張曉萌, 郭麗陽(yáng), 楊 帆, 胡婉君, 盛尊來(lái)

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院, 黑龍江 哈爾濱 150030)

隨著畜牧業(yè)的集約化和規(guī)?；l(fā)展,腹瀉作為多種疾病的伴隨癥狀,越來(lái)越多發(fā),通常會(huì)阻礙畜禽生長(zhǎng)發(fā)育,嚴(yán)重時(shí)引起死亡,對(duì)養(yǎng)豬行業(yè)造成的危害尤為顯著[1],因此腹瀉的防治已經(jīng)成為畜牧養(yǎng)殖業(yè)亟需解決的難題。腹瀉的常見(jiàn)特征是糞便排出量增加,狀態(tài)發(fā)生變化,通常變成液體狀或糊狀,有腹痛情況等[2,3]。在養(yǎng)殖過(guò)程中,對(duì)于腹瀉的治療,普遍采用集中使用抗生素,不僅導(dǎo)致大量耐藥菌株的出現(xiàn),而且會(huì)忽視抑制腹瀉癥狀的重要性。然而,過(guò)度腹瀉正是引起腸道組織損傷的重要原因。因此,在腹瀉治療的研究中,尋找新的有效的天然抗腹瀉藥物至關(guān)重要。

異槲皮苷作為蘆丁的次生苷,首次從紅葉加拿大紫荊(Cerciscanadensis)的種子莢中分離得到[4],隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)異槲皮苷的穩(wěn)定性和生物利用度優(yōu)于蘆丁,且其在代謝過(guò)程中的藥理活性豐富,具有成骨作用、消炎作用、利尿作用和抗癌作用等[5-8]。蘆丁已經(jīng)被證實(shí)具有較好的抗腹瀉作用[9],但對(duì)異槲皮苷的抗腹瀉作用卻缺乏研究和報(bào)道,本試驗(yàn)旨在探究異槲皮苷的抗腹瀉作用,為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和主要試劑 蘆丁和異槲皮苷,均購(gòu)自安徽酷爾生物工程有限公司;鹽酸洛哌丁胺(2 mg/粒),購(gòu)自廣濟(jì)大藥房,批號(hào):H10910085;蓖麻油(分析純),購(gòu)自源葉生物有限公司;α-L-鼠李糖苷酶,購(gòu)自南通英瑞達(dá)生物試劑有限公司;醋酸-醋酸鈉(Acetic acid-sodium acetate,HAc-NaAc)緩沖液(pH 5.0),購(gòu)自汕頭西隴科學(xué)股份有限公司;鈉/氫交換因子1(Sodium/hydrogen exchange factor 1,NHE1)、鈉/氫交換因子2(Sodium/hydrogen exchange factor 2,NHE2)、鈉/氫交換因子3(Sodium/hydrogen exchange factor 3,NHE3)、水通道蛋白 4(Aquaporin 4,AQP4)、鈉/葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(Sodium/glucose cotransporter 1,SGLT1)和囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein,CFTR)mRNA檢測(cè)用引物,均由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 主要儀器 IY 2002 電子天平,深圳明科科技有限公司產(chǎn)品;Fw135 中藥粉碎機(jī),大連美羅儀器股份有限公司產(chǎn)品;有機(jī)微孔濾膜0.22 μm和微孔濾膜(水膜) 0.22 μm,安捷倫科技有限公司產(chǎn)品;BILON-S650CT 超聲提取器,深圳三利有限公司產(chǎn)品;Waters e2695高效液相色譜儀,上海沃特世科技有限公司產(chǎn)品;Gemini C18色譜柱(250.0 mm×4.6 mm,5 μm),美國(guó)Phenomenex分析儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠[7周齡,雌雄各半,體重(20±2) g]和Wistar大鼠[6～7周齡,雌雄各半,體重(200±20) g],均由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SYXK(黑)2022—004。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 異槲皮苷的制備 在最佳的酶水解條件下,使用蘆丁制備異槲皮苷[10,11]。稱取蘆丁24 g,置于500 mL圓底燒瓶中,依次加入150 mL HAc-NaAc緩沖液(pH 5.0)、150 mL α-L-鼠李糖苷酶溶液,持續(xù)反應(yīng)6 h,加入150 mL水飽和的正丁醇終止反應(yīng)。離心后分取上清液,減壓濃縮后得黃色針狀結(jié)晶,經(jīng)高效液相色譜(High performance liquid chromatography,HPLC)與異槲皮苷對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)。

1.4.2 腹瀉抑制率的測(cè)定 采用蓖麻油誘導(dǎo)的小鼠腹瀉模型[12],將25只昆明小鼠隨機(jī)分為5個(gè)組,每組5只。禁食18 h后,腹瀉模型組按10 mg/(kg·bw)劑量灌胃給予蒸餾水,異槲皮苷低、中、高劑量組分別按12.5、25.0和50.0 mg/(kg·bw)劑量灌胃給予異槲皮苷,藥物對(duì)照組按2 mg/(kg·bw)劑量灌胃給予洛哌丁胺。1 h后,各組小鼠均按10 mg/(kg·bw)劑量灌胃給予蓖麻油,連續(xù)觀察4 h,記錄初次腹瀉時(shí)間和稀便次數(shù)。按公式(1)計(jì)算腹瀉抑制率。

腹瀉抑制率(%)=(腹瀉模型組稀便次數(shù)-給藥組稀便次數(shù))÷腹瀉模型組稀便次數(shù)×100%

(1)

1.4.3 炭粉推進(jìn)抑制率的測(cè)定 將25只昆明小鼠隨機(jī)分為5個(gè)組,每組5只。禁食18 h后,空白對(duì)照組按10 mg/(kg·bw)劑量灌胃給予蒸餾水,異槲皮苷低、中、高劑量組分別按12.5、25.0和50.0 mg/(kg·bw)劑量灌胃給予異槲皮苷,藥物對(duì)照組按2 mg/(kg·bw)劑量灌胃給予洛哌丁胺。1 h后,每只小鼠灌胃給予0.2 mL濃度為5%的活性炭溶液,30 min后,頸背脫位處死小鼠并分取小腸,置于4%多聚甲醛中固定5 min,將小腸輕輕拉直,置于白色濾紙上,測(cè)量小腸全長(zhǎng)和炭粉在腸內(nèi)推進(jìn)距離(幽門至活性炭前),并按公式(2)和(3)計(jì)算炭粉推進(jìn)抑制率。

炭粉推進(jìn)率(%)=炭粉在腸內(nèi)推進(jìn)距離(cm)÷小腸全長(zhǎng)(cm)×100%

(2)

炭粉推進(jìn)抑制率(%)=(空白對(duì)照組炭粉推進(jìn)率-給藥組炭粉推進(jìn)率)÷空白對(duì)照組炭粉推進(jìn)率×100%

(3)

1.4.4 小腸積液抑制率的測(cè)定 將25只Wistar大鼠隨機(jī)分為5個(gè)組,每組5只。禁食18 h后,腹瀉模型組按10 mg/(kg·bw)劑量灌胃給予蒸餾水,異槲皮苷低、中、高劑量組分別按12.5、25.0和50.0 mg/(kg·bw)劑量灌胃給予異槲皮苷,藥物對(duì)照組按2 mg/(kg·bw)劑量灌胃給予洛哌丁胺。1 h后,各組大鼠均按10 mg/(kg·bw)劑量灌胃給予蓖麻油,30 min后,處死大鼠并分取小腸,擠出小腸內(nèi)容物并測(cè)定其體積,按公式(4)計(jì)算小腸積液抑制率。

小腸積液抑制率(%)=(腹瀉模型組小腸積液體積-給藥組小腸積液體積)÷腹瀉模型組小腸積液體積×100%

(4)

1.4.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測(cè)離子通道蛋白mRNA表達(dá)量 將25只昆明小鼠隨機(jī)分為5個(gè)組,每組5只。禁食18 h后,空白對(duì)照組和腹瀉模型組分別按10 mg/(kg·bw)劑量灌胃給予蒸餾水,異槲皮苷低、中、高劑量組分別按12.5、25.0和50.0 mg/(kg·bw)劑量灌胃給予異槲皮苷。1 h后,空白對(duì)照組按10 mg/(kg·bw)劑量灌胃給予蒸餾水,其余各組按10 mg/(kg·bw)劑量灌胃給予蓖麻油。連續(xù)處理7 d后處死小鼠,并分別取結(jié)腸組織,用qRT-PCR檢測(cè)NHE1、NHE2、NHE3、CFTR、SGLT1和AQP4的mRNA相對(duì)表達(dá)量,引物序列見(jiàn)表1。以GADPH為內(nèi)參基因,空白對(duì)照組、異槲皮苷低、中、高劑量組的目的基因?qū)τ诟篂a模型組的相對(duì)表達(dá)量計(jì)算采用2-ΔΔCt法。

表1 離子通道蛋白qPCR檢測(cè)引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way analysis of variance,ANOVA),方差齊性檢驗(yàn)后進(jìn)行沃勒-鄧肯多重比較。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 異槲皮苷的制備 HPLC檢測(cè)結(jié)果如圖1所示,與異槲皮苷對(duì)照品比對(duì),由蘆丁經(jīng)酶水解制備的化合物為異槲皮苷,其含量為95%。

圖1 異槲皮苷樣品(A)和對(duì)照品(B)HPLC檢測(cè)

2.2 異槲皮苷對(duì)腹瀉抑制率的影響 如表2所示,與腹瀉模型組相比,異槲皮苷各劑量組和藥物對(duì)照組小鼠初次腹瀉時(shí)間均極顯著延遲(P<0.01),異槲皮苷高劑量組和藥物對(duì)照組小鼠稀便次數(shù)均顯著減少(P<0.05),并且異槲皮苷的腹瀉抑制率呈劑量依賴性。

表2 異槲皮苷對(duì)小鼠初次腹瀉時(shí)間和腹瀉抑制率的影響

2.3 異槲皮苷對(duì)炭粉推進(jìn)抑制率的影響 如表3所示,空白對(duì)照組小鼠炭粉推進(jìn)率可達(dá)小腸總長(zhǎng)度的22.20%,而異槲皮苷低、中、高劑量組炭粉在小鼠小腸內(nèi)的推進(jìn)距離均顯著縮短(P<0.05或P<0.01),其炭粉推進(jìn)抑制率呈現(xiàn)良好的劑量依賴性(37.4%～67.5%),但弱于藥物對(duì)照組。

表3 異槲皮苷對(duì)小鼠小腸炭粉推進(jìn)運(yùn)動(dòng)的影響

2.4 異槲皮苷對(duì)小腸積液抑制率的影響 如表4所示,與腹瀉模型組相比,異槲皮苷低、中、高劑量組和藥物對(duì)照組小腸積液體積均顯著減少(P<0.05或P<0.01),并且異槲皮苷對(duì)小腸積液的抑制作用呈一定的劑量依賴性。

表4 異槲皮苷對(duì)大鼠小腸積液的影響

2.5 異槲皮苷對(duì)離子通道蛋白mRNA表達(dá)量的影響 如圖2所示,與空白對(duì)照組比較,腹瀉模型組NHE1、NHE2、NHE3、AQP4和SGLT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(P<0.05),CFTRmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05);與腹瀉模型組比較,異槲皮苷低、中劑量組的NHE1、NHE2、NHE3和SGLT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量略上調(diào),但差異不顯著(P>0.05);高劑量組NHE1、NHE2、NHE3、AQP4和SGLT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.05),CFTRmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)。

3 討論

腹瀉是當(dāng)今全球性重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一,世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)已把對(duì)腹瀉疾病的控制列為全球戰(zhàn)略,其發(fā)病機(jī)制多樣,包括腸黏膜結(jié)構(gòu)損傷,導(dǎo)致腸道黏膜充血、水腫、發(fā)生炎性滲出和其他病理變化,從而引發(fā)腹瀉[13,14]。

蓖麻油在體內(nèi)可被胰脂蛋白酶水解而釋放蓖麻油酸,蓖麻油酸可刺激小腸黏膜使其通透性發(fā)生改變,從而導(dǎo)致水樣內(nèi)容物快速通過(guò)小腸和大腸,發(fā)生腹瀉。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,異槲皮苷可明顯延遲初次腹瀉時(shí)間,減少稀便次數(shù),因此異槲皮苷對(duì)蓖麻油誘導(dǎo)的腹瀉具有一定的抑制作用。同時(shí),與空白對(duì)照組相比,異槲皮苷組小鼠的炭粉推進(jìn)抑制率明顯增加,表明異槲皮苷具有一定的腸蠕動(dòng)抑制作用。腸蠕動(dòng)減少能夠讓腸液和電解質(zhì)有更多的時(shí)間被重新吸收,減少液體損失和糞便排出量,從而緩解腹瀉。在小腸積液抑制試驗(yàn)中,異槲皮苷對(duì)小腸積液表現(xiàn)出顯著的劑量依賴性抑制作用,而對(duì)腸道離子通道的調(diào)控與腸腔積液具有重要關(guān)系,可以推測(cè),異槲皮苷對(duì)離子通道應(yīng)具有調(diào)控作用。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,NHE家族[15]、AQP4[16]、SGLT1[17]和CFTR[18]等離子通道蛋白能夠影響腸液的吸收和分泌,因此,藥物能夠通過(guò)對(duì)離子通道的調(diào)控發(fā)揮抗腹瀉作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組比較,腹瀉模型組各離子通道蛋白的mRNA表達(dá)量具有顯著變化,而經(jīng)異槲皮苷干預(yù)后,均有不同程度的回調(diào),尤其CFTR的mRNA表達(dá)量回調(diào)最為顯著。這也意味著降低CFTR離子通道基因表達(dá)、上調(diào)NHE1、NHE2、NHE3、AQP4和SGLT1基因表達(dá),是異槲皮苷抗腹瀉的重要機(jī)制。

綜上所述,異槲皮苷對(duì)腹瀉癥狀具有較好的治療和緩解效果,為異槲皮苷作為抗腹瀉添加劑的使用提供了理論依據(jù)。