王曉茵, 武云龍,, 孫曉亮, 李木子, 宋翠平, 曹旭敏, 霍乃蕊, 趙思俊

(1. 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心, 山東 青島 266032 ; 2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院, 山西 太谷 030800)

我國(guó)是肉雞和蛋雞飼養(yǎng)大國(guó),2020年產(chǎn)量達(dá)1 480余萬(wàn)噸[1],為我國(guó)動(dòng)物蛋白的消費(fèi)提供了保障。在養(yǎng)殖過(guò)程中,為預(yù)防和治療雞類(lèi)疾病,提高其生產(chǎn)性能,喹諾酮類(lèi)藥物和磺胺類(lèi)藥物因具有廣譜的抗菌特性,被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床[2]。但是,不合理使用甚至亂用和濫用藥物,極易在雞肉中出現(xiàn)藥物殘留,對(duì)人體產(chǎn)生潛在危害[3]。目前,有關(guān)這兩類(lèi)藥物殘留的檢測(cè)多采用酶聯(lián)免疫法[4-6]、液相色譜法[7-10]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[11,12]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-16]等。液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法以其高靈敏度和準(zhǔn)確度被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物源性食品的藥物殘留檢測(cè)中,但動(dòng)物源性食品基質(zhì)復(fù)雜,蛋白和脂肪含量高,喹諾酮類(lèi)[7-9]和磺胺類(lèi)[12,17]藥物多采用分別測(cè)定的殘留檢測(cè)方法。由于這兩類(lèi)藥物在獸醫(yī)臨床中廣泛應(yīng)用,建立同時(shí)測(cè)定這兩類(lèi)藥物的殘留檢測(cè)方法具有非常重要的理論意義和實(shí)際需求。本試驗(yàn)在前期建立的高效液相色譜-熒光法測(cè)定磺胺類(lèi)藥物[17]的基礎(chǔ)上,創(chuàng)新性地建立了超高效液相色譜-熒光法同時(shí)測(cè)定雞肉中14種喹諾酮和16種磺胺類(lèi)藥物殘留的方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 氟羅沙星、諾氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、奧比沙星、加替沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸、氟甲喹、萘啶酸、磺胺二甲異嘧啶、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺甲噻二唑、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺曲沙唑、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺氯吡嗪、磺胺苯酰、磺胺苯、磺胺溴二甲嘧啶(純度>97%),Dr. Ehrenstorfer GmbH公司;熒光胺(純度99%),Sigma公司;乙腈(色譜純),默克公司;甲酸(色譜純),上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,PBS)鹽包,北京索萊寶科技有限公司;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 主要儀器 1290-Ⅱ超高效液相色譜儀,安捷倫科技有限公司;5804R高速冷凍離心機(jī),Eppendorf公司;MilliQ超純水儀,Millipore公司;N-EVAP 112氮吹儀,Organomation公司;Oasis HLB 3CC固相萃取柱,沃特世科技(上海)有限公司。

1.3 溶液配制 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:分別稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品適量,用甲醇溶解并定容,配制成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-20 ℃條件下保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液:分別量取30種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量,用甲醇配制成1 000 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,于-20 ℃條件下保存。

提取溶液(0.01 mol/L PBS溶液,pH=7.4):取2 L/袋的PBS鹽包,用水溶解并定容至2 L。

衍生溶液(0.01 mol/L PBS溶液,pH=3.0):將0.01 mol/L PBS溶液,用0.1 mol/L磷酸調(diào)pH至3.0。

衍生試劑(1.0 mg/mL熒光胺乙腈溶液):精確稱(chēng)取熒光胺10 mg,用乙腈溶解并定容至10 mL。

甲醇水溶液(20∶80,V/V):準(zhǔn)確量取20 mL甲醇和80 mL水,混勻,備用。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱:Waters UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);柱溫:30 ℃;流速:0.3 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL;檢測(cè)波長(zhǎng):0～16 min,激發(fā)波長(zhǎng)280 nm,發(fā)射波長(zhǎng)450 nm;16～23 min,激發(fā)波長(zhǎng)320 nm,發(fā)射波長(zhǎng)360 nm;23～48 min,激發(fā)波長(zhǎng)405 nm,發(fā)射波長(zhǎng)495 nm。流動(dòng)相:A為0.1%甲酸水溶液,B為乙腈。

1.4.2 樣品前處理 取均質(zhì)好的肉糜狀雞肉樣品(2.00±0.01)g,于50 mL具塞離心管中,加入提取溶液8 mL,多管渦旋儀混合渦旋5 min,8 000 r/min離心5 min,移取上清液至另一離心管中;將殘?jiān)貜?fù)提取1次,合并上清液,混勻;取混合好的上清液4 mL,加入經(jīng)3 mL甲醇、3 mL水活化的HLB固相萃取柱,分別用3 mL水和3 mL甲醇水溶液淋洗,真空抽干后,用3 mL甲醇洗脫,45 ℃水浴氮?dú)獯蹈?備用。

1.4.3 衍生化反應(yīng) 將1.4.2處理的樣品加入衍生溶液940 μL,渦旋溶解后,再加入衍生試劑60 μL,混勻,4 ℃避光反應(yīng)1 h,過(guò)0.22 μm濾膜,供超高效液相色譜儀測(cè)定。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制 準(zhǔn)確移取適量標(biāo)準(zhǔn)工作液,按照1.4.3進(jìn)行衍生化反應(yīng),配制成0.1、0.25、0.5、1、5、10、20、40、100、200和400 ng/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,以各藥物的峰面積為縱坐標(biāo),各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.4.5 檢出限和定量限 在雞肉組織中添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液,經(jīng)提取、凈化和衍生后測(cè)定,以10倍信噪比(S/N)時(shí)的添加濃度確定為建立方法的定量限(Limit of quantification,LOQ),3倍信噪比(S/N)時(shí)的添加濃度確定為建立方法的檢出限(Limit of detection,LOD)。

1.4.6 準(zhǔn)確度和精密度 對(duì)雞肉樣品分別在定量限、2倍定量限和10倍定量限進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)濃度做3個(gè)批次,每個(gè)批次做6個(gè)平行試驗(yàn),獲得平均回收率、批間和批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative standard deviation,RSD),考察建立方法的準(zhǔn)確度和精密度。

1.4.7 實(shí)際樣品的檢測(cè) 分別使用標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20759—2006[18]和本試驗(yàn)建立的方法對(duì)來(lái)自青島市某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)抽取的30份雞肉樣品進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制 本試驗(yàn)采用外標(biāo)定量法,按照1.4.4中標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行線(xiàn)性回歸。如表1所示,30種藥物在0.1～400 ng/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.999。

2.2 檢出限和定量限 14種喹諾酮類(lèi)藥物和16種磺胺類(lèi)藥物在雞肉中的殘留定量限為0.5～10.0 μg/kg,檢出限為0.2～3.5 μg/kg,具體試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 準(zhǔn)確度和精密度 建立方法的平均回收率、批內(nèi)和批間RSD如表2所示,30種藥物的平均回收率為62.2%～109.0%,批內(nèi)RSD均小于17.7%,批間RSD均小于16.2%,滿(mǎn)足國(guó)際上對(duì)獸藥殘留的檢測(cè)需求。

表2 雞肉中14種喹諾酮和16種磺胺類(lèi)藥物平均回收率、批內(nèi)和批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.4 實(shí)際樣品的檢測(cè) 檢測(cè)結(jié)果顯示,有1份樣品檢出磺胺二甲基嘧啶殘留,2種方法測(cè)定的樣品中磺胺二甲嘧啶的殘留量分別為16.8 μg/kg和16.2 μg/kg,二者結(jié)果無(wú)明顯差異,表明本試驗(yàn)建立的方法準(zhǔn)確、可靠,可用于基層一線(xiàn)實(shí)際樣品的檢測(cè)。

3 討論

3.1 有機(jī)溶劑用量的確定 通過(guò)比較20、40、60、100和200 μL不同體積的有機(jī)溶劑對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的色譜峰型的影響,結(jié)果如圖1所示,有機(jī)溶劑體積≤60 μL時(shí),喹諾酮類(lèi)藥物表現(xiàn)出良好的熒光響應(yīng)強(qiáng)度。隨著有機(jī)溶劑體積的增大,喹諾酮類(lèi)藥物峰形變鈍,基線(xiàn)嚴(yán)重漂移,藥物之間不能完全分離,但不同的有機(jī)試劑用量對(duì)磺胺-熒光胺衍生物的熒光響應(yīng)強(qiáng)度無(wú)明顯影響。因此,本試驗(yàn)選取了60 μL熒光胺乙腈溶液作為最佳有機(jī)溶劑用量。

圖1 有機(jī)溶劑體積對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物熒光強(qiáng)度的影響

3.2 衍生試劑濃度的影響 熒光胺乙腈溶液的濃度對(duì)磺胺-熒光胺衍生物的熒光響應(yīng)強(qiáng)度有較為明顯的影響,如圖2所示,隨著熒光胺乙腈溶液濃度的升高,衍生化產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),當(dāng)熒光胺乙腈濃度達(dá)到1.00 mg/mL時(shí),磺胺-熒光胺衍生物的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大并趨于穩(wěn)定。因此,本試驗(yàn)選取1.00 mg/mL熒光胺乙腈溶液作為最佳衍生試劑濃度。

圖2 熒光胺濃度對(duì)磺胺衍生物熒光強(qiáng)度的影響

3.3 熒光胺衍生化穩(wěn)定性測(cè)定 磺胺-熒光胺衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性較差,室溫下放置熒光響應(yīng)強(qiáng)度逐漸衰弱,對(duì)準(zhǔn)確定量造成影響。本試驗(yàn)比較了4 ℃和室溫條件下進(jìn)行衍生反應(yīng)和保存對(duì)熒光響應(yīng)強(qiáng)度的影響,其中,室溫條件下衍生產(chǎn)物熒光響應(yīng)強(qiáng)度在20 min達(dá)到峰值,隨后開(kāi)始下降;而4 ℃條件下,衍生產(chǎn)物熒光響應(yīng)強(qiáng)度在1 h左右到達(dá)峰值,且在18 h內(nèi)較為穩(wěn)定,未出現(xiàn)明顯衰減情況。因此,本試驗(yàn)將樣品衍生反應(yīng)和保存溫度調(diào)節(jié)至4 ℃,可實(shí)現(xiàn)批量樣品的自動(dòng)分析工作,大大提高了分析效率。

3.4 色譜條件的優(yōu)化 為了更好地對(duì)30種目標(biāo)化合物進(jìn)行定量和定性分析,本試驗(yàn)采用0.1%甲酸水溶液控制流動(dòng)相pH,優(yōu)化梯度洗脫條件,使30種待測(cè)藥物得到較好的色譜峰型和分離效果,空白雞肉樣品中添加30種藥物的色譜分離圖如圖3所示。

圖3 空白雞肉樣品添加30種藥物色譜圖

3.5 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化 雞肉組織中的蛋白質(zhì)含量高,通過(guò)樣品凈化,降低雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的干擾至關(guān)重要。文獻(xiàn)報(bào)道中采用的提取液包括有機(jī)溶劑(如乙腈、乙酸乙酯)[19,20]、酸化有機(jī)溶劑(如酸性乙腈)[21,22]和緩沖溶液(如磷酸鹽溶液)[23]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,乙腈、乙酸乙酯和酸化乙腈提取的共存物較多,雜質(zhì)干擾明顯,極性低的藥物色譜峰變寬,基線(xiàn)嚴(yán)重漂移,影響定量;且有機(jī)溶劑會(huì)導(dǎo)致雞肉組織蛋白質(zhì)迅速變性,需要均質(zhì)操作,否則容易結(jié)塊,影響提取,諾氟沙星和環(huán)丙沙星等藥物的提取回收率低于50%;選用PBS作為提取溶液,固相萃取柱凈化,雜質(zhì)干擾程度降低,可明顯改善色譜峰型,30種藥物的回收率在62.2%～109.0%范圍內(nèi)。

本試驗(yàn)首次建立了利用熒光檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定雞肉中14種喹諾酮類(lèi)和16種磺胺類(lèi)藥物殘留的超高效液相色譜方法,操作簡(jiǎn)單,重現(xiàn)性好,準(zhǔn)確性高,方法的定量限為0.5～10.0 μg/kg,可滿(mǎn)足我國(guó)以及歐盟等國(guó)家的日常監(jiān)測(cè)的要求,適用于雞肉中喹諾酮類(lèi)和磺胺類(lèi)藥物殘留的高通量篩查工作。該方法極大地提高了工作效率,降低了分析成本,可為基層一線(xiàn)的實(shí)際檢測(cè)提供可靠的技術(shù)支持。