郭文霞, 郭佳琦, 傅容湛

(1. 西北大學(xué)化工學(xué)院, 陜西 西安 710069 ; 2. 西北大學(xué)生物醫(yī)藥研究院, 陜西 西安 710069 ;3. 陜西省醫(yī)療器械質(zhì)量檢驗(yàn)院, 陜西 咸陽(yáng) 712046)

隨著社會(huì)發(fā)展過(guò)程中人們生活節(jié)奏的加快,睡眠障礙疾病的發(fā)生率大大提高[1],全世界因失眠導(dǎo)致的患病率為10%～30%[2-4]。睡眠障礙的主要特征為難以入睡,睡眠時(shí)間短,睡眠質(zhì)量差,睡眠障礙可能引發(fā)疲勞、情緒低落、軀體不適和認(rèn)知障礙等問(wèn)題[5-7]。目前睡眠障礙常以苯二氮卓等鎮(zhèn)靜催眠類(lèi)藥物治療,但連續(xù)用藥會(huì)出現(xiàn)如宿醉、譫妄和共濟(jì)失調(diào)等不良反應(yīng)[8]。因此,開(kāi)發(fā)具有改善睡眠作用的功能食品備受關(guān)注。絞股藍(lán)中的皂苷、多糖和黃酮類(lèi)化合物是其主要活性成分[9]。絞股藍(lán)皂苷具有抗腫瘤、降血糖、降血脂、保護(hù)肝臟和神經(jīng)等多方面生物活性[10]。Shen等[11]研究表明,絞股藍(lán)皂苷對(duì)小鼠具有鎮(zhèn)靜、催眠和抗焦慮的作用?！侗静菥V目》記載,珍珠具有鎮(zhèn)靜安神、養(yǎng)陰息風(fēng)、明目消翳和解毒生肌等功效,珍珠粉有治療驚悸失眠和清肝明目的作用[12]。樊柏林[13]研究發(fā)現(xiàn),酶解珍珠液灌服可使小鼠表現(xiàn)出安靜、自發(fā)活動(dòng)減少等現(xiàn)象,能明顯延長(zhǎng)閾下劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠睡眠時(shí)間,還能明顯縮短巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠潛伏期等。

絞股藍(lán)珍珠粉膠囊是以絞股藍(lán)水提物和珍珠粉為原料,經(jīng)混合、制粒等加工工藝制成的具有改善睡眠作用的功能食品。本試驗(yàn)以小鼠為研究對(duì)象,評(píng)價(jià)絞股藍(lán)珍珠粉膠囊對(duì)其睡眠作用的影響,并且對(duì)其鎮(zhèn)靜催眠機(jī)制進(jìn)行初步探討,為改善睡眠的功能食品開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試物 絞股藍(lán)珍珠粉膠囊,自制(批號(hào):20210508),每粒膠囊含絞股藍(lán)水提物0.202 g(絞股藍(lán)水提得率為18%)、珍珠粉0.080 g。相當(dāng)于含生藥量1.20 g/粒(其中含絞股藍(lán)生藥1.12 g,珍珠粉80 mg)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)昆明小鼠(體重18～22 g),雌性,由陜西省西安市西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào):SCXK(陜)2018—001]。動(dòng)物飼養(yǎng)于屏障級(jí)動(dòng)物房,溫度20～25 ℃,相對(duì)濕度50%～60%,12 h照明和12 h黑暗交替,動(dòng)物自由攝食和飲水。

1.3 主要儀器和試劑 計(jì)時(shí)器、玻璃勻漿器和ME104E/02型電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品;BioTek全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀,美國(guó)伯騰儀器有限公司產(chǎn)品;TGL-20臺(tái)式高速離心機(jī),山東百歐醫(yī)療科技有限公司產(chǎn)品。生理鹽水、戊巴比妥鈉和巴比妥鈉,中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品;五羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)和多巴胺(Dopamine,DA)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒,南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組和給藥 將100只小鼠按照體重隨機(jī)分為10個(gè)組,即9個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)空白對(duì)照組,每組10只。以灌胃方式給予受試藥物,灌胃量為0.2 mL/(20 g·bw·d)?？瞻讓?duì)照組給予等量的蒸餾水。試驗(yàn)組設(shè)置絞股藍(lán)珍珠粉膠囊低、中、高劑量組,分別按120、240和480 mg/(kg·bw)劑量給藥;絞股藍(lán)水提物低、中、高劑量組,分別按112、224和448 mg/(kg·bw)劑量給藥;珍珠粉低、中、高劑量組,分別按8、16和32 mg/(kg·bw)劑量給藥。試驗(yàn)期間動(dòng)物自由攝食和飲水,每天觀察小鼠的活動(dòng)和生長(zhǎng)情況。灌胃30 d后,對(duì)各組小鼠進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.4.2 直接睡眠試驗(yàn) 末次灌胃30 min后觀察小鼠睡眠情況,睡眠以翻正反射消失為指標(biāo),即當(dāng)小鼠置于背臥位時(shí),能夠立即翻正身位,如果超過(guò)60 s小鼠不能翻正,說(shuō)明翻正反射消失,小鼠進(jìn)入睡眠,從翻正反射消失到其恢復(fù)的時(shí)間為小鼠的睡眠時(shí)間。分別觀察并計(jì)算各組小鼠的入睡只數(shù)和睡眠時(shí)間。如試驗(yàn)組小鼠的入睡只數(shù)和睡眠時(shí)間增加且與空白對(duì)照組相比具有顯著差異,即判定該項(xiàng)結(jié)果為陽(yáng)性。

1.4.3 延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間試驗(yàn) 末次灌胃30 min后,各組小鼠腹腔注射戊巴比妥納45 mg/(kg·bw),以翻正反射消失為小鼠入睡指標(biāo),分別記錄各組小鼠的平均睡眠時(shí)間。

1.4.4 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗(yàn) 末次灌胃15～20 min后,各組小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉27 mg/(kg·bw),以翻正反射消失為小鼠入睡指標(biāo),分別記錄各組30 min內(nèi)入睡小鼠只數(shù)。如試驗(yàn)組小鼠的入睡只數(shù)增加且與空白對(duì)照組相比具有顯著差異,即判定該項(xiàng)結(jié)果為陽(yáng)性。

1.4.5 巴比妥鈉睡眠潛伏期試驗(yàn) 末次灌胃15～20 min后,各組小鼠腹腔注射巴比妥鈉250 mg/(kg·bw),以翻正反射消失為依據(jù),觀察受試藥物能否縮短巴比妥鈉睡眠潛伏期。如試驗(yàn)組小鼠的睡眠潛伏期與空白對(duì)照組相比具有顯著差異,即判定該項(xiàng)結(jié)果為陽(yáng)性。

1.4.6 腦組織5-HT、GABA和DA含量的檢測(cè) 各組小鼠連續(xù)灌胃30 d后,禁食12 h,處死小鼠,取出腦組織,用生理鹽水沖洗后稱其質(zhì)量,用勻漿器制備10%的腦組織勻漿,4 ℃條件下8 000 r/min離心10 min后取上清液,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)采用 ELISA測(cè)定各組小鼠腦組織中5-HT、GABA和DA的含量。

1.4.7 數(shù)據(jù)處理 用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化和統(tǒng)計(jì)分析。先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),若方差齊,采用單因素方差分析進(jìn)行總體比較,發(fā)現(xiàn)差異再用 Dunnett 法進(jìn)行多個(gè)劑量組與空白對(duì)照組均數(shù)間的兩兩比較。若方差不齊,則對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,滿足方差齊性檢驗(yàn)后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì);若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到方差齊的目的,改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)總體比較有差異,則采用不要求方差齊性的 Tamhane's T2 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 直接睡眠試驗(yàn) 由表1可知,絞股藍(lán)珍珠粉膠囊、絞股藍(lán)水提物、珍珠粉各劑量組和空白對(duì)照組(蒸餾水)的小鼠均未出現(xiàn)睡眠現(xiàn)象(沒(méi)有翻正反射消失小鼠),提示各組的直接睡眠試驗(yàn)結(jié)果皆為陰性。

表1 絞股藍(lán)珍珠粉膠囊、絞股藍(lán)水提物和珍珠粉對(duì)小鼠直接睡眠的影響

2.2 延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間試驗(yàn) 由表2可知,與空白對(duì)照組相比,絞股藍(lán)珍珠粉膠囊低劑量組小鼠的戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.01),而中、高劑量組小鼠的戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間極顯著延長(zhǎng)(P<0.001),說(shuō)明絞股藍(lán)珍珠粉膠囊可顯著延長(zhǎng)小鼠睡眠時(shí)間。同時(shí),與空白對(duì)照組相比,絞股藍(lán)水提物中、高劑量組和珍珠粉中、高劑量組小鼠的戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果表明,絞股藍(lán)珍珠粉膠囊各劑量組均可以對(duì)小鼠的戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間起到延長(zhǎng)作用,且對(duì)小鼠睡眠時(shí)間的延長(zhǎng)作用優(yōu)于絞股藍(lán)水提物和珍珠粉單藥組。

表2 絞股藍(lán)珍珠粉膠囊、絞股藍(lán)水提物和珍珠粉對(duì)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時(shí)間的影響

2.3 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗(yàn) 由表3可知,與空白對(duì)照組相比,絞股藍(lán)珍珠粉膠囊各劑量組均能顯著增加戊巴比妥鈉閾下催眠劑量入睡小鼠只數(shù)(P<0.05或P<0.01),而絞股藍(lán)水提物、珍珠粉各劑量組與空白對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果表明,相較于絞股藍(lán)水提物和珍珠粉單藥組,絞股藍(lán)珍珠粉膠囊可以顯著增加戊巴比妥鈉閾下催眠劑量入睡小鼠只數(shù)。

表3 絞股藍(lán)珍珠粉膠囊、絞股藍(lán)水提物和珍珠粉對(duì)戊巴比妥鈉閾下劑量催眠作用的影響

2.4 巴比妥鈉睡眠潛伏期試驗(yàn) 由表4可知,與空白對(duì)照組相比,絞股藍(lán)珍珠粉膠囊各劑量組均能顯著縮短小鼠的睡眠潛伏期(P<0.01或P<0.001),說(shuō)明絞股藍(lán)珍珠粉膠囊具有縮短巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠睡眠潛伏期的作用。同時(shí),與空白對(duì)照組相比,絞股藍(lán)水提物中、高劑量組和珍珠粉中、高劑量組小鼠的睡眠潛伏期均顯著縮短(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果表明,相較于絞股藍(lán)水提物和珍珠粉單藥組,絞股藍(lán)珍珠粉膠囊可以顯著縮短小鼠的睡眠潛伏期,對(duì)小鼠的睡眠起到一定的改善作用。

表4 絞股藍(lán)珍珠粉膠囊、絞股藍(lán)水提物和珍珠粉對(duì)巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響

2.5 絞股藍(lán)珍珠粉膠囊對(duì)失眠小鼠腦組織5-HT、GABA和DA含量的影響 由表5可知,與空白對(duì)照組相比,絞股藍(lán)水提物中、高劑量組5-HT和GABA含量顯著升高(P<0.05或P<0.01),DA含量顯著降低(P<0.01);珍珠粉中、高劑量組5-HT和GABA含量顯著升高(P<0.05),DA含量顯著降低(P<0.05);絞股藍(lán)珍珠粉膠囊各劑量組小鼠腦組織中 5-HT和GABA含量表現(xiàn)不同程度的增加(P<0.05或P<0.01或P<0.001),DA 含量不同程度的降低(P<0.05或P<0.01),各指標(biāo)表現(xiàn)出一定的劑量依賴性關(guān)系,且作用效果優(yōu)于絞股藍(lán)水提物和珍珠粉單藥組。由上可知,絞股藍(lán)珍珠粉膠囊對(duì)小鼠的改善睡眠作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠腦組織中的5-HT、GABA和DA的含量實(shí)現(xiàn)的。

表5 絞股藍(lán)珍珠粉膠囊、絞股藍(lán)水提物和珍珠粉對(duì)各組小鼠腦組織中 5-HT、GABA和DA含量的影響

3 討論

5-HT主要是在中樞神經(jīng)分布并投射廣泛,腦內(nèi)5-HT含量減少會(huì)導(dǎo)致機(jī)體失眠[14,15]。GABA是中樞神經(jīng)抑制性遞質(zhì),它主要是通過(guò)與GABA受體(GABAA)特異性結(jié)合而發(fā)揮鎮(zhèn)靜、催眠作用[16]。單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)DA具有維持覺(jué)醒和行為興奮的作用,其含量的升高可增加覺(jué)醒次數(shù),破壞睡眠的完整度[17]。

絞股藍(lán)主要有效成分為絞股藍(lán)總皂苷(Gypenoside,GPS)。徐露等[18]研究發(fā)現(xiàn),絞股藍(lán)總皂苷可以降低正常小鼠的自發(fā)活動(dòng),還可以加強(qiáng)戊巴比妥鈉對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制作用。江硯等[19]研究表明,絞股藍(lán)皂苷可以顯著降低大鼠下丘腦內(nèi)DA和去甲腎上腺素(Norepinephrine,NE)含量,還可以增加白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)含量,其改善睡眠機(jī)制可能與調(diào)節(jié)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)。珍珠作為一種名貴的中藥材,在我國(guó)的應(yīng)用已有幾千年的歷史。王麗云等[20]研究結(jié)果表明,珍珠粉內(nèi)的色氨酸可能作為其安神鎮(zhèn)靜成分,通過(guò)調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮和抑制從而起到催眠作用。潘建新等[21]研究了珍珠對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制作用,指出珍珠粉可以使小鼠腦內(nèi)5-HT水平升高,進(jìn)一步發(fā)揮改善睡眠的作用。

為了探討絞股藍(lán)珍珠粉膠囊對(duì)小鼠的改善睡眠作用及其可能作用機(jī)制,本試驗(yàn)通過(guò)延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗(yàn)和巴比妥鈉睡眠潛伏期試驗(yàn)觀察了絞股藍(lán)珍珠粉膠囊、絞股藍(lán)水提物和珍珠粉對(duì)小鼠睡眠的作用,并對(duì)小鼠腦組織中的5-HT、GABA和DA含量進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果顯示絞股藍(lán)珍珠粉膠囊在240 mg/(kg·bw)和480 mg/(kg·bw)劑量下對(duì)小鼠的改善睡眠作用明顯,此時(shí)小鼠腦組織的5-HT和GABA含量與空白對(duì)照組相比顯著升高(P<0.01或P<0.001),DA水平也顯著低于空白對(duì)照組(P<0.01)。提示絞股藍(lán)珍珠粉膠囊對(duì)小鼠的改善睡眠作用可能是通過(guò)5-HT、GABA和DA等多種神經(jīng)遞質(zhì)的共同調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上,本試驗(yàn)結(jié)果表明,絞股藍(lán)珍珠粉膠囊對(duì)小鼠改善睡眠作用良好,其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠腦中的 5-HT、GABA和DA 含量來(lái)發(fā)揮改善睡眠的作用,具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。