吳海港, 武 嫻, 倪 晗, 陳建文, 劉錦妮

(1. 信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院, 河南 信陽(yáng) 464000 ; 2. 河南普瑞科伯樂(lè)獸藥有限公司, 河南 新鄉(xiāng) 453400 ;3. 河南省長(zhǎng)垣職業(yè)中等專(zhuān)業(yè)學(xué)校, 河南 新鄉(xiāng) 453400)

布替萘芬(Butenafine,BTF)是一種高效、低毒的丙烯胺類(lèi)抗真菌藥物,具有較強(qiáng)的抑菌和殺菌效果,并在抗炎方面具有確切效果,臨床主要用于治療敏感菌所引起的足癬、體癬和股癬等真菌性疾病[1-4]。目前,市售BTF制劑主要有凝膠劑、擦劑、乳膏劑和噴霧劑等,凝膠劑和乳膏劑的透皮速率較慢,藥物在皮膚中的累積濃度較小[5,6];擦劑和噴霧劑的透皮速率較快,但藥物在皮膚表面滯留時(shí)間較短,導(dǎo)致其抗真菌效果不理想[7,8]。此外,大多數(shù)BTF制劑無(wú)法通過(guò)角質(zhì)層滲透進(jìn)入皮膚。因此,有必要開(kāi)發(fā)新型BTF制劑以提高其治療效果。

醇質(zhì)體系統(tǒng)是一種新型柔性納米脂質(zhì)體,是由卵磷脂、乙醇和水組成的具有脂質(zhì)雙分子結(jié)構(gòu)的囊泡結(jié)構(gòu)[9,10]。與普通脂質(zhì)體相比,醇質(zhì)體結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定、包封率較高、粒徑較小,有更好的膜流動(dòng)性,可增加藥物在皮膚局部的累積濃度[11,12]。此外,醇質(zhì)體本身屬于與皮脂相似的類(lèi)脂,可促使攜帶藥物穿過(guò)皮膚角質(zhì)層到達(dá)深層皮膚,是一種良好的皮膚給藥載體[13-15],在局部和全身治療方面具有很好的應(yīng)用前景。因此,本試驗(yàn)采用乙醇注入法制備布替萘芬醇質(zhì)體,通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化處方,確定布替萘芬醇質(zhì)體的最佳制備工藝,為布替萘芬新制劑的研發(fā)提供參考,并為開(kāi)發(fā)透皮給藥系統(tǒng)新劑型提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要儀器 HS-17型數(shù)顯加熱攪拌器(上海力辰儀器科技有限公司);JD-1003型電子分析天平(東莞電子儀器設(shè)備有限公司);Avanti J-E型高速離心機(jī)(Beckman公司);紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);Zs90型激光納米粒徑測(cè)定儀(Malvern公司);JEM- 1200EX型透射電子顯微鏡(NEC公司)。

1.1.2 主要藥品和試劑 布替萘芬,購(gòu)自四川明欣藥業(yè)有限公司;吐溫-80,購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;丙二醇和無(wú)水乙醇均為分析純,均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;大豆卵磷脂,購(gòu)自上海善優(yōu)生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 布替萘芬醇質(zhì)體的制備 準(zhǔn)確稱(chēng)取大豆卵磷脂50 mg、布替萘芬100 mg、吐溫-80 0.1 mL和丙二醇2.0 mL,加入含18 mL無(wú)水乙醇的潔凈瓶中,(45±1)℃水浴條件下,900 r/min攪拌3 min,充分溶解后用10 mL注射器以1.5 mL/min的速率緩慢勻速滴加適量的蒸餾水(pH 7.0),900 r/min攪拌40 min,0.22 μm微孔膜濾過(guò),即得布替萘芬醇質(zhì)體,并于4 ℃密封保存。

1.2.2 布替萘芬標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 稱(chēng)取布替萘芬標(biāo)準(zhǔn)品,用無(wú)水乙醇稀釋成1、3、5、10、30、50、70和100 μg/mL的系列溶液,在282 nm 處分別測(cè)定其光密度(Optical density,OD)值,以布替萘芬質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo),OD值(Y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.3 包封率的測(cè)定 取適量的布替萘芬醇質(zhì)體溶液,10 000 r/min離心10 min,將100 μL上清液置于10 mL容量瓶中,加無(wú)水乙醇稀釋至刻度線(xiàn),按1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算未包封的布替萘芬含量(C),按公式(1)計(jì)算未包封布替萘芬的質(zhì)量,按公式(2)計(jì)算包封率(Encapsulation efficiency,EE)。

未包封布替萘芬的質(zhì)量(m1)=C×V×稀釋倍數(shù)

(1)

包封率(%)=(m2-m1)÷m2×100%

(2)

其中:V為布替萘芬醇質(zhì)體的體積;m2為初始制備時(shí)加入布替萘芬的質(zhì)量。

1.2.4 滲漏率的測(cè)定 測(cè)定布替萘芬醇質(zhì)體首日的包封率后,在一定條件下保存一段時(shí)間后再測(cè)定其包封率,按公式(3)計(jì)算滲漏率。

滲漏率(%)=(首日包封率-定期測(cè)定包封率)÷首日包封率×100%

(3)

1.2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化布替萘芬醇質(zhì)體處方 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,選擇藥物與大豆卵磷脂質(zhì)量比(藥脂比A)、無(wú)水乙醇與水體積比(醇水比B)、乙醇與丙二醇體積比(乙丙比C)、攪拌溫度(D)、攪拌時(shí)間(E)、攪拌轉(zhuǎn)速(F)、吐溫-80含量(G)為考察因素,以包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo),采用(L1837)正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn),因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素和水平

1.2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 按1.2.5中最優(yōu)處方,平行制備3批布替萘芬醇質(zhì)體,測(cè)定其包封率,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative standard deviation,RSD)。

1.2.7 布替萘芬醇質(zhì)體的質(zhì)量評(píng)價(jià)

1.2.7.1 外觀(guān)和形態(tài)特征 將布替萘芬醇質(zhì)體轉(zhuǎn)移至透明玻璃瓶中,拍照后描述布替萘芬醇質(zhì)體的外觀(guān)性狀。

1.2.7.2 粒徑分布 取布替萘芬醇質(zhì)體2 mL,在25 ℃條件下采用激光納米粒徑測(cè)定儀測(cè)定布替萘芬醇質(zhì)體的平均粒徑。

1.2.7.3 形態(tài)學(xué)觀(guān)察 將布替萘芬醇質(zhì)體滴加在銅網(wǎng)上,用2%磷鎢酸溶液復(fù)染后自然干燥,在透射電鏡下觀(guān)察布替萘芬醇質(zhì)體的形態(tài)。

1.2.7.4 穩(wěn)定性分析 將布替萘芬醇質(zhì)體分別在冷藏(4 ℃)和室溫(25 ℃)下保存21 d,測(cè)定布替萘芬醇質(zhì)體包封率,并計(jì)算其滲漏率;觀(guān)察布替萘芬醇質(zhì)體的外觀(guān)特征,考察其穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 布替萘芬標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 結(jié)果如圖1所示,布替萘芬質(zhì)量濃度與OD值的回歸方程為Y=0.020 9X+0.141 1(r=0.999)。

圖1 布替萘芬標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化布替萘芬醇質(zhì)體處方 結(jié)果如表2所示,由極差(R)可知,7個(gè)因素對(duì)布替萘芬醇質(zhì)體包封率均有不同程度的影響,按照影響程度由大到小的順序依次為:醇水比(B)>攪拌溫度(D)>藥脂比(A)>乙丙比(C)>攪拌時(shí)間(E)>吐溫-80含量(G)>攪拌轉(zhuǎn)速(F);根據(jù)R值和方差分析結(jié)果,確定布替萘芬醇質(zhì)體的最佳制備工藝條件為:A3B3C2D1E2F3G1,即布替萘芬∶大豆卵磷脂為2∶1,無(wú)水乙醇∶水為4∶6,乙醇∶丙二醇為9∶1,吐溫-80含量為 0.1 mL,攪拌時(shí)間為40 min,攪拌溫度為45 ℃,攪拌轉(zhuǎn)速為900 r/min。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 按最優(yōu)處方平行制備3批布替萘芬醇質(zhì)體,包封率分別為82.55%、81.12%和80.40%,平均包封率為81.36%,RSD為1.09%,表明制備工藝重現(xiàn)性良好。

2.4 布替萘芬醇質(zhì)體的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.4.1 外觀(guān)和形態(tài)特征 布替萘芬醇質(zhì)體外觀(guān)為透光、淡黃色、均一穩(wěn)定的液體,無(wú)分層和沉淀現(xiàn)象,可觀(guān)察到微泛淡藍(lán)色的乳光(圖2);光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察,其形態(tài)為球形或近球形(圖3)。

圖2 布替萘芬外觀(guān)評(píng)價(jià)

圖3 光學(xué)顯微鏡觀(guān)察布替萘芬醇質(zhì)體的外觀(guān)形態(tài)(400×)

2.4.2 粒徑分布 布替萘芬醇質(zhì)體的平均粒徑為(262.40±2.47)nm,粒徑較小,且出現(xiàn)單一的峰波,粒徑分布集中,均一性良好(圖4)。

圖4 布替萘芬醇質(zhì)體粒徑分布

2.4.3 形態(tài)學(xué)觀(guān)察 透射電鏡觀(guān)察可見(jiàn)布替萘芬醇質(zhì)體外形圓整,為雙分子層囊泡結(jié)構(gòu)的類(lèi)球形,且分布較為均勻(圖5)。

圖5 透射電鏡觀(guān)察布替萘芬醇質(zhì)體形態(tài)(A:20 000×;B:200 000×)

2.4.4 穩(wěn)定性分析 4 ℃和25 ℃條件下,布替萘芬醇質(zhì)體樣品的平均首日包封率分別為(81.36±1.09)% 和(81.38±1.05)%,21 d后平均包封率分別為(77.62±1.75)% 和(73.09±2.23)%,滲漏率分別為4.60%和10.19%。對(duì)布替萘芬醇質(zhì)體進(jìn)行形態(tài)觀(guān)察,布替萘芬醇質(zhì)體呈淡黃色、透明、均一穩(wěn)定的液體,無(wú)明顯顏色變化,且無(wú)分層和析出現(xiàn)象。

3 討論

磷脂是構(gòu)成醇質(zhì)體的骨架材料,磷脂的性質(zhì)決定著醇質(zhì)體囊泡雙分子層膜的形成和穩(wěn)定性。研究表明,采用磷脂酰膽堿含量高的磷脂制備的醇質(zhì)體囊泡穩(wěn)定性更好[16]。因此,本試驗(yàn)選擇大豆卵磷脂作為醇質(zhì)體的骨架材料。此外,磷脂的濃度也是影響醇質(zhì)體的重要因素之一,隨著磷脂濃度的增加,醇質(zhì)體的粒徑隨之增大,其包封率也將隨之增加,但隨著醇質(zhì)體粒徑增大,醇質(zhì)體的滲透性會(huì)降低[17]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)藥脂比為2∶1時(shí),所制備的布替萘芬醇質(zhì)體為淡黃色透明液體,包封率為81.36%,放置21 d后醇質(zhì)體狀態(tài)穩(wěn)定,無(wú)渾濁和沉淀現(xiàn)象。

研究表明,在一定濃度范圍內(nèi),醇質(zhì)體的包封率隨著乙醇濃度的增加而增加。過(guò)低的乙醇濃度會(huì)導(dǎo)致醇質(zhì)體的粒徑減少,不利于藥物的包封;當(dāng)乙醇的濃度過(guò)高時(shí),會(huì)使乙醇和磷脂烴鏈相互滲透,造成醇質(zhì)體的雙層結(jié)構(gòu)被部分溶解,磷脂的雙分子層結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,進(jìn)而導(dǎo)致藥物滲漏,包封率下降[18,19]。因此,選擇合適的乙醇濃度對(duì)醇質(zhì)體的形成和穩(wěn)定性有十分重要的影響。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,醇水比在4∶6時(shí),所制備的布替萘芬醇質(zhì)體的包封率和外觀(guān)形態(tài)達(dá)到最優(yōu)狀態(tài)。乙醇雖然是醇質(zhì)體的重要組成部分,但乙醇具有加熱揮發(fā)性,容易導(dǎo)致藥物泄露,穩(wěn)定性差,因此,在生產(chǎn)中可以與其他醇類(lèi)物質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用。丙二醇黏度大,不易揮發(fā),刺激性小,可增加醇質(zhì)體的穩(wěn)定性,乙醇與丙二醇合用既可增加藥物的溶解度,又可產(chǎn)生顯著的促透協(xié)同作用,并可改善乙醇揮發(fā)性及減輕對(duì)皮膚的刺激性[20]。何一鳴等[21]研究表明,當(dāng)乙醇∶丙二醇的體積比為7∶3時(shí),包封率可達(dá)到70%左右。本試驗(yàn)中選取的乙醇∶丙二醇的體積比為9∶1,包封率達(dá)到了81.36%。

滴加速度、溫度是影響醇注入法制備醇質(zhì)體的重要因素之一。研究表明,滴加速度過(guò)快或滴加速度不均勻?qū)?dǎo)致膜的流動(dòng)性增強(qiáng),加劇薄膜的吸水破裂現(xiàn)象,進(jìn)而破壞醇脂體的形態(tài)結(jié)構(gòu),降低包封率[22]。攪拌時(shí)溫度也會(huì)影響醇質(zhì)體的包封率,攪拌時(shí)溫度過(guò)高會(huì)使得乙醇揮發(fā)過(guò)快,卵磷脂還未來(lái)得及與乙醇相互融合就已經(jīng)被高溫熔化,出現(xiàn)分層絮狀物,從而降低包封率;溫度過(guò)低不能夠達(dá)到磷脂固體物質(zhì)的熔點(diǎn),會(huì)導(dǎo)致包封率降低[23]。因此,本試驗(yàn)選擇攪拌溫度在45 ℃時(shí),以1.5 mL/min的速率勻速滴加,以保證穩(wěn)定的包封率和粒徑。

表面活性劑能改善醇質(zhì)體囊膜的流動(dòng)性,并能抑制醇質(zhì)體微粒的聚集,從而提高醇質(zhì)體的穩(wěn)定性[24]。楊效宇等[25]研究表明,加入少量的吐溫-80既可以提高藥物的包封率,又可以解決在靜置過(guò)程中聚集沉淀的問(wèn)題。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,加入0.1 mL的吐溫-80可顯著提高布替萘芬醇質(zhì)體的包封率,這與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相一致。

本試驗(yàn)采用乙醇注入法制備布替萘芬醇質(zhì)體,形態(tài)均勻,平均包封率為(81.36±1.09)%,平均粒徑為(262.4±2.47)nm,且在4 ℃和25 ℃條件下避光放置21 d后,無(wú)分層、無(wú)沉淀和顏色變化。結(jié)果表明,采取乙醇注入法制備布替萘芬醇質(zhì)體操作易行,包封率較高,穩(wěn)定性良好,具有較好的應(yīng)用前景。