陳 宇, 焦 典, 趙文博, 張 程, 姚 紅

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院, 河南 鄭州 450046)

彎曲菌屬中的空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌是食源性人獸共患病原菌,可以通過食物鏈傳播給人類,導(dǎo)致人類的消化道疾病(如腹瀉)甚至神經(jīng)性疾病(如格林-巴利綜合征)[1]?？股卦卺t(yī)學(xué)臨床和獸醫(yī)臨床的廣泛應(yīng)用導(dǎo)致了耐藥彎曲菌的出現(xiàn)和傳播,耐藥彎曲菌一旦沿食物鏈傳播給人類,將會(huì)嚴(yán)重限制臨床治療用藥選擇,給公共衛(wèi)生安全帶來巨大挑戰(zhàn)。

通過結(jié)構(gòu)修飾的氟苯尼考在安全性和有效性方面顯著優(yōu)于氯霉素和甲砜霉素,于20世紀(jì)90年代被投入市場(chǎng)使用[2]。該藥主要用于治療牛、豬、禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖中的細(xì)菌性疾病,是治療動(dòng)物性疾病最常用的抗生素之一。但隨著氟苯尼考在獸醫(yī)臨床中的大量使用,對(duì)氟苯尼考耐藥的彎曲菌日益增多[3]。目前,細(xì)菌對(duì)氟苯尼考的耐藥機(jī)制主要分為以下三類:(1)外排蛋白導(dǎo)致的主動(dòng)外排,主要由fexA、fexB、floR和optrA基因介導(dǎo)[4-6];(2)RNA甲基轉(zhuǎn)移酶的修飾,主要由cfr基因介導(dǎo)[7];(3)核糖體保護(hù),主要由poxtA基因介導(dǎo)[8]。自上述氟苯尼考耐藥基因在革蘭陽性菌中被發(fā)現(xiàn)以來,主要在革蘭陽性菌(葡萄球菌和腸球菌等)中被報(bào)道。然而,近年來,在彎曲菌中也報(bào)道了fexA、optrA和cfr(C)基因的存在[9-11]。

外排蛋白編碼基因fexA于2004年在1株緩慢葡萄球菌的質(zhì)粒pSCFS2中被發(fā)現(xiàn),該基因編碼475個(gè)氨基酸,包含14個(gè)跨膜區(qū)[4]。fexA基因編碼外排蛋白,屬E-4族成員,與其他氯霉素類藥物外排基因同源性較低。此外,在fexA基因上游存在類似衰減子的結(jié)構(gòu),可對(duì)fexA基因的誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)?；蚬δ苎芯孔C實(shí),fexA基因可介導(dǎo)氯霉素和氟苯尼考耐藥[4]。對(duì)fexA基因環(huán)境研究發(fā)現(xiàn),該基因定位于質(zhì)粒的新型轉(zhuǎn)座子Tn558中,易通過轉(zhuǎn)座子和質(zhì)粒在不同種屬細(xì)菌中進(jìn)行傳播[12]。近年來,fexA基因在彎曲菌中也被相繼報(bào)道[9,13]。研究發(fā)現(xiàn),fexA基因位于彎曲菌染色體,與四環(huán)素類耐藥基因tet(L)等形成耐藥基因島,插入至彎曲菌保守基因moeA2與cj1528之間[9]。

本課題組前期發(fā)現(xiàn)了1株攜帶fexA基因的豬源結(jié)腸彎曲菌,本試驗(yàn)將針對(duì)該基因介導(dǎo)氟苯尼考耐藥表型的功能以及遺傳環(huán)境進(jìn)行確證和分析,闡明fexA基因在彎曲菌中作用和遺傳特征,以期為合理用藥和氟苯尼考耐藥性防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 MH瓊脂(Mueller hinton agar,MHA)培養(yǎng)基,購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;SOC肉湯(SOC broth)培養(yǎng)基,購(gòu)自青島捷世康生物科技有限公司;無菌脫纖維羊血,購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限公司;PremixExTaq(Loading dye mix),購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;NEBuilder?HiFi DNA Assembly Master Mix,購(gòu)自美國(guó)NEB公司;大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α和pUC-19載體,均購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因有限公司;Wizard Genomic DNA Purification Kit,購(gòu)自美國(guó)Promega公司;QIAGEN Plasmid Midi Kit,購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司。

1.2 主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱,日本三洋公司產(chǎn)品;PCR儀和電泳成套設(shè)備,美國(guó) BIO-Rad公司產(chǎn)品;超凈工作臺(tái),蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品;單道移液槍,德國(guó) Eppendorf公司產(chǎn)品;電轉(zhuǎn)化儀,美國(guó)BTX公司產(chǎn)品。

1.3 菌株 結(jié)腸彎曲菌C19來源于養(yǎng)殖場(chǎng)生豬;空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)ATCC 33560和空腸彎曲菌NCTC 11168均為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 藥物敏感性試驗(yàn)和氟苯尼考耐藥基因檢測(cè) 根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI) 推薦的瓊脂稀釋法測(cè)定彎曲菌對(duì)氟苯尼考的敏感性。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株為ATCC 33560,結(jié)果判定依據(jù)參照CLSI判定標(biāo)準(zhǔn)(https://www.clsi.org/standards/products/microbiology/companion/using-m100/)。根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]中引物(Primer-L,5′-CCATTCCGACACCAACCT-3′;Primer-R,5′-CCATTCCGACACCAACCT-3′)和擴(kuò)增條件,通過PCR方法對(duì)fexA基因進(jìn)行檢測(cè)。此外,參照參考文獻(xiàn)[9]對(duì)氟苯尼考耐藥基因fexB、floR、optrA、cfr(C)和poxtA進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.2fexA單基因克隆構(gòu)建 為了確證C19 對(duì)氟苯尼考的高水平耐藥表型是由fexA基因介導(dǎo),通過構(gòu)建cj0299-fexA-erm(B)-panB片段對(duì)fexA基因介導(dǎo)的氟苯尼考耐藥功能進(jìn)行驗(yàn)證,通過自然轉(zhuǎn)化方法將該片段導(dǎo)入至受體菌株NCTC 11168,測(cè)定最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)。具體試驗(yàn)方法:將cj0299、fexA、erm(B)和panB基因序列添加至軟件NEBuilder中,設(shè)計(jì)引物P1～P8,引物序列見表1。分別用P1、P2擴(kuò)增cj0299基因;P3、P4擴(kuò)增erm(B) 基因;P5、P6擴(kuò)增fexA基因;P7、P8擴(kuò)增panB基因。PCR 反應(yīng)體系(50 μL):PremixExTaq25 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 21 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性30 s,退火溫度分別為55 ℃(cj0029)、56 ℃[erm(B)]、55 ℃(fexA)和57 ℃(panB),退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃后延伸10 min。將PCR產(chǎn)物用NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix進(jìn)行連接,然后與pUC-19載體相連,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α,具體步驟參照說明書。以連接產(chǎn)物為供體,NCTC 11168為受體進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化,用濃度為4 μg/mL的紅霉素篩選轉(zhuǎn)化子,隨后用fexA基因檢測(cè)引物(引物序列見1.4.1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增以對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行確證。對(duì)確證的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn),測(cè)定氟苯尼考對(duì)轉(zhuǎn)化子和受體菌株的MIC值。

表1 用于構(gòu)建fexA單基因克隆的PCR擴(kuò)增引物

表2 氟苯尼考對(duì)菌株的MIC值

1.4.3 全基因組測(cè)序和攜帶fexA基因環(huán)境分析 為分析fexA基因的遺傳環(huán)境,對(duì)菌株C19進(jìn)行全基因組測(cè)序和分析。運(yùn)用細(xì)菌基因組提取試劑盒Wizard Genomic DNA Purification Kit提取攜帶fexA基因菌株的全基因組,之后將提取的基因組送至上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行全基因組測(cè)序分析(Illumina HiSeq 2500 platform)。運(yùn)用BioNumerics v. 8.0(Applied Maths)對(duì)測(cè)序獲得的基因組進(jìn)行組裝,通過RAST(https://rast.nmpdr.org/rast.cgi)對(duì)開放閱讀框(Open reading frame,ORF)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析,用Artmis軟件對(duì)fexA基因遺傳環(huán)境圖譜進(jìn)行分析和繪制,運(yùn)用BRIG軟件進(jìn)行質(zhì)粒比對(duì)分析。

1.4.4 電轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 按照QIAGEN Plasmid Midi Kit說明書操作提取質(zhì)粒。將含有fexA基因的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至空腸彎曲菌NCTC 11168中。具體方法:將1 μg質(zhì)粒DNA置于透析膜上30 min,然后添加至解凍的感受態(tài)細(xì)胞,混合均勻;將混合物加入電轉(zhuǎn)杯,在200 Ω、25 μFd和1.8 kV條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)化;添加SOC肉湯300 μL,將菌液轉(zhuǎn)移至EP管,42 ℃微需氧條件培養(yǎng)1 h;將菌液涂布于含有8 μg/mL氟苯尼考的MH瓊脂平板,42 ℃微需氧條件培養(yǎng)48 h,篩選電轉(zhuǎn)子。

1.4.5 反向PCR 對(duì)環(huán)狀中間體進(jìn)行檢測(cè)和驗(yàn)證,用參考文獻(xiàn)[9]中報(bào)道的引物進(jìn)行反向PCR(primer-L,5′-CCATTCCGACACCAACCT-3′;primer-R,5′-CCATTCCGACACCAACCT-3′)。PCR反應(yīng)體系(50 μL):PremixExTaq25 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 21 μL,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃后延伸10 min。

2 結(jié)果

2.1 藥物敏感性試驗(yàn)和氟苯尼考耐藥基因檢測(cè) 在對(duì)彎曲菌(主要為空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌)耐藥監(jiān)測(cè)過程中發(fā)現(xiàn)1株豬源結(jié)腸彎曲菌(命名為C19)對(duì)氟苯尼考呈現(xiàn)較高水平耐藥表型(MIC=64 μg/mL)。運(yùn)用PCR方法對(duì)C19耐藥基因進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,該菌株含有外排泵編碼基因fexA,而其他氟苯尼考耐藥基因,如fexB、floR、optrA、cfr(C)和poxtA在該菌株中未檢出。因此,推測(cè)菌株C19對(duì)氟苯尼考的高水平耐藥表型由fexA基因介導(dǎo)。

2.2fexA單基因克隆構(gòu)建 構(gòu)建的cj0299-fexA-erm(B)-panB片段含有NCTC 11168菌株保守基因panB和cj0299的同源序列,通過同源重組,fexA-erm(B)成功整合至panB和cj0299基因之間,得到轉(zhuǎn)化子11168-fexA。運(yùn)用瓊脂稀釋法測(cè)定氟苯尼考對(duì)C19、NCTC 11168、11168-fexA和ATCC 33560菌株的MIC,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)化子11168-fexA對(duì)氟苯尼考呈現(xiàn)高水平耐藥表型,MIC值為32 μg/mL,比受體菌株NCTC 11168對(duì)氟苯尼考的MIC值提高了32倍。結(jié)果證實(shí),fexA基因可介導(dǎo)彎曲菌對(duì)氟苯尼考的高水平耐藥。

2.3 全基因組測(cè)序和fexA基因環(huán)境分析 基因注釋分析結(jié)果顯示,fexA基因位于1個(gè)長(zhǎng)度為13 793 bp的質(zhì)粒上,將其命名為pC19-fexA,該質(zhì)粒包含13個(gè)ORF,其中有7個(gè)假蛋白(Hypothesis protein,hp),不包含編碼接合轉(zhuǎn)移功能蛋白的相關(guān)基因。fexA上游為hp,下游是整合酶編碼基因(圖1)。值得注意的是,質(zhì)粒pC19-fexA有2個(gè)與其復(fù)制相關(guān)的rep基因(圖1),而進(jìn)一步分析表明,質(zhì)粒復(fù)制子未有具體分型。

圖1 攜帶fexA質(zhì)粒pC19-fexA圖譜和開放閱讀框標(biāo)注

將質(zhì)粒pC19-fexA序列進(jìn)行基因組比對(duì)分析,結(jié)果顯示,質(zhì)粒pC19-fexA與數(shù)據(jù)庫中質(zhì)粒序列相比同源性介于96.15%～99.72%,而覆蓋度最高僅為74%。將質(zhì)粒pC19-fexA與數(shù)據(jù)庫中質(zhì)粒進(jìn)行比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)與該質(zhì)粒同源性最高(98.85%)且覆蓋度最高(74%)的質(zhì)粒是來源于羅氏檸檬乳桿菌的質(zhì)粒pAN417B(CP054659),值得注意的是,pAN417B也攜帶fexA基因(圖2)。此外,質(zhì)粒pC19-fexA與其他質(zhì)粒相比,雖然同源性較高(>99.00%),但是覆蓋度均較低,如序列號(hào)為CP065854和CP030091的質(zhì)粒(圖2)。

圖2 pC19-fexA與數(shù)據(jù)庫參考質(zhì)?；蚪M比對(duì)

2.4 電轉(zhuǎn)化試驗(yàn)和反向PCR 為檢測(cè)質(zhì)粒pC19-fexA是否能夠發(fā)生轉(zhuǎn)移,進(jìn)行了電轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。盡管多次嘗試,但并未獲得相應(yīng)電轉(zhuǎn)子,表明攜帶fexA基因的質(zhì)粒pC19-fexA不能通過電轉(zhuǎn)化發(fā)生水平傳播。通過反向PCR檢測(cè)是否能夠形成包含fexA基因的環(huán)狀中間體,結(jié)果顯示,未得到相應(yīng)的擴(kuò)增片段。此外,本試驗(yàn)未能獲得相應(yīng)的接合轉(zhuǎn)移子,與該質(zhì)粒不包含接合轉(zhuǎn)移蛋白編碼基因的基因型一致。

綜上所述,本試驗(yàn)結(jié)果表明,pC19-fexA質(zhì)粒攜帶可介導(dǎo)氟苯尼考高水平耐藥的fexA基因;fexA和hp基因和整合酶編碼基因相鄰,不能形成環(huán)狀中間體;pC19-fexA質(zhì)粒與其他質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不同,且該質(zhì)粒不能通過電轉(zhuǎn)化和接合轉(zhuǎn)移發(fā)生水平傳播。

3 討論

外排泵編碼基因fexA可介導(dǎo)葡萄球菌對(duì)酰胺醇類藥物的高水平耐藥[4]。本試驗(yàn)構(gòu)建fexA單基因克隆,通過自然轉(zhuǎn)化成功獲得了含有fexA基因的背景清晰的工程菌株轉(zhuǎn)化子11168-fexA,證實(shí)了該基因在彎曲菌種屬中介導(dǎo)氟苯尼考耐藥的功能。相較于以原代菌全基因組為供體基因組進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化的方法,單基因克隆更能明確地說明fexA基因介導(dǎo)氟苯尼考耐藥的功能。此外,本試驗(yàn)以大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因erm(B)作為篩選標(biāo)記,防止其他酰胺醇類突變影響fexA基因功能的確證。因此,該基因功能確證方法易操作、結(jié)果可靠,可廣泛應(yīng)用于其他基因的功能研究。

彎曲菌易吸收和整合外源基因至自身基因組,極大程度上豐富了彎曲菌基因組的多樣性。近年來,越來越多最初發(fā)現(xiàn)并流行于革蘭陽性菌中的耐藥基因在彎曲菌中被發(fā)現(xiàn)并報(bào)道,如大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因erm(B)[14]、酰胺醇類耐藥基因optrA[10]、cfr(C)[11]和fexA[9],以及四環(huán)素類耐藥基因tet(L)[15]。上述耐藥基因整合至彎曲菌染色體基因組,可與其他耐藥基因形成多重耐藥基因島,通過同源重組在彎曲菌中發(fā)生水平傳播[15,16]。自fexA基因被發(fā)現(xiàn)以來,其在革蘭陽性菌中被報(bào)道較多,如葡萄球菌和腸球菌[12,17]。而近年來,fexA基因在彎曲菌中被發(fā)現(xiàn)并報(bào)道[9]?；蛐蛄蟹治鲲@示,fexA基因多位于彎曲菌染色體上的多重耐藥基因島,僅有1株彎曲菌中fexA基因位于質(zhì)粒,該質(zhì)粒pCJFEX為48 003 bp,編碼58個(gè)ORF[18]。而本試驗(yàn)結(jié)果顯示,fexA基因位于1個(gè)長(zhǎng)度約為13 kb的具有新型結(jié)構(gòu)的小質(zhì)粒,與先前報(bào)道的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不同。實(shí)驗(yàn)室條件下,該質(zhì)粒雖然不能發(fā)生水平傳播,但是作為fexA基因載體的作用卻不容忽視。質(zhì)粒pC19-fexA中包含的大部分ORF經(jīng)比對(duì)注釋后均為假蛋白編碼基因hp,但是這些假蛋白在該質(zhì)粒的生存、穩(wěn)定性或者適應(yīng)性中是否發(fā)揮作用,需要進(jìn)一步進(jìn)行功能研究。

已報(bào)道的fexA基因環(huán)境并不完全一致,但fexA基因周圍均存在插入序列。有研究表明,fexA基因位于結(jié)腸彎曲菌染色體,上下游被同向的IS1216E包圍(SAMN11316573)[9]。另有研究發(fā)現(xiàn),位于質(zhì)粒pCJFEX的fexA基因被插入序列IS1216包圍(CP048762),位于染色體的fexA基因環(huán)境與質(zhì)粒pCJFEX上的類似,均為可移動(dòng)遺傳元件[18]。fexA基因周圍的IS1216在整合攜帶fexA基因的片段中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),fexA基因位于1個(gè)長(zhǎng)度為13 793 bp的質(zhì)粒pC19-fexA上,fexA上游為hp,下游為整合酶編碼基因,與之前報(bào)道的fexA基因環(huán)境不同。雖然反向PCR、電轉(zhuǎn)化和接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)均證實(shí)fexA基因不能發(fā)生傳播,但本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的fexA基因新型攜帶載體說明fexA基因環(huán)境多樣。

本試驗(yàn)針對(duì)fexA基因陽性菌株進(jìn)行研究,確證了fexA基因在彎曲菌中介導(dǎo)氟苯尼考耐藥的功能?；谌蚪M測(cè)序數(shù)據(jù)分析了fexA基因的新型遺傳環(huán)境,揭示了fexA基因載體的新形式,為控制fexA基因在彎曲菌中的傳播提供理論依據(jù)。