)肥料,則可直接施用于土壤中。但羊?yàn)榈湫偷牟菔承约倚?相較于其他動物,羊糞中纖維素和半纖維素含量高,不易降解,成為制約其好氧堆肥高效處理的主要原因之一[8]。在羊糞好氧堆肥過程中,加入纖維素降解菌,能夠顯著提升羊糞發(fā)酵堆肥的腐熟效率[9]。

纖維素分布廣泛,是一種優(yōu)良的資源,但難以降解成為制約纖維素廣泛使用的瓶頸,纖維素類物質(zhì)的主要處理方法有生物法、物理法和化學(xué)法[10]。相較于物理化學(xué)方法,生物法具有成本低,污染小等特點(diǎn)[11]。已有研究篩選了牛糞和豬糞中纖維素降解菌,但針對羊糞的研究較少,從羊糞中分離篩選菌株,能減少堆肥中外源添加菌株與土著菌株的拮抗作用[12,13]。本研究以新鮮羊糞和堆肥升溫期羊糞為研究對象,借助濾紙條崩解試驗(yàn)及剛果紅染色法,篩選具有優(yōu)良纖維素降解能力的菌株,測定其產(chǎn)纖維素酶能力及秸稈降解能力,通過分子生物學(xué)鑒定,確定其分類學(xué)地位,最后對菌株的產(chǎn)酶活性與秸稈降解效果之間的關(guān)系及其貢獻(xiàn)程度進(jìn)行解析,以期為羊糞發(fā)酵菌劑的制作提供優(yōu)良菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1樣品采集 羊糞樣品采集于武威普康養(yǎng)殖有限公司、金昌怡泉新禾農(nóng)牧股份有限公司、甘肅欣海牧草飼料科技有限公司。取羊養(yǎng)殖場新鮮羊糞和堆肥升溫期羊糞樣品,帶回實(shí)驗(yàn)室后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2培養(yǎng)基 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)培養(yǎng)基[14],赫奇遜氏(Hutchinson)培養(yǎng)基[15],LB培養(yǎng)基[16],產(chǎn)酶培養(yǎng)基[17]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1纖維素降解菌的富集 稱取采集的樣品10 g,加入至90 mL無菌生理鹽水中,28℃、140 r·min-1搖床振蕩2 h,靜置30 min后,吸取10 mL上清液,加入至90 mL赫奇遜氏培養(yǎng)基中,傳代培養(yǎng),直至濾紙條崩解效果穩(wěn)定。

1.2.2纖維素降解菌的分離純化 取降解濾紙條效果穩(wěn)定的培養(yǎng)液,使用無菌生理鹽水分稀釋1 000倍,稀釋完成后,移取130 μL涂布于LB培養(yǎng)基上。倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中,黑暗條件下培養(yǎng),待平板長出菌落后,挑取單菌落于LB培養(yǎng)基上,通過四區(qū)劃線法進(jìn)行分離、純化培養(yǎng)。

1.2.3纖維素降解菌的初篩 將已經(jīng)純化的菌株接種于CMC-Na培養(yǎng)基中,每個菌株3個重復(fù)。在28℃下培養(yǎng)生長出菌落,使用1 mg·mL-1的剛果紅溶液染色20 min,倒去剛果紅溶液,加入1 moL·L-1的NaCl溶液,15 min后倒去NaCl溶液,觀察并記錄培養(yǎng)基上透明圈直徑(D)與菌落(d)直徑,初步篩選出具有纖維素降解能力的菌株。

1.2.4纖維素降解菌濾紙崩解試驗(yàn) 取初篩得到的纖維素降解菌接種于赫奇遜氏培養(yǎng)基中,加入1 cm×5 cm無淀粉濾紙條(Whatman),每個菌株3次重復(fù)。28℃,150 r·min-1搖床培養(yǎng)7 d,依據(jù)濾紙條崩解程度,篩選優(yōu)良纖維素降解菌。

1.2.5纖維素降解菌酶活力測定 取篩選出的菌懸液以1%接種量接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,28℃,180 r·min-1培養(yǎng)4 d,發(fā)酵液4 000 r·min-1離心10 min后取上清液作為粗酶液。粗酶液與無淀粉濾紙(Whatman)、脫脂棉、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)和水楊苷四種底物反應(yīng)的產(chǎn)物與3,5-二硝基水楊酸(DNS)溶液發(fā)生氧化還原反應(yīng),在540 nm波長下比色測定還原糖量,根據(jù)線性關(guān)系測定全酶(FPA)、外切葡聚糖酶(C1)、內(nèi)切葡聚糖酶(CX)和β-葡萄糖苷酶(β-Gase)活力,改進(jìn)已有的方法[18],酶活力單位為U·mL-1,定義為每分鐘轉(zhuǎn)化底物生成1 mmol葡萄糖所需的酶量。

1.2.6秸稈降解率測定 將小麥秸稈50℃烘干至恒重,粉碎過40目篩,以2%的量在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中加入秸稈,接種10%菌液,28℃,150 r·min-1培養(yǎng)30 d。每個菌株3次重復(fù),設(shè)置不加菌懸液為空白對照。將培養(yǎng)物5 000 r·min-1離心10 min,棄上清液,用蒸餾水反復(fù)清洗,直至無菌體,80℃烘至恒重,使用失重法計(jì)算秸稈降解率。

1.3 優(yōu)良纖維素降解菌株初步鑒定

選取篩選的優(yōu)良纖維素降解菌株,使用TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR試劑,提取DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增[19]。擴(kuò)增產(chǎn)物由北京擎科生物科技有限公司測序。將測序結(jié)果與NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中已有序列進(jìn)行比對,利用MEGA 11軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,明確菌株分類學(xué)地位,并將序列上傳至NCBI GenBank獲取登錄號。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2021軟件整理數(shù)據(jù),Origin 2021繪圖,采用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行One-Way ANOVA統(tǒng)計(jì)分析和Duncan極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。相關(guān)性分析采用線性回歸(y=ax+b)及多元回歸(y=ax1+bx2+cx3+d)。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌的富集、分離與純化

以無淀粉濾紙條作為唯一碳源傳代馴化培養(yǎng),待降解濾紙條效果穩(wěn)定之后,對菌液進(jìn)行稀釋涂布分離,將分離得到的單菌株進(jìn)行四區(qū)劃線純化,共得到26株純化菌株,將菌株接種于斜面培養(yǎng)基中,保存。

2.2 纖維素降解菌的初篩

接種菌株于CMC-Na培養(yǎng)基中,剛果紅染色后,發(fā)現(xiàn)共有7株菌透明圈直徑與菌株直徑比值大于3,1株菌透明圈直徑與菌株直徑比值大于5。D/d比值越大,說明該菌株產(chǎn)纖維素酶活性較高或該菌株產(chǎn)酶量較大,該比值可作為初步篩選優(yōu)良纖維素降解菌株的依據(jù),由表1可知,菌株n3-6、Jc、En1-1、L3-1、n3-3、n3-4和Ja菌落直徑與透明圈直徑比值較高,相較于其他菌株,產(chǎn)纖維素酶能力更高或產(chǎn)酶量更大,選擇上述菌株進(jìn)一步測定產(chǎn)酶能力及秸稈降解率。

表1 纖維素降解菌初篩結(jié)果Table 1 Results of the initial screening of cellulose degrading bacteria

2.3 濾紙條崩解試驗(yàn)

由表1可知,菌株Ja與菌株En1-1對濾紙條的降解效果最好,降解后濾紙條呈現(xiàn)糊狀;菌株L3-1、n3-3、n3-4、Jc和n3-6對濾紙條的降解效果次之,濾紙條降解效果呈不定狀,大部分已被降解。濾紙條降解效果還受到降解時間的影響,菌株n3-6與菌株Jc培養(yǎng)2 d后開始逐步降解,4 d后濾紙條已降解為近似糊狀,6 d時,濾紙條已完全降解,呈現(xiàn)糊狀。其他5株菌在第4 d時濾紙條開始逐步降解,分解為片狀,7 d時降解為不定狀,80%被降解。

2.4 纖維素降解菌酶活力的測定

纖維素類物質(zhì)的降解主要依靠纖維素酶的作用,由圖1可知,全酶活性最高的菌株為En1-1,達(dá)到2.83 U·mL-1,其次為菌株Jc,兩菌株全酶活性差異顯著(P<0.05)。菌株n3-3全酶活性最低,為1.03 U·mL-1。菌株En1-1外切酶活性最高,為5.78 U·mL-1,與其他菌株外切酶活性均差異顯著(P<0.05),其次為菌株L3-3與菌株Ja,但兩菌株外切酶活性無顯著性差異,菌株n3-3外切酶活性最低為3.42 U·mL-1。內(nèi)切酶活性最高的為菌株En1-1,值為3.25 U·mL-1,菌株n3-3內(nèi)切酶活力最低為1.24U·mL-1。菌株En1-1內(nèi)切酶活性與其他菌株內(nèi)切酶活性具有顯著差異(P<0.05)。β-葡萄糖苷酶活性最高的菌株為En1-1,與其他菌株β-葡萄糖苷酶活性差異顯著(P<0.05),β-葡萄糖酶活性最低的菌株為n3-3。

圖1 菌株酶活性Fig.1 Enzyme activity of strains注:誤差線為標(biāo)準(zhǔn)誤。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同Note:The error line is standard error. Different lowercase letters indicate a significant difference between different strains.The same as below

2.5 秸稈降解測定

由圖2可知,菌株En-1秸稈降解率顯著高于其他菌株,值為28.53%(P<0.05)。菌株Ja秸稈降解率次之,為24.58%,除L3-1外與其他菌株秸稈降解率均差異顯著(P<0.05)。其次為菌株L3-1,降解率為23.17%。菌株n3-3秸稈降解率最低,為19.36%。

圖2 菌株秸稈降解率Fig.2 Straw degradation rate of strains

2.6 優(yōu)良纖維素降解菌株鑒定

對篩選得到的7株優(yōu)良纖維素降解菌株進(jìn)行16S rRAN鑒定,比對同源序列,并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。菌株L3-1基因序列與S.kummerowiaeCCBAU 25048T相似度高達(dá)99.27%、菌株n3-4基因序列與S.yambaruensisMS4T相似度達(dá)97.91%、菌株Jc基因序列與S.terraesubsp.UmmariensisUI2T相似度達(dá)98.77%、菌株n3-6基因序列與S.terraesubsp.TerraeNBRC 15098T相似度達(dá)98.70%、菌株n3-3基因序列與P.suwonensis4M1T相似度達(dá)97.79%、菌株Ja基因序列與C.udaDSM 20107T相似度達(dá)97.79%、菌株En1-1基因序列與D.fermentansDSM18053T相似度高達(dá)99.05%。

2.7 菌株纖維素酶活性與秸稈降解率相關(guān)性分析

相關(guān)性分析表明(圖4),菌株對秸稈的降解率與菌株產(chǎn)4種纖維素酶的活性呈正相關(guān)關(guān)系,酶活性越高,降解率越高。其中,菌株秸稈降解率隨外切酶活性的增加,增長幅度最大(y=3.58x+7.14,R2=0.79,P<0.000 1);隨內(nèi)切酶活性的增加,增長幅度次之(y=3.20x+16.33,R2=0.6,P<0.000 1);隨β-葡萄糖苷酶活性的增加,增加幅度(y=4.41x+15.31,R2=0.66,P<0.000 1);隨全酶活性的增加,增加幅度最小(y=3.44x+16.85,R2=0.561 9,P<0.000 1)。對4種酶與降解率進(jìn)行多元回歸分析發(fā)現(xiàn),菌株秸稈降解能力與4種酶活性存在密切相關(guān)(R2=0.80,P<0.000 1),其中,內(nèi)切酶(P=0.09)與外切酶(P=0.10)對菌株秸稈降解能力的貢獻(xiàn)較大,而全酶(P=0.27)與β-葡萄糖苷酶(P=0.50)貢獻(xiàn)較小。因此,纖維素內(nèi)切酶與外切酶是菌株降解秸稈的主要驅(qū)動力。

圖4 菌株秸稈降解率與纖維素酶活性相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis between straw degradation rate and cellulase activity of strains

3 討論

傳統(tǒng)堆肥主要依賴堆體內(nèi)部的微生物,通過添加外源微生物菌劑,能夠在一定程度上改善堆肥初始時期微生物的數(shù)量與結(jié)構(gòu),從而加快堆肥進(jìn)程[20-21]。添加外源微生物,可影響堆肥過程中微生物的代謝,進(jìn)而提升堆肥產(chǎn)品的品質(zhì)。篩選具有優(yōu)良纖維素降解能力的菌株,可以顯著提升堆肥過程中纖維素類物質(zhì)的降解速率[22]。本研究從新鮮羊糞中共分離出26株具有纖維素降解能力的菌株,通過剛果紅染色法及濾紙條崩解試驗(yàn),篩選出7株具有較高纖維素降解能力的菌株,對其秸稈降解能力測定,發(fā)現(xiàn)其降解能力均在15%以上。濾紙是一類具有較為適中聚合度和結(jié)晶度的天然結(jié)晶類纖維素,在纖維素類降解菌的篩選中被廣泛使用[23]。濾紙中的結(jié)晶纖維素的結(jié)晶區(qū)是一種不溶性的剛性結(jié)構(gòu),相較于一般的天然纖維素類物質(zhì)更難以降解,因此,利用結(jié)晶纖維素為唯一碳源并通過測定菌株的秸稈降解率,來檢驗(yàn)其降解纖維素類物質(zhì)的真實(shí)能力。菌株通過產(chǎn)生的細(xì)胞表面酶對纖維素類物質(zhì)進(jìn)行降解,但需要附著在纖維素類物質(zhì)表面才能降解[24]。因此,菌株的纖維素酶活力大小只能反映出其胞外酶活力大小,不能反映真實(shí)的纖維素降解能力。需通過測定菌株的秸稈降解能力,來反映菌株真實(shí)的纖維素降解能力[25]。纖維素是一系列通過β-1,4糖苷鍵連接在一起的葡萄糖基長鏈,其中各個葡萄糖基與相連的其他葡萄糖基呈 180°夾角,纖維素聚合體長鏈中重復(fù)的最小單位是纖維二糖[26]。Ries等[27]發(fā)現(xiàn)纖維素酶主要由三種類型組成,包括內(nèi)切葡聚糖酶(CX酶)、外切葡聚糖酶(C1酶)和β-葡萄糖苷酶,3種酶組成復(fù)合酶系。在酶活性測定過程中,一般測定其中某一特定成分,而實(shí)際的降解過程則有多種組分共同催化水解的結(jié)果[28]。本研究對菌株酶活性測定發(fā)現(xiàn),菌株En1-1全酶活力最高,其次為菌株Jc,濾紙條降解能力最高的為菌株En1-1,但秸稈降解率除En1-1菌株外,降解效果最好的為菌株Ja。劉東陽等[29]發(fā)現(xiàn)蠟狀芽孢桿菌降解小麥秸稈的能力最強(qiáng),但其纖維素酶活力并不高,由此可知,纖維素酶活力與纖維素降解能力并不一定相同。其原因可能為菌株在不同生長基質(zhì)中,產(chǎn)纖維素酶能力并不相同。濾紙與天然的纖維素類物質(zhì)仍然存在一定的差異。因此,菌株的降解性能仍需要通過其他指標(biāo),如秸稈降解率等來進(jìn)行綜合的分析評價(jià)。外切酶中,菌株En1-1外切酶活性最高,內(nèi)切酶與β-葡萄糖苷酶活性中,最高的也為菌株En1-1。通過對纖維素降解率與纖維素酶活性相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)纖維素降解過程中,纖維素內(nèi)切酶與纖維素外切酶為主要的驅(qū)動因素。這與梅新蘭等[30]的研究結(jié)果相似,江高飛等[31]則認(rèn)為纖維素內(nèi)切酶是菌株降解玉米秸稈的關(guān)鍵驅(qū)動因素。

通過對菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn),7株菌中具有較強(qiáng)的纖維素降解能力的菌株L3-1與n3-4為山原申氏菌和雞眼草申氏菌[32]。本研究發(fā)現(xiàn)申氏桿菌具有較強(qiáng)的纖維素降解能力,有研究報(bào)道,申氏桿菌具有降解N-?；呓z氨酸內(nèi)酯的能力,對植物的病害具有一定的防控能力[33]。菌株En1-1鑒定為植物內(nèi)生成對桿菌,有研究首次從母乳喂養(yǎng)的嬰兒糞便中分離,發(fā)現(xiàn)其具有降低膽固醇和一定的抗癌活性,對人體無致病性[34]。菌株Ja鑒定為潮濕纖維單胞菌,纖維單胞菌是一類革蘭氏陽性細(xì)菌,好氧或兼性厭氧細(xì)菌,該類菌株不但能產(chǎn)生多種纖維素相關(guān)酶類,還具有沉淀重金屬離子等功能,具有優(yōu)良的纖維素降解能力,能夠應(yīng)用與堆肥試驗(yàn)中[35-36]。菌株n2-3與菌株n3-6鑒定為鞘氨醇菌屬,孫元烽[37]在羊糞中分離出鞘氨醇菌屬菌株,應(yīng)用與羊糞堆肥發(fā)酵過程中,顯著縮短了堆肥發(fā)酵周期,提升了總養(yǎng)分含量,具有較好的應(yīng)用潛力。菌株n3-3鑒定為水原假黃單胞菌,Weon等[38-39]從棉花廢棄物堆肥中分離出假單胞菌屬。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),假單胞菌屬具有一定的纖維素降解能力,能夠應(yīng)用于后續(xù)堆肥試驗(yàn)中,且對人體無致病性。菌株Ja與菌株n3-3具有一定的纖維素降解能力,菌株En1-1具有較高的纖維素產(chǎn)酶能力及秸稈降解能力,后續(xù)可以應(yīng)用于羊糞堆肥發(fā)酵中,或與其他菌株復(fù)配為復(fù)合菌系,提升降解效果。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)共分離出26株菌,復(fù)篩得到7株,測定其產(chǎn)酶能力以及秸稈降解能力,發(fā)現(xiàn)7株菌均具有較好的降解性能,降解率均在15%以上。經(jīng)鑒定分別為山原申氏菌、雞眼草申氏菌、土地鞘氨醇盒菌、植物內(nèi)生成對桿菌、潮濕纖維單胞菌、水原假黃單胞菌。試驗(yàn)分析了菌株產(chǎn)纖維素酶活性與秸稈降解效果之間的關(guān)系,明確纖維素內(nèi)切酶與外切酶是菌株降解秸稈的主要驅(qū)動因素。本試驗(yàn)篩選的菌株可為堆肥微生物菌劑的制作提供良好的菌劑儲備資源,有望應(yīng)用于羊糞堆肥中并取得較好的效果。