呂品一, 劉國世, 胡艷欣, 李 翔

(1.華中農業(yè)大學動物科學技術學院 、 動物醫(yī)學院, 湖北 武漢 430070 ; 2.中國農業(yè)大學動物科技學院,北京 海淀 100193 ; 3.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院, 北京 海淀 100193)

褪黑素(Melatonin,MT)又稱N-乙酰-5-甲氧基色胺,是主要由松果體產生的一種胺類激素。1959年,Lerner等從牛松果體提取物中分離出一種能使青蛙皮膚褪色的物質,將其命名為褪黑素[1]。褪黑素具有諸多生理功能,除了最被人熟知的調節(jié)晝夜節(jié)律和改善睡眠質量之外,褪黑素還具有內源性自由基清除作用,可以防止細胞產生氧化損傷。同時,褪黑素兼具免疫調節(jié)作用,可對動物機體天然免疫和獲得性免疫進行調節(jié),其免疫調節(jié)機制廣泛且復雜[2]。近年來,對于褪黑素不同生理功能及其作用機制的研究很多,本文對褪黑素介導的動物免疫調節(jié)功能及其機制的最新研究進展進行綜述,以期為后續(xù)褪黑素相關研究提供思考和見解,提高動物生產效率。

1 褪黑素概述

褪黑素來源廣泛,對機體沒有明顯的毒副作用,其分子式為C13H16N2O2,分子量為232.27,熔點為 116～118 ℃,易溶于乙醇和苯,微溶于水,化學穩(wěn)定性好,在生物體內具有高脂溶性、低水溶性和低血漿蛋白結合力的特征。褪黑素的生物合成具有晝夜節(jié)律性和季節(jié)特征[3],與外界環(huán)境光照條件相關[4]。除松果體外,大部分組織器官,如視網膜、胃腸道和性腺等都能夠合成褪黑素,而松果體呈現(xiàn)周期性的褪黑素分泌活動。

褪黑素的生物合成和代謝經歷多個步驟和多種酶的調控。褪黑素在所有組織中的生物合成均起源于色氨酸[5],松果體從血液中攝取色氨酸后,先后在色氨酸羥化酶、L-氨基酸脫羥酶、5-羥色胺-N-乙酰轉移酶和羥化-氧-甲基移位酶的作用下轉變?yōu)橥屎谒?。褪黑素在體內經歷多個代謝途徑。首先,褪黑素被褪黑素酶催化,轉化為羥基褪黑素;羥基褪黑素可以進一步代謝為羥基褪黑素酮和羥基褪黑素酸,這些代謝產物通過肝臟和其他組織最終被排泄。

2 褪黑素對獲得性免疫的調節(jié)

2.1 胸腺依賴性淋巴細胞(T細胞)和細胞免疫 T細胞主導細胞免疫,在免疫過程中發(fā)揮多種功能,如直接殺傷靶細胞、輔助或抑制B細胞產生抗體、對特異性抗原和促有絲分裂原的應答反應以及產生細胞因子等[6]。褪黑素可通過調節(jié)T細胞增殖、T細胞活化和不同種類T細胞比例這3種途徑調節(jié)細胞免疫。

2.1.1 調節(jié)T細胞增殖 已有研究表明,大鼠在松果體被摘除后,由于褪黑素分泌減少而出現(xiàn)胸腺萎縮和體重減輕的現(xiàn)象,且顯著程度隨時間加劇,補充褪黑素能使該進程逆轉,胸腺重量明顯恢復[7]。同時,摘除松果體使大鼠胸腺酪氨酸激酶受體B(Tyrosine kinase receptor B,trkB)表達量下降,而使用外源性褪黑素后trkB的表達量可恢復正常,胸腺細胞和胸腺巨噬細胞表達的trkB共同參與胸腺細胞的分化發(fā)育,褪黑素可以通過神經內分泌調節(jié)保護胸腺細胞[8]。有研究表明,摘除松果體可導致大鼠胸腺叉頭蛋白P3(Forkhead box protein P3,Foxp3)的轉錄和翻譯明顯增加,而補充外源性褪黑素后能使Foxp3的表達下降至正常水平[9]。Xiong等對切除松果體的肉雞使用外源性褪黑素發(fā)現(xiàn),褪黑素可增強綠光誘導的脾臟T細胞增殖,通過使用不同受體拮抗劑并測定淋巴細胞活性發(fā)現(xiàn),褪黑素通過與膜受體Mel1a和Mel1c結合參與調節(jié)T細胞增殖[10]。

2.1.2 調節(jié)T細胞活化 Yoo等使用100周齡老年小鼠脾細胞和CD4+T細胞進行試驗,結果顯示,使用褪黑素后,CD28、p21、褪黑素受體(Melatonin receptor,MTR)-1A和MTR-1B基因mRNA高度表達,促進T細胞活化,老年小鼠脾細胞和CD4+T細胞的數(shù)量顯著增加,且記憶T細胞得到長期維持,表明褪黑素可以強化老年小鼠的免疫力[11]。另一項試驗中,研究人員對小鼠采用松果體切除術,之后分析補充褪黑素后T細胞的變化,第4和6周后,T細胞活化因子顯著上調,且呈劑量依賴性[12]。

2.1.3 調節(jié)不同種類T細胞比例 研究表明,褪黑素能顯著影響T細胞的分化發(fā)育和釋放,通過改變不同種類T細胞的比例來調節(jié)免疫。大鼠摘除松果體后,胸腺和血液中CD4+T細胞比例無明顯波動,CD8+T細胞比例在胸腺中上升,在血液中下降,補充褪黑素后逐步恢復,且呈劑量依賴性[13]。周愛民等使用免疫抑制模型小鼠對CD4+和CD8+T細胞的比值和百分含量進行研究,結果顯示,在正常小鼠中,CD4+/CD8+T細胞比值正常,輔助性T細胞(Helper T cell,Th)/抑制性T細胞(Suppressor T cell,Ts)比值不變,褪黑素通過增加CD4+和CD8+T細胞的百分含量提高細胞免疫功能,發(fā)揮免疫調節(jié)作用;對于免疫功能低下或缺陷的小鼠,褪黑素通過提高CD4+和CD8+T 細胞的百分含量,改變CD4+/CD8+T細胞的比值和Th/Ts的比值而發(fā)揮免疫增強作用[14]。Huang等通過建立自身免疫性葡萄膜炎(Experimental autoimmune uveitis,EAU)小鼠模型并腹膜內注射褪黑素研究EAU的治療機理,結果顯示,褪黑素可以通過抑制轉錄因子進而限制外周Th1和Th17的增殖,抑制視網膜特異性T細胞對Th1和Th17細胞的極化,同時提高調節(jié)性T細胞(Regulatory T cells,Treg)的比例,從而調節(jié)自身免疫[15]。摘除松果體后,大鼠胸腺CD4+CD25+Treg細胞的輸出增加,補充褪黑素可使胸腺CD4+CD25+Treg細胞產生增加、輸出下降,若長時間補充褪黑素則該影響逐漸消失[9]。值得注意的是,即便有不少研究都提出改變不同種類T細胞的比例可以調節(jié)免疫,但關于褪黑素改變T細胞比例的具體機制尚存空白,值得進一步探究。

2.2 骨髓依賴性淋巴細胞(B細胞)和體液免疫 B細胞主導體液免疫,成熟的B細胞接受抗原刺激后,在抗原提呈細胞和Th細胞的輔助下成為活化B細胞,進而分化為漿細胞,合成和分泌各類抗體[6]。褪黑素可通過調節(jié)B細胞增殖、B細胞活化和抑制B細胞凋亡這3種途徑調節(jié)體液免疫。

2.2.1 調節(jié)B細胞增殖 Yu等給16周齡小鼠喂食含褪黑素日糧發(fā)現(xiàn),褪黑素處理組小鼠骨髓中前體B細胞凋亡率顯著下降,口服褪黑素可促進小鼠骨髓中前體B細胞的存活[16],從而影響B(tài)細胞增殖成熟數(shù)量。體外給予外源性褪黑素可顯著增強法式囊B淋巴細胞的增殖[17]。B細胞通過與膜受體Mel1b、Mel1c和維甲酸相關孤核受體(Retinoic acid receptor related-orphan receptors,RORs)結合參與調節(jié)B細胞增殖[8]。

2.2.2 調節(jié)B細胞活化 研究表明,松果體切除小鼠補充褪黑素后第4和6周后,B細胞活化因子顯著上調,且呈劑量依賴性[12]。Ramos等對接種過結節(jié)擬桿菌疫苗的綿羊進行褪黑素的植入或注射發(fā)現(xiàn),配合使用了褪黑素的綿羊外周血液中抗體滴度比單獨接種疫苗更高,且褪黑素增加了接種疫苗綿羊的IgG+B淋巴細胞和CD4+T淋巴細胞的數(shù)量,表明褪黑素可增強B細胞活化并繼發(fā)增強體液免疫[18]。

2.2.3 抑制B細胞凋亡 Zhang等在不同單色光組合條件下對雛雞使用外源性褪黑素后發(fā)現(xiàn),在綠藍單色光組合條件下,核受體RORα和RORγ可以通過減少氧化應激和核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)的表達,抑制法式囊B淋巴細胞凋亡[19]。

綜上所述,褪黑素通過Mel1a、Mel1b、Mel1c等不同種類的膜受體和RORα、RORγ等不同種類的核受體,調節(jié)多種細胞活化因子或改變不同種類細胞比例,對T細胞主導的細胞免疫和B細胞主導的體液免疫進行調節(jié),參與調控動物機體獲得性免疫的多個環(huán)節(jié)(圖1)。

圖1 褪黑素對獲得性免疫的調節(jié)

3 褪黑素對天然免疫的調節(jié)

3.1 自然殺傷(Natural killer,NK)細胞 NK細胞是動物機體天然免疫的重要組成部分,在抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)中起著關鍵作用,無需預先致敏就能非特異性殺傷腫瘤細胞和病毒感染細胞[6]。褪黑素對NK細胞的影響主要體現(xiàn)在數(shù)量和活性2個方面。

3.1.1 調節(jié)NK細胞數(shù)量 射頻消融術(Radiofrequency ablation,RFA)是指在動物體內采用尖端射頻熱以精準消融增生組織和腫瘤,使相應的器官恢復功能。研究表明,RFA和褪黑素聯(lián)合治療可顯著增加NK細胞在非消融腫瘤組織中的浸潤,提高NK細胞的抗腫瘤活性。Currier等研究發(fā)現(xiàn),與未添加褪黑素的小鼠相比,在食物中添加外源性褪黑素的小鼠脾臟和骨髓中的NK細胞數(shù)量在7和14 d后均顯著上升[20]。

3.1.2 調節(jié)NK細胞活性 將NK細胞和人慢性髓原白血病細胞(K-562細胞)在含有褪黑素的培養(yǎng)基中共同培養(yǎng),結果顯示,增加褪黑素濃度可以有效提高NK細胞的活性,促進NK細胞介導的K-562細胞殺傷[21]。類似地,?z?elik等使用鏈脲佐菌素誘導大鼠糖尿病,并對其使用褪黑素進行為期6周的腹膜內注射,結果顯示,注射褪黑素的大鼠NK細胞活性顯著升高[22]。有關褪黑素能夠對NK細胞數(shù)量和活性進行調節(jié)作用的具體原因尚待研究。

3.2 單核-巨噬細胞系統(tǒng) 單核-巨噬細胞是機體重要的免疫細胞,可通過非特異性吞噬起到抗感染作用,同時兼具抗原遞呈及啟動免疫應答、抗腫瘤等作用[6]。褪黑素可對單核-巨噬細胞的數(shù)量比例和分泌狀態(tài)產生影響。

3.2.1 調節(jié)單核-巨噬細胞數(shù)量比例 在Currier等的研究中,對成年雄性小鼠使用褪黑素7 d后,小鼠骨髓和脾臟中單核細胞的數(shù)量都發(fā)生了顯著上升;14 d后骨髓中單核細胞數(shù)量維持在高水平[20]。另有研究發(fā)現(xiàn),褪黑素通過將外泌體αKG轉運到巨噬細胞并促進TET(Ten-eleven translocation,TET)蛋白介導的脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA)去甲基化,緩解了脂肪細胞炎癥,提高了替代性活化巨噬細胞(Alternatively activated macrophage,M2)的比例,同時減少了巨噬細胞的死亡數(shù)量[23]。一項對產毒素大腸桿菌感染的研究結果顯示,褪黑素改變了豬巨噬細胞的功能,降低了其抑菌和殺菌活性,同時顯著降低了細胞外乳酸脫氫酶活性,表明褪黑素可降低產毒素大腸桿菌導致的巨噬細胞死亡。但有趣的是,在褪黑素影響下,豬巨噬細胞的細菌清除率反而得到了增強[24]。可見,褪黑素對巨噬細胞的影響效果尚不明確,具體機制尚待進一步研究。

3.2.2 調節(jié)單核-巨噬細胞分泌狀態(tài) 研究顯示,由于夜間佩戴牙齒矯正器會產生機械作用,RAW264.7巨噬細胞受其影響后會產生更多炎癥介質,如白細胞介素(Interleukin,IL)1β和IL-6等;但添加褪黑素后,褪黑素可通過MT2受體抑制巨噬細胞產生炎癥介質,從而抑制因機械作用而導致的炎癥反應[25]。小膠質細胞由單核細胞發(fā)育而來,在中樞神經系統(tǒng)中發(fā)揮免疫吞噬作用。Liu等建立腦缺血小鼠模型并向其腹腔注射褪黑素進行體內試驗,同時對促炎狀態(tài)的小膠質細胞使用褪黑素進行體外試驗,結果顯示,褪黑素可通過信號轉導和轉錄激活因子-3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)依賴性方式將小膠質細胞從促炎狀態(tài)轉變?yōu)榭寡谞顟B(tài),改善缺血性卒中后炎癥反應引起的腦損傷[26]。

3.3 炎癥小體 炎癥小體是由胞漿內模式識別受體(Pattern recognition receptors,PRRs)參與組裝的多蛋白復合物,是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。炎癥小體的激活能夠幫助宿主免疫外來病原體,但其過度激活會導致免疫病理損傷。而褪黑素可以通過抑制激活信號、抑制炎癥小體的主要成分合成等方法抑制炎癥小體的活化[27]。

3.3.1 抑制激活信號 NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)炎癥小體在小鼠急性肺損傷中起關鍵作用,而褪黑素能夠通過抑制作為激活炎癥小體第2信號的胞外組蛋白的功能來抑制或直接抑制該小體的激活,這可能是褪黑素治療急性肺損傷的機制[28]。用褪黑素處理脊髓損傷小鼠模型后發(fā)現(xiàn),褪黑素通過刺激NF-E2相關因子2-抗氧化反應元件通路(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2-antioxidant response element,Nrf2-ARE)抑制NLRP3炎癥小體,從而抑制神經炎癥,改善脊髓損傷后神經功能的恢復[29]。

3.3.2 抑制炎癥小體的主要成分合成 褪黑素可以劑量依賴性降低IL-1β,抑制NLRP3炎癥小體的激活和焦亡[30]。Crespo等在使用褪黑素對兔出血性病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)誘導的急性肝功能衰竭模型兔進行處理后發(fā)現(xiàn),褪黑素可通過抑制NLRP1炎癥小體的主要成分凋亡相關斑點樣蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)、Caspase-1 (CASP1)蛋白、IL-1β和IL-24β的增加,防止感染RHDV兔的肝臟中NLRP3炎癥小體的活化,從而在一定程度上防止急性肝功能衰竭的發(fā)生[31]。另一項試驗使用褪黑素處理肺動脈高壓小鼠模型,結果顯示,褪黑素可通過調節(jié)巨噬細胞中的鈣離子來減少炎癥小體多蛋白復合物的形成,同時褪黑素膜受體激動劑可使巨噬細胞中的炎癥小體失活,減輕炎癥小體相關的血管疾病[32]。

綜上所述,褪黑素對NK細胞、單核-巨噬細胞和炎癥小體均可產生影響,通過較為多樣且復雜的途徑調節(jié)動物機體天然免疫(圖2)。

圖2 褪黑素對天然免疫的調節(jié)

4 褪黑素對細胞因子的調節(jié)

細胞因子是免疫細胞和某些非免疫細胞經刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學活性的小分子蛋白質,是調控免疫應答的重要因素,也是引起動物機體損傷和多臟器衰竭的重要原因[6]。褪黑素對于細胞因子的產生具有抑制作用。研究發(fā)現(xiàn),鼻黏膜和肺組織中的褪黑素在白天的表達量顯著高于夜晚,流感病毒感染小鼠的存活率與呼吸道組織中褪黑素的表達量呈正相關;進一步研究表明,褪黑素可通過MT2受體結合并下調肥大細胞低氧誘導因子-1(Hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)通路相關因子的表達,通過抑制肥大細胞活化,減少促炎因子,如腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor,TNF)-α、IL-2和IL-9β等的釋放,從而減輕H1N1亞型流感病毒感染小鼠后由細胞因子風暴所產生的肺泡上皮細胞凋亡和肺損傷(圖3)[33]。

圖3 褪黑素保護小鼠免受H1N1感染的潛在機制示意圖[33]

在一組多發(fā)性硬化癥患者的對照研究中發(fā)現(xiàn),連續(xù)6個月每日口服25 mg褪黑素能顯著降低血清中TNF、IL-6和IL-1β等細胞因子和脂質過氧化物的含量,對細胞因子所導致的神經損傷有抑制作用[34]。Braz?o等在對克魯茲錐蟲感染的研究中發(fā)現(xiàn),褪黑素處理后大鼠血清中的IL-1α、IL-1β和轉化生長因子 (Transforming growth factor β,TGF-β)等細胞因子濃度顯著降低[35]。在對褪黑素調節(jié)幽門螺桿菌感染所致胃炎的研究中發(fā)現(xiàn),與感染對照組相比,小鼠血清IL-2、IL-6、IL-10、干擾素γ(Interferon-γ,IFN-γ)和TNF-α等各細胞因子在褪黑素干預6周后顯著下降[36]。

總結既往研究可以得出,褪黑素對多種細胞因子的產生均可起到抑制作用,這可能與產生細胞因子的對應細胞活性受褪黑素抑制有關(圖4)。但對大多數(shù)種類的細胞因子而言,褪黑素抑制其產生的精確機制尚有待探索。

圖4 褪黑素對細胞因子的調節(jié)

5 總結與展望

褪黑素作為一種內源性神經生殖激素,具有抗氧化功能,在免疫調節(jié)中扮演著重要的角色。研究表明,褪黑素能夠調節(jié)免疫細胞、免疫器官的功能和活性,可以對不同種類的細胞因子和炎癥小體進行調節(jié),對天然免疫和獲得性免疫均具有廣泛的影響。然而,對于褪黑素在免疫調節(jié)中所產生現(xiàn)象背后的具體機制的認識,例如褪黑素如何改變T細胞的比例、如何提高NK細胞活性、如何使動物機體中細胞因子水平下降等,仍然有待進一步深入探究。未來的研究可以著眼于深入了解褪黑素與免疫細胞之間的相互作用、信號轉導通路以及調控免疫反應的分子機制,同時進一步探索褪黑素在自身免疫病和免疫腫瘤治療等領域的臨床應用,以期將褪黑素的免疫調節(jié)潛力轉化為臨床治療的創(chuàng)新方法。