馬秉智，梁瑩瑩，王海洋，唐永和，李 棟，赫 軍 （中日友好醫(yī)院藥學部, 北京 100029）

實脾消水浸膏為中日友好醫(yī)院的自制中藥制劑，來源于中西醫(yī)結合腫瘤內科李佩文教授的經(jīng)驗方“消水Ⅱ號”，處方由黃芪、車前子、紅花等組成，具有益氣活血、滲濕利水的功能，臨床用于癌性胸腹水的輔助治療，能明顯的延長晚期腫瘤患者的生存期，提高晚期腫瘤患者的生存質量[1-3]。到目前為止，該制劑在院內已使用近三十年，由于這種浸膏劑使用不方便，因此，根據(jù)臨床需要，本課題組將其改為凝膠貼膏劑。為了更好地控制它的質量，本文采用薄層色譜法（TLC）對其中的黃芪、車前子、莪術、桂枝、豬苓、預知子進行定性鑒別，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法對制劑中君藥黃芪所含成分黃芪甲苷進行含量測定，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ultimate 3 000 高效液相色譜儀、Q ExactiveTM組合型四級桿Orbitrap 質譜儀（賽默飛公司）；BSA224S 型電子天平（德國賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；DZKW-4 電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；RE-52AA 旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；ZF-90 型暗箱式紫外投射儀（上海顧村電光儀器廠）；硅膠 G 薄層板（青島海洋化工分廠）。

1.2 試藥

實脾消水凝膠貼膏（自制，批號：20180102、20180115、20180203）；黃芪甲苷（批號：110781-201616）、京尼平苷酸（批號：111828-201604）、毛蕊花糖苷（批號：111530-201713）、吉馬酮（批號：111665-201605）、麥角甾醇（批號：111845-201403）、桂枝對照藥材（批號：121191-201605）、預知子對照藥材（批號：121492-201102）購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，水為高純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 TLC 鑒別

2.1.1 黃芪

取本品1 片，除去保護膜后，稱取藥膏10 g，加甲醇100 ml，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水30 ml 使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取2 次，每次30 ml，合并正丁醇液，用水洗滌2 次，每次20 ml，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇5 ml 使溶解，加于中性氧化鋁柱（100～120 目，5 g，內徑為10～15 mm）上，用40%甲醇100 ml 洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇0.5 ml 使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。取除黃芪外的其他藥材制成凝膠貼膏，按照上述方法制備黃芪的陰性對照溶液。按照《中國藥典》2020 年版的薄層色譜法[4]，吸取供試品溶液、陰性溶液各6 μl，黃芪甲苷對照品溶液1 μl，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13:5:0.6)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的橙黃色熒光斑點，且陰性無干擾，結果見圖1A。

2.1.2 車前子

取本品1 片，除去保護膜后，稱取10 g，加甲醇100 ml，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加熱水20 ml 使溶解，加于D101 型大孔吸附樹脂柱（內徑為1.5 cm，柱高為12 cm）上，用水100 ml 洗脫，棄去水液，再用30%乙醇100 ml 洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇2 ml 使溶解，作為供試品溶液。另取京尼平苷酸、毛蕊花糖苷對照品，加甲醇分別制成每1 ml 含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。再取除車前子外的其他藥材制成凝膠貼膏，按照上述方法制備車前子陰性溶液。按照《中國藥典》2020 年版的薄層色譜法，吸取上述三種溶液各10 μl，分別點于同一硅膠 GF254薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（18:2:1.5:1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，且陰性無干擾，結果見圖1B。

2.1.3 莪術

取本品1 片，除去保護膜，稱取藥膏10 g，加甲醇100 ml，加熱回流1 h，過濾，濾液揮干，殘渣加水30 ml 使溶解，加石油醚（30～60 ℃）振搖提取2 次，每次20 ml，合并石油醚液，蒸干，殘渣加無水乙醇4 ml 使溶解，作為供試品溶液。另取吉馬酮對照品，加無水乙醇制成每1 ml 含0.4 mg 的溶液，作為對照品溶液。另取除莪術外的其他藥材制成凝膠貼膏，按照上述方法制備莪術陰性對照溶液。按照《中國藥典》2020 年版的薄層色譜法，吸取上述三種溶液各10 μl，以石油醚（30～60 °C）-丙酮-乙酸乙酯（94∶5∶1)為展開劑，點于同一硅膠G 薄層板上，展開，取出，晾干，噴以2 %香草醛硫酸溶液，在105 °C 加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，且陰性無干擾，結果見圖1C。

2.1.4 桂枝

取本品1 片，除去保護膜，稱取藥膏10 g，加甲醇100 ml，加熱回流1 h，濾過，濾液揮干，殘渣加熱水30 ml 使溶解，加三氯甲烷振搖提取2 次，每次30 ml，合并三氯甲烷液，蒸干，殘渣加乙酸乙酯2 ml使溶解，作為供試品溶液。另取桂枝對照藥材2 g，加乙醚10 ml，浸泡30 min，時時振搖，濾過，濾液揮干，殘渣加三氯甲烷l ml 使溶解，作為對照藥材溶液[5]。取除桂枝外的其他藥材制成凝膠貼膏，按照上述方法制備桂枝陰性對照溶液。按照《中國藥典》2020 年版的薄層色譜法，吸取上述三種溶液各20 μl，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（60～90 °C）-乙酸乙酯（17:3）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，且陰性無干擾，結果見圖1D。

2.1.5 豬苓

取本品1 片，除去保護膜，稱取藥膏10 g，加甲醇100 ml，加熱回流1 h，過濾，濾液蒸干，殘渣加熱水30 ml 使溶解，加三氯甲烷振搖提取2 次，每次30 ml，合并三氯甲烷液，蒸干，殘渣加甲醇1.5 ml 使溶解，作為供試品溶液。另取麥角甾醇對照品，加甲醇制成每l ml 含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。取除豬苓外的其他藥材制成凝膠貼膏，按照上述方法制備豬苓陰性對照溶液。按照《中國藥典》2020 年版的薄層色譜法，吸取供試品溶液、陰性對照溶液各20 μl、對照品溶液1 μl，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（60～90 °C）-乙酸乙酯（3∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%香草醛硫酸溶液，在105°C 加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，且陰性無干擾，結果見圖1E。

2.1.6 預知子

取本品1 片，除去保護膜，稱取藥膏10 g，加甲醇100 ml，加熱回流1 h，過濾，濾液揮干，殘渣加熱水20 ml 使溶解，加于D101 型大孔吸附樹脂柱（內徑為1.5 cm，柱高為12 cm）上，用水100 ml 洗脫，棄去水液，再用90%乙醇100 ml 洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇2 ml 使溶解，作為供試品溶液。另取預知子對照藥材1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇100 ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用75%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液10 ml，蒸干，殘渣加甲醇l ml 使溶解，作為對照藥材溶液。取除預知子外的其他藥材制成凝膠貼膏，按照上述方法制備預知子陰性對照溶液。按照《中國藥典》2020 年版的薄層色譜法，吸取供試品溶液、陰性對照溶液各12 μl，對照藥材溶液2 μl，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13:4:1) 的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105°C 加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，且陰性無干擾，結果見圖1F。

2.2 黃芪甲苷含量測定

2.2.1 色譜和質譜條件

色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC?BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流速：0.2 ml/min；柱溫：40 ℃；進樣量：1 μl；流動相：A 為含0.1%甲酸的乙腈溶液，B 為0.1%甲酸溶液，梯度洗脫（0～12 min，10%→90% A；12～13 min，90% A；13～13.5 min，90%→10% A；13.5～16 min，10% A）。

質譜條件：電噴霧離子（ESI）源，正離子檢出模式，離子源溫度：350 ℃，噴霧電壓：3.5 kV，S-Lens RF 電壓：50 V，毛細管溫度：320 ℃，鞘氣和輔助氣均為高純氮氣（純度>99.99%），鞘氣壓力：45 arb：輔助氣壓力：10 arb。數(shù)據(jù)采集采用一級全掃描（m/z783.47～787.47），分辨率：70 000。

2.2.2 對照品儲備液的制備

精密稱取黃芪甲苷對照品11.0 mg，置于100 ml量瓶中，加60%甲醇適量溶解并定容至刻度，搖勻，即得對照品儲備液。精密量取黃芪甲苷對照品儲備液25 ml，置于50 ml 量瓶中，用60%甲醇定容，即得黃芪甲苷對照品溶液（每1 ml 溶液含黃芪甲苷55 μg）。

2.2.3 供試品溶液的制備

揭去實脾消水凝膠貼膏覆膜和背襯材料，取膏體約5.0 g，精密稱定，加入甲醇50 ml，稱定重量，超聲提取30 min，冷卻到室溫，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備

按處方工藝制備不含黃芪的實脾消水凝膠貼膏陰性樣品，按“2.2.3”項下方法制備陰性對照溶液。

2.2.5 方法專屬性考察

分別吸取黃芪甲苷對照品儲備液、供試品溶液和陰性對照溶液各1 μl，按“2.2.1”項下色譜和質譜條件進行測定。在正離子全掃描模式下黃芪甲苷色譜峰分離度良好，對照品及供試品溶液目標峰的保留時間一致，且陰性對照溶液無干擾（圖2）。

2.2.6 線性關系考察

分別精密量取黃芪甲苷對照品溶液0.5、1、2、4、6 ml，置于10 ml 量瓶中，用60%甲醇定容至刻度，按“2.2.1”項下色譜和質譜條件進行測定，進樣1 μl，記錄峰面積。以黃芪甲苷的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程Y=0.967 7X+14.86，r＝0.999 9，結果表明黃芪甲苷質量濃度在2.75～33 μg/ml 范圍內與峰面積積分值呈良好的線性關系。

2.2.7 精密度試驗

精密吸取同一對照品溶液1.0 μl，連續(xù)進樣6 次，測定峰面積，結果黃芪甲苷峰面積的RSD 為2.42%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復性試驗

取批號為20180102 的樣品6 份，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下條件進樣測定峰面積，并計算含量，結果黃芪甲苷的含量分別為10.15、10.67、10.56、10.28、10.46、10.39 μg/g，RSD 為1.81%，表明該方法重復性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗

取“重復性試驗”項下其中一份供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h 分別進樣測定峰面積，結果黃芪甲苷峰面積的RSD 為2.53%，表明供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗

取實脾消水凝膠貼膏（批號：20180102）6 份，每份約2.5 g，精密稱定，分別精密加入黃芪甲苷對照品溶液（5.5 μg/ml）1 ml，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定峰面積，并計算回收率，結果平均回收率為102.79%，RSD 為2.22%。

2.2.11 樣品測定

分別取3 批次實脾消水凝膠貼膏，按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜和質譜條件檢測，測定峰面積，計算黃芪甲苷的含量，結果見表1。

表1 黃芪甲苷含量測定結果(μg/g，n=3)

3 討論

在對實脾消水凝膠貼膏進行薄層鑒別的過程中，由于凝膠貼膏中含有水溶性高分子化合物，如果用水提取，膏體就會吸水膨脹變粘，因此，本文選擇甲醇作為供試品前處理提取溶劑。另外，為了富集特征化學成分，一些極性不大的化學成分可以采用萃取的方法，一些極性較大的化學成分可以采用大孔樹脂柱層析的方法。本實驗中筆者發(fā)現(xiàn)，10%乙醇[6]、30%乙醇[7]、60%乙醇[8]、90%乙醇大孔樹脂洗脫液中分別含有紅花、車前子、桃仁、預知子的特征成分，但是利用薄層色譜法進行鑒別時，紅花的分離效果較差，桃仁陰性有干擾，故本文未將紅花及桃仁列入質量標準。

雖然蒸發(fā)光散射檢測器在那些弱或者無紫外吸收的中藥成分分析中具有獨特而不可替代的作用（例如黃芪甲苷的測定），但是蒸發(fā)光散射檢測器在分析中藥成分時還有許多不盡人意的地方[9]。課題組前期實驗時也試過蒸發(fā)光散射檢測器，為了使黃芪甲苷分離效果好，其保留時間需達到44 min左右，而且重現(xiàn)性差。而采用UPLC-MS 的方法，黃芪甲苷在10 min 內即可測定完，且分離效果好，故UPLC-MS 在不影響分離效果的情況下大大提高了樣品中各成分的分析速度[10-11]。另外，在色譜和質譜條件的優(yōu)化中，本實驗考察了不同比例流動相（0.1%甲酸的乙腈-0.1%甲酸溶液）的分離效果，最終確定梯度洗脫的方式。因此，本研究采用UPLC-MS 的方法測定實脾消水凝膠貼膏中黃芪甲苷的含量，為實脾消水凝膠貼膏的質量控制提供了一種快速、靈敏、穩(wěn)定、可靠的方法。

實脾消水浸膏為傳統(tǒng)浸膏劑，處方有十二味藥，其質量標準除了常規(guī)檢查項外，主要是【鑒別】項，要求對黃芪、牽牛子、車前子、桂枝和冰片進行薄層色譜鑒別。本文建立了實脾消水凝膠貼膏的質量控制方法，在原標準的基礎上增加了【含量測定】項，并在【鑒別】項下增加了莪術、豬苓、預知子的薄層色譜鑒別，為實脾消水浸膏的二次開發(fā)奠定了一定的基礎。