陳思敏，凌期盛，張賽龍，繆朝玉 （海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥理學(xué)教研室, 上海, 200433）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulceractive colitis, UC）屬于炎癥性腸病的一種，有著較高的發(fā)病率，其特征為損傷性炎癥，近年來有關(guān)其病因及發(fā)病機(jī)制的研究受到廣泛關(guān)注，但至今仍不明確[1]。對于潰瘍性結(jié)腸炎的治療目前多采用手術(shù)、抗感染、糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑等治療，但上述治療手段均為對癥治療，且藥物長期使用的不良反應(yīng)很容易造成疾病復(fù)發(fā)[2]。因此，探究潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制，將為今后治療藥物的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

Metrnl（Meteorin-like）是近年來新發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，也叫Cometin, Subfatin 或是IL-39[3-4]。Jorgensen 等[4]在2012 年將Metrnl 描述為類似于Meteorin（Metrn）的神經(jīng)營養(yǎng)因子。Metrnl 基因開放閱讀框包含4 個外顯子，由936 個堿基對編碼311 個氨基酸。Metrnl 蛋白包含45 個N 端信號肽序列，切除信號肽后的266 個氨基酸構(gòu)成分子量約為30 000 的成熟蛋白分子，整個蛋白分子沒有穿膜區(qū)域，是一種分泌蛋白。到目前為止，關(guān)于Metrnl功能的研究較少，我們前期針對該蛋白相關(guān)研究確認(rèn)Metrnl 為一種新的細(xì)胞因子，闡明了Metrnl 通過PPARγ 信號通路介導(dǎo)胰島素的增敏作用的重要機(jī)制[5]。Jorgensen 等[4]報道了Metrnl 在神經(jīng)突觸生長和成神經(jīng)細(xì)胞遷移中的神經(jīng)營養(yǎng)活性。Watanabe等[6]報道，Metrnl 是潛伏過程（Latent process，LP）基因，可用于細(xì)胞分化和神經(jīng)突觸延伸。脂肪組織Metrnl 能促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化、改善代謝、抑制炎癥從而調(diào)節(jié)脂肪功能，對抗肥胖引起的胰島素抵抗[7]。通過檢測Metrnl 在各種組織中的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)Metrnl 在人和小鼠胃腸組織中，特別是在腸上皮細(xì)胞中都高度表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)腸上皮Metrnl 敲除后可以通過抑制腸上皮細(xì)胞的自噬而加重潰瘍性結(jié)腸炎，提示 Metrnl 是潰瘍性結(jié)腸炎的治療靶點[8]。

腸道微環(huán)境形成了良好的微生物群棲息地，腸道微生物群被認(rèn)為是人體的重要器官，越來越多的研究將這種微生物環(huán)境與胃腸道疾病聯(lián)系起來。腸道菌群在潰瘍性結(jié)腸炎中起著重要作用，如在無菌狀態(tài)下，無法制備出某些小鼠結(jié)腸炎模型（如IL-10 缺陷型小鼠等）[9-10]。也有研究報道，在治療潰瘍性結(jié)腸炎患者時，聯(lián)合使用抗生素也顯示出了較好療效[11]。此外，與健康人群相比，潰瘍性結(jié)腸炎患者的腸道菌群組成也發(fā)生了顯著變化[12]。但由于人類腸道菌群的復(fù)雜性和多樣性，目前尚未清楚某些特定菌屬與潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。

因此，本研究聚焦?jié)冃越Y(jié)腸炎，從腸道微生態(tài)角度出發(fā)，探究腸上皮Metrnl 對于潰瘍性結(jié)腸炎的作用以及對腸道菌群調(diào)節(jié)機(jī)制的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和儀器

雄性C57 小鼠（8 周齡，20 只，16～20 g），上海西普爾-必凱實驗動物有限公司（生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2013-0016）。Villin-cre 小 鼠[B6.Cg-Tg(Vil1in-cre)1000Gum/J，021504]，2 只，16～20 g，美國JAX 公司（北京澄天生物科技有限公司代理），生產(chǎn)許可證號：SYXK（京）2018-0016），用于產(chǎn)生腸上皮細(xì)胞特異性Metrnl 基因敲除小鼠（Metrnl(-/-)）。所有小鼠飼養(yǎng)于相對潔凈環(huán)境下，使用獨立通風(fēng)系統(tǒng)（individual ventilated cages, IVC）動物房，溫度恒定（22～26 ℃），室內(nèi)明暗交替12 h（08:00 至20:00照明），相對濕度為40%～70%，籠內(nèi)維持正壓20～25 Pa，每小時換氣60～70 次。所有實驗動物的使用，都經(jīng)過海軍軍醫(yī)大學(xué)動物管理機(jī)構(gòu)的同意和認(rèn)證，符合實驗動物飼養(yǎng)及相關(guān)管理規(guī)定。所有動物實驗均按照美國國家衛(wèi)生研究院實驗動物的護(hù)理和使用指南進(jìn)行，并得到海軍軍醫(yī)大學(xué)動物倫理委員會的批準(zhǔn)。IVC 系統(tǒng)購自上海鳴勵實驗室科技發(fā)展有限公司。TRIzol 試劑（15 596 026），美國Invitrogen 公司；葡聚糖硫酸鈉鹽（dextran sodium sulfate，DSS），MFCD00081551，分子量36 000～50 000，美國MP 公司，引物，生工生物工程有限公司；包埋機(jī)（JB- L5，德國徠卡有限公司）；切片機(jī)（RM2126，德國徠卡有限公司）；RT-PCR 儀器（ABI 7500 系統(tǒng)，美國賽默飛公司）；糞便DNA 提取試劑盒（QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit，Qiagen,Hilden, 德國）；紫外微量分光光度計（NanoDrop 2000，Thermo Scientific, 美國）；DNA 凝膠回收試劑 盒（AxyPrep DNA GelExtraction Kit，Axygen Biosciences, 美國）；微型熒光計（QuantiFluor-ST，Promega, 美國）；測序儀（Illumina MiSeq，Illumina,美國）。

1.2 腸上皮細(xì)胞特異性Metrnl 基因敲除小鼠的制備

首先按照本課題組已報道的方法[5]制備Metrnlloxp/loxp小鼠。根據(jù)報道的Metrnl(-/-)小鼠的繁殖策略[13]，即將Metrnlloxp/loxp小鼠與購買的Villin-Cre 小鼠進(jìn)行交配，產(chǎn)下后代小鼠基因型為Metrnlloxp/wtVillin-Cre。將Metrnlloxp/wtVillin-Cre 小鼠和Metrnlloxp/loxp小鼠交配，產(chǎn)生下一代Metrnlloxp/loxpVillin-Cre 小鼠。繼續(xù)與Metrnlloxp/loxp交配，產(chǎn)下的后代，經(jīng)基因型鑒定分別為Metrnlloxp/loxpVillin-Cre（Metrnl(-/-)）和Metrnlloxp/loxp（Metrnl(+/+)）。

1.3 RT-PCR 定量腸道組織Metrnl mRNA 表達(dá)

按照本課題組已報道的方法[3]，使用TRIzol 試劑從腸道組織中提取總RNA，并使用ABI 7 500 系統(tǒng)進(jìn)行RT-PCR。最終的20 μl 反應(yīng)混合物包括10 μl SYBR Green，2 μl cDNA 模板和1 μl 引物。通過重復(fù)反應(yīng)確定平均閾值循環(huán)（Ct），將靶基因表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH，并使用ΔΔCT 方法獲得定量測量結(jié)果。Metrnl 上游引物（F）CTGGAGCAGGGAGG CTTATTT，下游引物（R）GGACAACAAAGTCACT GGTACAG；GAPDH 上游引物（F）GTATGACTC CACTCACGGCAAA，下游引物（R）GGTCTCGCTC CTGGAAGATG。

1.4 DSS 誘導(dǎo)腸炎模型制備

雄性C57 小鼠（8 周齡）于實驗室適應(yīng)2 周后，按照本課題組已報道的方法進(jìn)行模型制備[7]，將DSS 溶于水中，分別至終濃度為3%和1%，讓小鼠自由飲用。

小鼠潰瘍性結(jié)腸炎疾病程度評分，按照我們之前已報道的的評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分[8]，對體重下降程度、大便性狀、血便情況共3 部分分別進(jìn)行評分，然后進(jìn)行加和，計算總分?jǐn)?shù)。具體評分標(biāo)準(zhǔn)如下（表1）。

表1 小鼠潰瘍性結(jié)腸炎疾病程度評分表

1.5 結(jié)腸長度檢測及HE 染色

小鼠處死后，取整個結(jié)腸部位，測量長度進(jìn)行比較。然后將結(jié)腸下段部位組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片機(jī)切至4 μm 的切片，按照之前的實驗方法[14]，進(jìn)行HE 染色，染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察炎癥細(xì)胞浸潤情況，組織損傷情況并拍照記錄。

1.6 腸道菌群測定

使用16S 核糖體RNA 基因測序技術(shù)檢測腸道菌群。為了進(jìn)行樣品收集和DNA 提取，從實驗小鼠中收集糞便樣品，并在取樣后3h 內(nèi)將其冷凍在-80°C 下。使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit 進(jìn)行DNA 提取。使用NanoDrop 2000 測量細(xì)菌DNA的濃度。然后，將16S 核糖體RNA 基因測序用于檢測細(xì)菌DNA?；虻腣3-V4 區(qū)域使用FastPfu聚合酶通過條形碼索引引物（338F 和806R）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。然后通過AxyPrep DNA GelExtraction Kit，凝膠提取純化擴(kuò)增子，并使用QuantiFluor-ST 進(jìn)行定量。將純化的擴(kuò)增子以等摩爾濃度合并，并使用Illumina MiSeq 儀器進(jìn)行末端配對測序。

1.7 微生物宏基因組學(xué)分析

16S rRNA 測序數(shù)據(jù)由Quantitative Insights Into Microbial Ecology 平臺（V.1.9.1）處理，并進(jìn)行了MegaBLAST 搜索，將生物分類單位的讀數(shù)（OTU）與國家生物技術(shù)信息中心16S rRNA 數(shù)據(jù)庫中的參考序列比對。按照文獻(xiàn)報道的方法[15]進(jìn)行宏基因組學(xué)分析，從16S rRNA 序列推算腸道微生物組的基因組，并且對每個樣品的基因含量進(jìn)行了預(yù)測。

1.8 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 Metrnl(-/-)小鼠未表現(xiàn)結(jié)腸炎癥狀

我們構(gòu)建了腸上皮細(xì)胞特異性Metrnl基因敲除（Metrnl(-/-)）小鼠，并檢測了MetrnlmRNA 在大腸和小腸組織中的表達(dá)。結(jié)果表明，Metrnl(-/-)小鼠中MetrnlmRNA 的表達(dá)在結(jié)腸和小腸組織中極低（圖1A）。HE 結(jié)腸切片顯示Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠之間均無組織損傷和炎癥細(xì)胞浸潤（圖1B）。以上結(jié)果表明，腸上皮細(xì)胞特異性Metrnl 基因敲除后不會誘發(fā)潰瘍性結(jié)腸炎。

圖1 Metrnl(-/-)小鼠未表現(xiàn)出結(jié)腸炎表型

2.2 潰瘍性結(jié)腸炎模型制備條件的選擇

在建立DSS 誘發(fā)的潰瘍性結(jié)腸炎模型之前，為了選擇最佳的觀察時間和DSS 給藥濃度，我們分別選擇3%DSS 和1%DSS 進(jìn)行造模，并觀察了不同DSS 濃度下C57 小鼠的存活時間。結(jié)果顯示，在3%DSS 組的第6 天，出現(xiàn)了小鼠死亡；直至給藥10 d，全部小鼠死亡（圖2A）。在1%DSS 組中，未觀察到小鼠死亡。與對照組相比，3%DSS 組的小鼠體重在第5 天時顯著性降低（P<0.05），而1%DSS 組的體重并無顯著改變（圖2B）。同樣，與對照組相比，3%DSS 組小鼠DAI 增加（P<0.05），結(jié)腸長度顯著性縮短（P<0.05），而1%DSS 組在疾病活動指數(shù)、結(jié)腸長度方面均無明顯變化（圖2CD）。組織形態(tài)學(xué)方面，3%DSS 組表現(xiàn)出結(jié)腸炎表型，具有明顯的組織損傷，而對照組并無明顯變化（圖2E）。因此，我們選擇3%DSS 和5 d 的給藥時間作為后續(xù)實驗條件。

圖2 潰瘍性結(jié)腸炎模型條件的選擇

2.3 Metrnl 缺乏對DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎的影響

給予Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠3%DSS 后，兩組小鼠均表現(xiàn)出潰瘍性結(jié)腸炎癥狀，其特征為持續(xù)的體重減輕、疾病活動指數(shù)增加、血性腹瀉、結(jié)腸長度縮短以及結(jié)腸炎癥（圖3）。在此過程中，在給藥后第5 天時，與Metrnl(+/+)小鼠體重減輕（-8.27±1.32）%相比，Metrnl(-/-)小鼠的體重減輕（-14.92±1.05）%，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05，圖3A）；與Metrnl(+/+)小鼠的疾病活動指數(shù)（6.00±1.63）相比，Metrnl(-/-)小鼠顯著增加至（9.67±1.38）（P<0.05，圖3B）；與Metrnl(+/+)小 鼠 結(jié) 腸 長 度（7.08±0.89 cm）相 比，Metrnl(-/-)小鼠結(jié)腸更短（5.77±0.58 cm）（P<0.05）（圖3D）；為了排除上述差異不是由小鼠攝入不同量的3%DSS 引起的，我們還檢測了兩組小鼠的飲水量。結(jié)果顯示兩組小鼠飲水量之間并無顯著差異（圖3C）。

圖3 Metrnl 敲除后對DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎的影響

2.4 Metrnl 缺乏對DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的菌群平衡的影響

我們通過高通量16S rRNA 基因測序，檢測了Metrnl 對DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型中腸道菌群的影響。應(yīng)用Chao1 豐度估計量（chao1 richness estimator），香農(nóng)多樣性指數(shù)（shannon diversity index），辛普森多樣性指數(shù)（simpson diversity index）三種指標(biāo)評價各組小鼠中菌群的Alpha 多樣性（圖4A-C）。結(jié)果顯示，在未進(jìn)行DSS造模之前，Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠的Alpha 多樣性并無顯著差異；而進(jìn)行3%DSS 造模后，Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠出現(xiàn)了差異，其中Metrnl(-/-)小鼠多樣性顯著下降（圖4A-C）。主成分分析顯示，在給予3%DSS 造模后的Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠之間微生物的組成顯著不同（圖4D）。檢測小鼠糞便微生物組成，結(jié)果顯示，在“門”這一層面，給予3%DSS 后擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和變形桿菌門（Proteobacteria）在Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠間存在顯著的不同（圖4E）。在Metrnl(-/-)小鼠中，Bacteroidetes和Proteobacteria顯著降低，而Firmicutes顯著升高。在“綱”這一層面，發(fā)現(xiàn)給予DSS 后，Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠間擬桿菌綱（Bacteroidia）和梭菌綱（Clostridia）具有顯著差異。值得注意的是，擬桿菌綱（Bacteroidia）屬于擬桿菌門（Bacteroidetes）；梭菌綱（Clostridia）屬于厚壁菌門（Firmicutes）（圖4F）。為了進(jìn)一步探究影響給予DSS 后造成Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠間狀態(tài)的原因，我們又在“目”層面進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示（圖4G），擬桿菌目（Bacteroidales），屬于桿菌綱（Bacteroidia）；梭菌目（Clostridiales），屬于梭菌綱（Clostridia）發(fā)生了顯著改變。

3 討論

本研究用DSS 誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型并從對腸道微生物影響的角度出發(fā)，探究腸上皮Metrnl 特異性敲除對于腸道菌群調(diào)節(jié)的影響以及對潰瘍性結(jié)腸炎的作用。發(fā)現(xiàn)Metrnl 在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型中具有保護(hù)的功能，該效應(yīng)可能是Metrnl 通過對腸道菌群的調(diào)節(jié)所致。

近期有一篇關(guān)于Metrnl 改善克羅恩氏?。–D）的報道，該研究表明腸系膜脂肪組織與腸道存在交互作用，發(fā)現(xiàn)小鼠在給予Metrnl 后，可通過激活STAT5/PPARγ 信號通路，從而達(dá)到促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化來減輕腸系膜脂肪組織病變的作用[16]。該研究表明Metrnl 確實可以影響炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展。除此以外，我們進(jìn)一步證實了，腸上皮特異性Metrnl 敲除后可以加重DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎，并且該作用是通過抑制AMPK-mTOR-p70S6K通路，下調(diào)了腸上皮細(xì)胞自噬水平產(chǎn)生的[7]。

腸道微環(huán)境形成了合適的微生物群棲息地，已證明會影響多種消化系統(tǒng)疾病的發(fā)生[17]。腸道菌群穩(wěn)態(tài)的紊亂已被廣泛認(rèn)為與炎癥性腸病的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展密切相關(guān)[8]。腸道菌群主要有三種功能，分別是代謝作用，保護(hù)作用和營養(yǎng)作用[18-19]。正常人腸道中在“門”這一層面，主要有四類微生物群，包括擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和變形桿菌門（Proteobacteria）[20-21]。

潰瘍性結(jié)腸炎的主要特征是有益細(xì)菌的減少。擬桿菌門（Bacteroidetes）是革蘭陰性厭氧細(xì)菌，構(gòu)成了哺乳動物胃腸道中主要微生物群[22]。目前認(rèn)為，擬桿菌門可以通過免疫調(diào)節(jié)和維持體內(nèi)平衡而對宿主發(fā)揮有益作用。據(jù)報道，擬桿菌門可以通過分泌多糖A（polysaccharide A, PSA）來增強(qiáng)抗炎因子IL-10 的mRNA 表達(dá)[23-24]。本研究結(jié)果顯示出類似趨勢，在給予3%DSS 進(jìn)行潰瘍性結(jié)腸炎造模后，Metrnl(-/-)小鼠癥狀更加嚴(yán)重，與Metrnl(+/+)小鼠相比，其擬桿菌門的成分顯著下降。然而，擬桿菌門在潰瘍性結(jié)腸炎中并不完全有益。有報道顯示，擬桿菌門可以侵入腸道組織并引起個別患者的腸道損傷[25]。因此針對該類菌屬的作用還有待進(jìn)一步驗證。除此以外，由于SCFA 具有增強(qiáng)腸壁屏障和免疫系統(tǒng)的作用，從而有助于抵抗病原體，因此產(chǎn)生SCFA 的菌群目前認(rèn)為對人體是有益的，例如Faecalibacterium prausnitzii，Roseburia或Eubacterium[26-28]。放線菌門（Actinobacteria）中的雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）也是有益菌群[29-30]。然而，在該屬中發(fā)現(xiàn)了有爭議的結(jié)果，因為有研究報道顯示，與對照組相比，潰瘍性結(jié)腸炎患者的Bifidobacterium增加了[31-32]，其原因可能是疾病程度的造成的。因此，需要進(jìn)一步的研究來闡明該有益菌群在潰瘍性結(jié)腸炎中的作用。

相反的，目前很多研究顯示菌群在潰瘍性結(jié)腸炎中顯著增加，如變形桿菌門（Proteobacteria）下的黏附侵入性大腸桿菌屬（adherent-invasiveEscherichia coli）和巴斯德桿菌屬（Pasteurellaceae），厚 壁 菌 門（Firmicutes） 下 的 韋 榮 氏 球 菌 屬（Veillonellaceae）和瘤胃球菌屬（Ruminococcus gnavus），梭桿菌屬（Fusobacterium）。我們的研究結(jié)果也顯示出類似趨勢，在給予DSS 后，與Metrnl(+/+)小鼠相比，Metrnl(-/-)小鼠的厚壁菌的成分顯著上升。除此以外，以下菌屬也被認(rèn)為具有潛在致病性，如大腸桿菌屬（Escherichia），沙門菌屬（Salmonella），耶爾森菌屬（Yersinia），脫硫弧菌屬（Desulfovibrio），幽門螺桿菌屬（Helicobacter），弧菌屬（Vibrio）[31,33-36]。目前報道較多的是黏附侵入性大腸桿菌，此種細(xì)菌能夠黏附并穿過腸道黏液屏障，侵入腸道上皮層，促進(jìn)TNFα 分泌和炎癥的發(fā)生[37-38]。本研究表明，腸上皮特異性Metrnl 敲除后，在3%DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎模型中，導(dǎo)致腸道菌群動態(tài)平衡的進(jìn)一步紊亂，表明恢復(fù)菌群動態(tài)平衡對于治療潰瘍性結(jié)腸炎至關(guān)重要。

需要注意的是，大量研究表明，目前并沒有明確具體的哪一種微生物群對人體是有益的，因為每個人的菌群特征都不同。一般而言，只有相對平衡的微生物群，才能最佳地維持人體的代謝和免疫功能以及預(yù)防疾病的發(fā)展。在健康的腸道中，病原菌和共生菌群可以共存而不會出現(xiàn)問題。但是，這種平衡的任何紊亂都會導(dǎo)致營養(yǎng)不良，從而改變微生物與宿主之間的相互作用[39]。盡管目前普遍認(rèn)為潰瘍性結(jié)腸炎中腸環(huán)境平衡的破壞是顯著發(fā)生的，但是造成腸道平衡紊亂的生物學(xué)機(jī)制的仍然未知，并且不清楚這種紊亂究竟是造成潰瘍性結(jié)腸炎的原因還是結(jié)果。

本研究仍存在不足。首先，腸道微生態(tài)對潰瘍性結(jié)腸炎的保護(hù)作用的詳細(xì)機(jī)制仍未探究清楚，特別是腸道中存在的主要4 類微生物群（擬桿菌，厚壁菌，放線菌，變形桿菌）對潰瘍性結(jié)腸炎的作用還有待證實。其次，腸上皮特異性Metrnl 敲除后通過調(diào)節(jié)腸道菌群的組成，從而加重3%DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎的作用證據(jù)仍不十分充分，需要今后在進(jìn)一步的研究中加以闡明。