韓 瑞, 郝成武, 馬長賓, 張 銳, 凌 晨, 賀 筍

(1.天康生物制藥有限公司, 新疆 烏魯木齊 830032 ; 2. 新疆建設兵團第六師五家渠市畜牧獸醫(yī)工作站, 新疆 五家渠 831300)

溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahacmolytica,Mh)是引起牛呼吸道疾病(Bovine respiratory disease,BRD)的主要病原菌之一[1],屬于曼氏桿菌屬,革蘭陰性短桿菌,無芽孢,有莢膜和菌毛,不運動,瑞氏染色呈兩極著色,在牛血瓊脂培養(yǎng)基上呈不太明顯的β溶血。溶血性曼氏桿菌按莢膜抗原分型可分為12種血清型,其中莢膜血清型A1型和A6型在牛病中比較常見,A2型在羊病中比較常見,可引起牛、羊肺炎,新生羔羊敗血癥等疾病[2]。溶血性曼氏桿菌是條件致病菌,當牛只受到外界的刺激,如環(huán)境(斷奶、運輸、混群等)、自身抵抗力下降和其他病原感染時,會引起牛只發(fā)病,嚴重時可造成死亡,給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失,僅北美,溶血性曼氏桿菌給肉牛養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟損失高達每年數(shù)10億美元[3]。本試驗通過對新疆維吾爾自治區(qū)北疆養(yǎng)殖場發(fā)病牛進行溶血性曼氏桿菌的分離鑒定,并對其生物學特性進行分析,以期為疫苗的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 TaKaRa核酸提取試劑盒、2×PCR Mix和1×TAE電泳緩沖液等,均購自寶生物工程(大連)有限公司;腦心浸液培養(yǎng)基,購自法國生物梅里埃公司;細菌微量生化反應管、細菌藥敏紙片和革蘭染液,均購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2 主要儀器 超凈工作臺,購自蘇州安泰空氣技術有限公司;普通光學顯微鏡,購自日本奧林帕斯公司;pH計,購自德國賽多利斯公司;DYY-6C電泳儀,購自北京市六一儀器廠;PCR擴增儀,購自美國BioRad公司;電泳凝膠成像儀,購自日本PhotoFilm公司。

1.3 病原菌的分離 病料來源于新疆維吾爾自治區(qū)北疆3個奶牛養(yǎng)殖場和2個肉牛養(yǎng)殖場,取有肺炎癥狀死亡牛的肺臟樣品和有呼吸道癥狀牛的鼻拭子樣品,共20份。將采集的病料接種于腦心浸液鮮血固體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)18～24 h后觀察,挑取直徑1～2 mm、露滴狀溶血菌落進行革蘭染色。革蘭染色呈紅色的小球桿菌為可疑菌落,對其進行傳代純化,將純培養(yǎng)物接種腦心浸液液體培養(yǎng)基,進一步進行生化特性和PCR鑒定。

1.4 生化特性 將純化好的可疑菌落,參照細菌微量生化反應管說明書中方法進行生化鑒定:葡萄糖、海藻糖、木糖、阿拉伯糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、吲哚、氧化酶和脲酶試驗。

1.5 PCR檢測

1.5.1 PCR引物 參照參考文獻[4-8]設計引物(表1),由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以溶血性曼氏桿菌全基因組序列設計并合成Mh引物,對分離菌株進行菌種鑒定;分別以Hyp、Core2和TupA為靶基因進行PCR擴增,鑒定分離菌株的血清型;分別以lktC、plpE、gs60、gcp和tbpB為靶基因進行PCR擴增,鑒定分離菌株的毒力基因。

表1 PCR引物信息

1.5.2 PCR擴增 分別取200 μL的肺臟組織懸液和鼻拭子懸液,加入1.5 mL離心管中,按照TaKaRa 核酸提取試劑盒說明書進行DNA提取,并置-20 ℃以下保存。PCR擴增體系(25 μL):模板DNA 2 μL,2×PCR Mix 12.5 μL,10 μmol/L上游引物 0.5 μL,10 μmol/L下游引物0.5 μL,補加ddH2O 9.5 μL。PCR反應條件:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,54 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,共30個循環(huán);72 ℃延伸10 min;2～8 ℃保存。取10 μL PCR擴增產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像系統(tǒng)觀察結果。

1.6 藥敏試驗 采取紙片擴散法檢測分離菌株對9種抗菌藥物[恩諾沙星、氧氟沙星、呋喃唑酮、新霉素、青霉素、慶大霉素、四環(huán)素、頭孢拉啶和頭孢唑啉]的敏感性,試驗操作方法和判定標準按照細菌藥敏紙片使用說明書進行。

1.7 小鼠毒力測定 將分離菌株接種腦心浸液培養(yǎng)基,置37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中,以200 r/min培養(yǎng)8～12 h,收集菌液并計數(shù)。將分離菌株原菌液濃縮后,用PBS(0.01 mmol/L,pH=7.4)將菌液濃度依次調整為1.7×1010、1.7×109、1.7×108、1.7×107和1.7×106CFU/mL,每個梯度選取10只小鼠作為攻毒組,每只小鼠腹腔注射0.5 mL菌液。另設5只小鼠作為對照組,每只小鼠腹腔注射0.5 mL PBS。攻毒后連續(xù)觀察7 d,統(tǒng)計小鼠死亡情況。采用寇氏法計算小鼠半數(shù)致死量(Lethal dose 50%,LD50)[9]。

2 結果

2.1 病原菌的分離 將采集的病料劃線接種于腦心浸液鮮血固體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)18～24 h后,可見直徑1～2 mm、露滴狀溶血菌落。從中挑取溶血單菌落分離純化,共獲得7株革蘭陰性、兩極鈍圓的短桿菌。

2.2 生化特性 7株分離菌株脲酶和吲哚均為陰性;氧化酶均為陽性;均不發(fā)酵阿拉伯糖和乳糖;均發(fā)酵木糖、麥芽糖、蔗糖和葡萄糖;5/7發(fā)酵甘露醇,2/7發(fā)酵海藻糖。分離菌株符合溶血性曼氏桿菌的生化特性。

2.3 PCR檢測

2.3.1 菌種鑒定和莢膜血清型鑒定 將7株分離菌株分別用檢測Mh的菌種鑒定引物進行PCR鑒定,結果如圖1所示,4株分離菌株呈陽性。用3個分型引物對4株分離菌株進行PCR分型鑒定,結果如圖2所示,3株為莢膜血清A6型,1株為莢膜血清A1型,分別命名為TK-TC1(A1型)、TK-YL3(A6型)、TK-YL4(A6型)和TK-YL7(A6型)。

圖1 分離菌株Mh菌種的PCR鑒定

圖2 分離菌株Mh血清型的PCR鑒定

2.3.2 毒力基因PCR檢測 將TK-TC1株(1號)、TK-YL3株(2號)、TK-YL4株(3號)和TK-YL7株(4號)4株分離菌株分別用lktC、plpE、gs60、gcp和tbpB基因引物進行PCR擴增,結果如圖3所示,4株分離菌株均能擴增出lktC、plpE、gs60、gcp和tbpB五種毒力基因。

圖3 分離菌株lktC、plpE、gs60、gcp和tbpB毒力基因的PCR檢測

2.4 藥敏試驗 將4株分離菌株分別進行9種抗菌藥物的敏感性測試,結果如表2所示,4株分離菌株均對恩諾沙星、氧氟沙星、呋喃唑酮、新霉素、青霉素和慶大霉素表現(xiàn)出耐藥,對四環(huán)素、頭孢拉啶和頭孢唑啉敏感。

表2 分離菌株藥敏試驗

表3 分離菌株半數(shù)致死劑量測定

2.5 小鼠毒力測定 將4株分離菌株培養(yǎng)物按不同劑量分別腹腔注射小鼠,1.7×1010～1.7×108CFU/mL 攻毒組小鼠陸續(xù)出現(xiàn)死亡。4株分離菌株對小鼠的LD50分別為TK-TC1株=2.7×107CFU/mL;TK-YL3株=8.5×107CFU/mL;TK-YL4株=5.4×108CFU/mL;TK-YL7株=2.1×109CFU/mL,其中TK-TC1株毒力最強。

3 討論

牛呼吸道疾病一直是危害養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展的一類重要疾病,引起該病的主要細菌性病原為牛支原體、多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌、化膿隱秘桿菌和嗜昏睡桿菌等。隨著我國養(yǎng)牛規(guī)模的逐年增加和飼料禁抗政策的執(zhí)行,呼吸道疾病已成為制約養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展的一個重要因素,因此,牛呼吸道疾病越來越受到廣大養(yǎng)殖者的重視。目前,溶血性曼氏桿菌基因鑒定大多采用16S rRNA基因PCR擴增,測序后進行序列比對,該方法雖然能分型但檢測周期較長。韓林梅以溶血性曼氏桿菌的唾液酸蛋白酶基因為靶基因,設計環(huán)介導等溫擴增法進行溶血性曼氏桿菌的檢測,該方法特異性高,靈敏度與PCR方法一致[8]。謝倩茹等根據(jù)牛溶血性曼氏桿菌全基因組序列設計并合成引物,進行溶血性曼氏桿菌鑒定,建立的PCR方法特異性高[5]。本試驗通過菌株培養(yǎng)特性、生化特性和PCR鑒定,成功從20份病牛的肺臟和鼻拭子樣品中分離鑒定出4株溶血性曼氏桿菌,并通過Klima等建立的血清型多重PCR方法[4],成功鑒定出1株A1型和3株A6型菌株。國外報道的牛源溶血性曼氏桿菌感染以血清型A1型較多,近年來A6型的比例也越來越高[10],國內研究報道以A1型和 A6型為主[11],但感染羊的溶血性曼氏桿菌A2型近年來也有感染牛的報道[12],這表明國內引起牛呼吸道疾病的溶血性曼氏桿菌血清型越來越豐富。針對多個血清型溶血性曼氏桿菌進行生物學分析,對后續(xù)溶血性曼氏桿菌多價疫苗的研發(fā)以及牛呼吸道疾病的防控具有重要意義。

目前,國內外針對溶血性曼氏桿菌的毒力因子已展開深入研究,發(fā)現(xiàn)白細胞毒素(Leukotoxin,LKT)是關鍵毒力因子,在溶血性曼氏桿菌的感染和致病中,都具有不可替代的作用[13,14]。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)也是溶血性曼氏桿菌的重要毒力因子且其在細菌干重中占比很高,同時能與LKT毒素聯(lián)合,增加其對細胞的毒性[15]。菌毛在細菌感染過程中起到附著定植的作用,溶血性曼氏桿菌也含有菌毛,但其編碼黏附素的基因還有待研究[16]。溶血性曼氏桿菌滅活疫苗研發(fā)的難點在于該菌血清型多而且呈地域性流行,開發(fā)廣譜性疫苗難度極大。目前,國內外市售的疫苗主要有菌體加白細胞毒素和與其他細菌(如多殺性巴氏桿菌、嗜昏睡桿菌)、病毒的多聯(lián)、多價疫苗。本試驗對4個分離株菌進行白細胞毒素(lktC)、外膜蛋白(plpE、gs60)、轉鐵蛋白(tbpB)和唾液酸酶(gcp)5 種毒力因子檢測,結果顯示,4株溶血性曼氏桿菌均含有這5種毒力因子,為深入地研究溶血性曼氏桿菌亞單位疫苗提供參考。

國外對溶血性曼氏桿菌引起的牛呼吸道疾病的研究較早,目前已有市售的商品化疫苗,但傳統(tǒng)療法依然基于抗生素,長期大量使用抗生素會導致用藥效果下降,從而增加疾病的發(fā)病率[17]。Katsuda等和冉艾等報道顯示,溶血性曼氏桿菌對土霉素、慶大霉素、氯霉素、卡那霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、左氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、替米考星、氧氟沙星、恩諾沙星、頭孢噻吩、頭孢拉啶、頭孢噻肟和頭孢唑啉敏感,對氨芐西林、復方新諾明、甲氧芐胺嘧啶和氟苯尼考耐藥[18,19]。為了篩選出敏感性抗菌藥物,本試驗用9種抗菌藥物對4株分離菌株進行藥物敏感性試驗,結果顯示,4株分離菌株均對恩諾沙星、氧氟沙星、呋喃唑酮、新霉素、青霉素和慶大霉素表現(xiàn)出耐藥,對四環(huán)素、頭孢拉啶和頭孢唑啉敏感。藥敏試驗結果可對牛場由溶血性曼氏桿菌引起的呼吸道疾病的治療提供參考。