寇茜茜, 劉榮慧, 張 偉, 史 超, 陳創(chuàng)夫, 王 震, 張 輝

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院, 新疆 石河子 832000)

奶牛乳房炎多因飼養(yǎng)管理不當(dāng)、病原微生物侵害乳腺組織引發(fā),可導(dǎo)致乳房間質(zhì)和實(shí)質(zhì)發(fā)生炎癥,對(duì)牛奶質(zhì)量、養(yǎng)殖場(chǎng)經(jīng)濟(jì)和人體健康造成危害。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),我國(guó)奶牛乳房炎的感染率為30%～70%[1],其中病原微生物的入侵為主要因素,鏈球菌是引起奶牛乳房炎的主要病原菌[2]。本試驗(yàn)采集新疆維吾爾自治區(qū)石河子市某奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)中乳汁發(fā)黃并且有明顯的白色絮狀物的乳樣,通過(guò)B族鏈球菌顯色培養(yǎng)基和5%無(wú)菌脫纖維羊血血瓊脂培養(yǎng)基對(duì)鏈球菌進(jìn)行分離鑒定,經(jīng)生化試驗(yàn)和16S rDNA基因測(cè)序確定分離菌株分別為無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌,并對(duì)分離鑒定的鏈球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn),旨在為治療奶牛乳房炎提供科學(xué)合理的選藥參考。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源 2021年6月采集石河子市某奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)患有臨床型乳房炎奶牛的乳樣,共7頭,30份乳樣,乳樣均呈現(xiàn)稀薄、發(fā)黃,出現(xiàn)明顯的白色絮狀物。

1.2 主要試劑 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(Trypticase soy broth,TSB),購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司;B族鏈球菌顯色培養(yǎng)基,購(gòu)自上海欣中生物工程有限公司;腦心浸出液肉湯(Brain heart infusion broth,BHI)、革蘭染色液試劑盒、無(wú)菌脫纖維羊血、溶菌酶(100 mg/mL)和DNA Marker Ⅲ,均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;鏈球菌細(xì)菌生化編碼鑒定管、鏈球菌細(xì)菌生化編碼冊(cè)和藥敏紙片,均購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和2×EsTaqMasterMix,均購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技股份有限公司。

1.3 主要儀器 超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD),上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn);掌上離心機(jī)(S1010),美國(guó)SCILOGEX公司生產(chǎn);圓周振蕩器(Vortex Genius 3),德國(guó)IKA公司生產(chǎn);PCR儀(LabCycler),德國(guó)SENSO公司生產(chǎn);電泳儀(DYY-6C型),北京市六一儀器廠生產(chǎn);瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)(DocTMXR+),美國(guó)BIO-RAD公司生產(chǎn);微量離心機(jī)(Pico21),賽默飛世爾公司生產(chǎn)。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)菌的分離鑒定 將臨床型乳房炎乳樣離心,棄上清,將沉淀加入至TSB中,振蕩過(guò)夜培養(yǎng),液體渾濁后在B族鏈球菌顯色培養(yǎng)基平板上四區(qū)劃線,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),分別挑取紫紅色和深藍(lán)色單菌落再次進(jìn)行增菌、純化,初步分離菌株,將純化菌株劃線接種至5%無(wú)菌脫纖維羊血血瓊脂培養(yǎng)基,觀察其溶血性,同時(shí)進(jìn)行革蘭染色鏡檢。

1.4.2 細(xì)菌的生化鑒定 用接種環(huán)挑取疑似病原菌的純培養(yǎng)物,接種到鏈球菌細(xì)菌生化編碼鑒定管,于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h,觀察鏈球菌細(xì)菌生化編碼鑒定管的變色情況,并根據(jù)鏈球菌細(xì)菌生化編碼冊(cè)生成細(xì)菌編碼值,初步判定鏈球菌種類(lèi)。

1.4.3 細(xì)菌的16S rDNA鑒定 使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取疑似鏈球菌分離菌株的基因組DNA,并將其作為PCR反應(yīng)模板。選擇上游引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和下游引物1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)作為PCR反應(yīng)引物。PCR反應(yīng)體系(25 μL):Mix 12.5 μL,ddH2O 9.7 μL,上、下游引物各0.4 μL,DNA模板2.0 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性40 s,54.8 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min 30 s,共30個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后進(jìn)行回收,送至青島生工生物科技有限公司測(cè)序,并將結(jié)果上傳到美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)進(jìn)行序列比對(duì),確定菌種。于NCBI中選擇與鏈球菌分離菌株相同種屬但不同菌株的序列,并在MEGA 7程序中進(jìn)行比較分析,根據(jù)比對(duì)結(jié)果生成進(jìn)化樹(shù)。

1.4.4 藥敏試驗(yàn) 選擇14種常用抗菌藥進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。在BHI固體平板上用涂布棒將菌液涂布均勻后貼藥敏紙片,平放10 min后反轉(zhuǎn)平板,37 ℃培養(yǎng)18～24 h,測(cè)量抑菌圈直徑。分離菌株的耐藥性和敏感性判斷依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)2018標(biāo)準(zhǔn)[3]。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離鑒定 分別觀察純化后的細(xì)菌在B族鏈球菌顯色培養(yǎng)基、5%無(wú)菌脫纖維羊血血瓊脂培養(yǎng)基和革蘭染色鏡檢的菌落形態(tài),結(jié)果顯示:B族鏈球菌顯色培養(yǎng)基中有紫紅色(命名為Shz-1)、淡紫色(命名為Shz-2和Shz-3)、深藍(lán)色(命名為Shz-4和Shz-5)的邊緣整齊、有光澤的菌落;Shz-1在5%無(wú)菌脫纖維羊血血瓊脂培養(yǎng)基具有溶血環(huán),Shz-2～Shz-5沒(méi)有溶血環(huán)(圖1),Shz-1～Shz-5均呈現(xiàn)灰白色、針尖大小菌落;革蘭染色鏡檢結(jié)果均呈紫色,為革蘭陽(yáng)性菌,細(xì)菌形態(tài)均呈鏈狀(圖2)。根據(jù)B族鏈球菌顯色培養(yǎng)基、5%無(wú)菌脫纖維羊血血瓊脂培養(yǎng)基和革蘭染色鏡檢結(jié)果,可初步判定Shz-1～Shz-5為鏈球菌。

圖2 分離菌株的革蘭染色鏡檢(1 000×)

2.2 細(xì)菌的生化鑒定 生化鑒定結(jié)果顯示,Shz-1葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水(VP)、精氨酸脫羧酶(Arginine decarboxylase test,ARG)、PMG、蔗糖和溶血性試驗(yàn)為陽(yáng)性,其余為陰性;Shz-2 ARG、蕈糖和蔗糖試驗(yàn)為陽(yáng)性,其余為陰性;Shz-3 ARG、DPP、蕈糖、蔗糖和山梨醇試驗(yàn)為陽(yáng)性,其余為陰性;Shz-4L-吡咯烷酮β-萘酚酰胺(Pyrrolidonase,PYR)、VP、ARG、七葉苷、MAG、蕈糖、蔗糖和山梨醇試驗(yàn)為陽(yáng)性,其余為陰性;Shz-5 VP、ARG、七葉苷、MAG、蕈糖、蔗糖和山梨醇試驗(yàn)為陽(yáng)性,其余為陰性(表1)。

表1 分離菌株的生化鑒定

將鏈球菌細(xì)菌生化編碼冊(cè)作為評(píng)判鏈球菌的生化鑒定結(jié)果的參考標(biāo)準(zhǔn),分離菌株Shz-1～Shz-5的編碼值分別為3 205、1 014、1 416、7 156和2 156,是無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌所在編碼值。

2.3 細(xì)菌的16S rDNA鑒定 提取生化鑒定疑似鏈球菌分離菌株的DNA,進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增,最終獲得接近1 500 bp的DNA擴(kuò)增片段(圖3)。測(cè)序結(jié)果顯示,Shz-1與無(wú)乳鏈球菌的同源性達(dá)到99.65%,Shz-2和Shz-3與停乳鏈球菌的同源性達(dá)到99.79%和99.97%,Shz-4和Shz-5與乳房鏈球菌的同源性達(dá)到99.72%和99.72%。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可初步判斷Shz-1屬于無(wú)乳鏈球菌分支,Shz-2和Shz-3屬于停乳鏈球菌分支,Shz-4和Shz-5屬于乳房鏈球菌分支(圖4)。

圖3 分離菌株16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增

2.4 藥敏試驗(yàn) 紙片藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,鏈球菌分離菌株對(duì)頭孢噻吩、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素和萬(wàn)古霉素均產(chǎn)生耐藥性;無(wú)乳鏈球菌(Shz-1)對(duì)青霉素G、氨芐西林、紅霉素、克林霉素、氧氟沙星和復(fù)方新諾明高度敏感;停乳鏈球菌1(Shz-2)對(duì)14種抗菌藥均具有耐藥性,停乳鏈球菌2(Shz-3)對(duì)復(fù)方新諾明敏感,對(duì)其余抗菌藥不敏感;乳房鏈球菌1(Shz-4)對(duì)青霉素G和氨芐西林高度敏感,乳房鏈球菌2(Shz-5)對(duì)青霉素G高度敏感,對(duì)其余抗菌藥均產(chǎn)生耐藥(表2)。

3 討論

奶牛乳房炎是影響乳品質(zhì)和奶牛場(chǎng)經(jīng)濟(jì)效益的主要原因,甚至損害人體健康。多種病原菌都可導(dǎo)致奶牛感染乳房炎,常見(jiàn)的有金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無(wú)乳鏈球菌和糞腸球菌等,其中無(wú)乳鏈球菌具有高度傳染性并且是專(zhuān)性乳腺寄生菌[4],嚴(yán)重影響產(chǎn)奶量、牛奶品質(zhì)和人畜健康。李心海等[5]對(duì)徐州市臨床型乳房炎樣品進(jìn)行檢測(cè),其中無(wú)乳鏈球菌分離率為18.92%,停乳鏈球菌分離率為27.03%,乳房鏈球菌分離率為5.41%。劉國(guó)惠等[6]采集常州市武進(jìn)區(qū)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)臨床型奶牛乳房炎乳樣,乳房鏈球菌的分離率為53%,停乳鏈球菌的分離率為29%,無(wú)乳鏈球菌的分離率為27%。馬博等[7]對(duì)新疆石河子地區(qū)乳房炎乳樣的檢測(cè)結(jié)果顯示,鏈球菌的分離率高達(dá)33.33%。本試驗(yàn)采集石河子市臨床型乳房炎乳樣,同樣分離出鏈球菌,包括無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌。之所以我國(guó)大部分地區(qū)都存在鏈球菌感染導(dǎo)致的奶牛乳房炎,是因?yàn)殒溓蚓鷱V泛存在于自然界中,停乳鏈球菌、乳房鏈球菌為環(huán)境致病菌,無(wú)乳鏈球菌為傳染性致病菌,養(yǎng)殖場(chǎng)的飼養(yǎng)環(huán)境易引起由環(huán)境致病菌導(dǎo)致的奶牛乳房炎,擠乳員、擠乳用具和器械未消毒易導(dǎo)致由無(wú)乳鏈球菌引起的奶牛乳房炎[8,9]。

本試驗(yàn)藥敏分析結(jié)果顯示,鏈球菌分離菌株對(duì)頭孢噻吩、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素和萬(wàn)古霉素均產(chǎn)生耐藥性。本試驗(yàn)無(wú)乳鏈球菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果與高菊梅[10]對(duì)銀川及周邊地區(qū)牛場(chǎng)臨床性乳房炎的藥敏試驗(yàn)結(jié)果相差較大;停乳鏈球菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果與吳利軍等[11]的研究結(jié)果基本一致;阮智楊等[12]分離的乳房鏈球菌對(duì)青霉素、阿莫西林和慶大霉素敏感,對(duì)頭孢氨芐、頭孢噻呋、林可霉素和頭孢喹肟耐藥,與本試驗(yàn)乳房鏈球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果相差不大。不同地區(qū)之間甚至同一地區(qū)內(nèi)的抗微生物藥物耐藥性都可能不同,這與當(dāng)?shù)氐挠盟幜?xí)慣有很大的關(guān)系,持續(xù)監(jiān)測(cè)病原菌對(duì)抗菌藥的敏感性對(duì)治療不同地區(qū)奶牛乳房炎具有重要意義[13]。由此可見(jiàn),石河子市某牛場(chǎng)分離出的鏈球菌對(duì)臨床常用藥物已具有耐藥性,如氨基糖苷類(lèi)和四環(huán)素類(lèi),在治療時(shí)應(yīng)淘汰已具有耐藥性的藥物或者經(jīng)常更換抗菌藥。細(xì)菌的分離鑒定和藥敏試驗(yàn)可為養(yǎng)殖場(chǎng)提供科學(xué)使用抗菌藥、靶向用藥的思路,從而降低長(zhǎng)期不良使用抗菌藥帶來(lái)的耐藥性危害。