董 媛, 李汶柯, 孟桂先, 劉 磊, 尹茉莉, 王會巖

(1. 吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院, 吉林 吉林 132013 ; 2. 吉林醫(yī)藥學(xué)院抗體工程科技協(xié)同創(chuàng)新中心, 吉林 吉林 132013)

牛妊娠相關(guān)糖蛋白(Bovine pregnancy-associated glycoprotein,boPAGs)屬于天冬氨酸蛋白酶家族[1],該家族目前共發(fā)現(xiàn)了22個(gè)成員,在進(jìn)化過程中,boPAG1、boPAG3和boPAG4等大多數(shù)boPAGs因催化中心的堿基突變,失去了蛋白水解酶活性,被歸為“現(xiàn)代組”,在滋養(yǎng)層細(xì)胞亞群(也叫雙核細(xì)胞)中表達(dá);而boPAG2、boPAG8和boPAG10等少數(shù)boPAGs仍保留蛋白水解酶活性,在整個(gè)滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞中產(chǎn)生,被歸為“古代組”[2]。不同boPAGs表達(dá)的時(shí)間和位置差異較大,主要存在于妊娠后母牛的胎盤中,如boPAG2和boPAG8在妊娠后25 d表達(dá),而boPAG1、boPAG6和boPAG7在妊娠45 d后才表達(dá)[3]。因此,boPAGs成為了牛妊娠診斷的特異性抗原,與傳統(tǒng)的觸診法相比,準(zhǔn)確度更高,更適合早期妊娠診斷。目前,對于boPAGs的功能還沒有確切的結(jié)論,它們被認(rèn)為在受精卵著床、胎盤形成過程中的妊娠維持中發(fā)揮了重要的作用[4],也有推測它們具有免疫調(diào)節(jié)活性和催乳活性[5]。只有很少的文獻(xiàn)報(bào)道了boPAGs和孕促性腺激素受體存在相互作用,具有促黃體和抗黃體溶解的作用[6]。盡管對boPAGs的功能有著不同的研究和推斷,但boPAGs真正的功能和用于妊娠早期診斷的具體家族成員,目前尚不清楚。在妊娠早期,boPAGs血清濃度受到產(chǎn)奶量、基因型等多種因素的影響,半衰期短,濃度低,難于純化,天然的boPAGs制備成本較高。為了深入研究boPAGs功能和特性,首先要獲得boPAGs,因此重組表達(dá)等技術(shù)成為主要手段。目前,關(guān)于牛妊娠相關(guān)糖蛋白18 (Bovine pregnancy-associated glycoprotein 18,boPAG18)的表達(dá)和蛋白制備鮮有報(bào)道,本試驗(yàn)選取boPAG18作為研究對象,通過優(yōu)化密碼子,構(gòu)建pET30a-boPAG18原核表達(dá)載體,優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件,純化重組boPAG18,并分析其生物信息學(xué)特征,本試驗(yàn)為深入研究boPAG18的結(jié)構(gòu)和功能提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和載體 pET30a載體和感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3),均購自湖南科愛醫(yī)療器械有限公司。

1.2 主要試劑 質(zhì)粒小提試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒和Marker,均購自北京冬璞泰和科技有限責(zé)任公司;酶、抗生素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)和包涵體裂解緩沖液等,均購自上海翌圣生物科技股份有限公司;His-Tag抗體(HRP標(biāo)記),購自艾比瑪特醫(yī)藥科技(上海)有限公司。

1.3 主要儀器 9700型PCR擴(kuò)增儀(美國AB公司),TL-ST250型超聲細(xì)胞破碎儀(江蘇天翔儀器有限公司),KTA Prime Plus型KTA 蛋白純化儀(美國GE公司)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1boPAG18基因密碼子優(yōu)化 采用密碼子優(yōu)化軟件 MaxCodonTMOptimization Program (V13)對boPAG18基因序列(NM_176626)進(jìn)行優(yōu)化,選取全基因合成boPAG18(堿基位置16～381),以NdeI和Hind Ⅲ為限制性酶切位點(diǎn),純化標(biāo)簽采用組氨酸標(biāo)簽。

1.4.2 pET30a-boPAG18質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定 常規(guī)PCR法擴(kuò)增boPAG18基因,引物對:5′-GGAATTCCATATGACCACCATATCGTCA-3′,5′-GGGAAGCTTGCTCATGGCTTTGG-3′,隨后通過常規(guī)雙酶切、T4 DNA連接酶連接到表達(dá)載體pET30a中,連接產(chǎn)物42 ℃熱擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)30 min,均勻涂布于LB固體平板(50 μg/mL Kan+),37 ℃倒置培養(yǎng)。采用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒,取1 μg重組質(zhì)粒,內(nèi)切酶各0.5 μL,10×酶切緩沖液1 μL,ddH2O補(bǔ)足10 μL,37 ℃孵育1 h,1%瓊脂糖凝膠電泳分析[7]。

1.4.3 boPAG18誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化和純化 采用單因素法優(yōu)化了裝液量、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間對蛋白質(zhì)表達(dá)量的影響,每次只設(shè)1個(gè)變量,以未誘導(dǎo)的菌液為對照,聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate poly acrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)測定目的蛋白質(zhì)的表達(dá)量。以最優(yōu)條件誘導(dǎo)表達(dá)重組質(zhì)粒,12 000 r/min 離心 5 min,沉淀用磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline,PBS)重懸,SDS-PAGE分別測定上清、沉淀中蛋白質(zhì)表達(dá),分析蛋白質(zhì)可溶性。包涵體采用包涵體裂解緩沖液溶解,同時(shí)平衡Ni-IDA柱,最后采用含100 mmol/L和500 mmol/L咪唑的平衡緩沖液洗脫boPAG18,SDS-PAGE 和Western blot鑒定純化蛋白,Western blot一抗采用His-Tag抗體孵育,二抗采用HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體孵育,3,3-二氨基苯聯(lián)胺(Diaminobenzidine,DAB)顯色。應(yīng)用BCA蛋白定量試劑盒測定純化后的蛋白質(zhì)濃度[8]。

1.4.4 結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測分析 如表1所示,通過多種在線工具預(yù)測boPAG18的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)等生物信息學(xué)特征。

表1 蛋白質(zhì)性質(zhì)預(yù)測在線工具

2 結(jié)果

2.1boPAG18基因密碼子優(yōu)化 GenBank數(shù)據(jù)庫中boPAG18基因序列(NM_176626)全長1 143 bp,編碼381個(gè)氨基酸,boPAG18(氨基酸序列16～381)密碼子優(yōu)化前、后的序列信息如表2所示,優(yōu)化前和優(yōu)化后2個(gè)基因的核苷酸同源性為76%,G+C含量由48.14%變?yōu)?0.77%。

表2 boPAG18基因優(yōu)化前后核苷酸序列對比

2.2 pET30a-boPAG18質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定 重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切法鑒定,結(jié)果如圖1所示,雙酶切后獲得2條線性片段,分別為boPAG18基因和線性載體片段,其中boPAG18基因片段大小與預(yù)期大小相符,且無非特異性條帶。

圖1 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

2.3 boPAG18誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化 當(dāng)OD600 nm值為0.6,裝液量為40 mL,IPTG終濃度為0.2 g/L,誘導(dǎo)時(shí)間為4 h,誘導(dǎo)溫度為37 ℃時(shí),蛋白質(zhì)表達(dá)量最佳。

2.4 boPAG18可溶性分析 全菌超聲裂解分析結(jié)果如圖2A所示,boPAG18在裂解后的沉淀中表達(dá)量高,上清中無表達(dá),所以boPAG18在包涵體中表達(dá)。

圖2 boPAG18的制備和鑒定

2.5 boPAG18純化和鑒定 包涵體裂解、純化后的boPAG18的SDS-PAGE結(jié)果如圖2B所示,500 mmol/L咪唑洗脫時(shí)boPAG18純度較高,boPAG18相對分子質(zhì)量約38 kDa。Gel-Pro Analyzer 軟件灰度分析結(jié)果顯示,該蛋白純度高達(dá)98%。Western blot結(jié)果如圖2C所示,純化后的boPAG18能夠與His-Tag抗體(HRP標(biāo)記)發(fā)生特異性結(jié)合。BCA蛋白濃度檢測結(jié)果顯示,boPAG18濃度為2.63 mg/mL。

2.6 結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測分析 經(jīng)生物信息學(xué)分析,boPAG18分子式為C1923H3007N519O541S17,分子質(zhì)量為42.6 ku,等電點(diǎn)為9.31,親水性平均值為-0.041,兩親性蛋白,不穩(wěn)定指數(shù)為42.41,在水中不穩(wěn)定;脂肪系數(shù)為88.43,有381個(gè)氨基酸,絲氨酸(Ser)含量最高(8.9%),色氨酸(Trp)含量最低(1.3%)(表3)。消光系數(shù)為47 370 mol-1·cm-1,半衰期為30 h。boPAG18 N端前15個(gè)氨基酸為信號肽(圖3A),無跨膜區(qū)域(圖3B)。boPAG18共有57個(gè)糖基化位點(diǎn),包括34個(gè)Ser糖基化位點(diǎn)和23個(gè)Thr糖基化位點(diǎn)(圖4A);68個(gè)磷酸化位點(diǎn),包括33個(gè)Ser磷酸化位點(diǎn)、22個(gè)Thr磷酸化位點(diǎn)和13個(gè)Tyr磷酸化位點(diǎn)(圖4B)。boPAG18共發(fā)現(xiàn)13段優(yōu)勢區(qū)段B抗原表位,其具體抗原表位序列如表4所示。

圖3 boPAG18的信號肽(A)和跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)(B)預(yù)測

圖4 boPAG18糖基化位點(diǎn)(A)和磷酸化位點(diǎn)(B)預(yù)測

表3 boPAG18的氨基酸組成

表4 boPAG18抗原表位預(yù)測

boPAG18的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖5A所示,分別由α-螺旋(19.42%)、β-轉(zhuǎn)角(5.77%)、無規(guī)則卷曲(44.88%)和延伸鏈(29.92%)組成。通過Phyre2在線工具預(yù)測boPAG18的三級結(jié)構(gòu),結(jié)果如圖5B所示。通過STRING在線軟件預(yù)測boPAG18的相互作用蛋白,結(jié)果如圖6和表5所示,與boPAG18相互作用的蛋白包括β淀粉樣前體樣蛋白2[Amyloid beta (A4) precursor-like protein 2,APLP2]、β淀粉樣蛋白(Amyloid-beta A4 protein,APP)、胎盤泌乳素相關(guān)蛋白1(Placental prolacin-related protein 1,PRP1)、抗菌肽-2(Cathelicidin-2,CATHL2)、防御素前體(Beta-defensin precursor,DEFB)、催乳素相關(guān)蛋白前體6(Prolactin-related protein vi precursor,PRP6)和防御素前體122(Beta-defensin 122 precursor,DEFB122)。BoPAG18含有能夠與β淀粉樣蛋白N末端肝素結(jié)合的結(jié)構(gòu)域、與淀粉樣蛋白前體結(jié)合的銅結(jié)合位點(diǎn),還與PRP1、CATHL2、DEFB和PRP6有相互作用,可能參與母體在妊娠期的泌乳、抗菌和神經(jīng)保護(hù)等調(diào)節(jié)功能。

圖5 boPAG18二級結(jié)構(gòu)(A)和三級結(jié)構(gòu)(B)預(yù)測

表5 boPAG18功能和結(jié)構(gòu)域預(yù)測

3 討論

為了獲得大量boPAG18,本試驗(yàn)選擇pET30a作為載體,其含有強(qiáng)啟動子,可高效表達(dá)外源蛋白[7],同時(shí)選擇大腸桿菌BL21(DE3)為宿主,因其具有周期短、成本低、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn),常用于外源蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)[8]。

優(yōu)化密碼子在重組蛋白技術(shù)的發(fā)展中可以有效提高宿主中外源基因的表達(dá)水平。劉長彬等優(yōu)化并高效表達(dá)了boPAG1[9]、boPAG9[10]和boPAG16[11]。盧春霞等基于密碼子優(yōu)化對boPAG9進(jìn)行了原核表達(dá)[12]。楊亞軍等首先優(yōu)化PAG密碼子,之后通過基因工程技術(shù)高效表達(dá)了boPAG2[13]、boPAG7和boPAG8蛋白[6]。本試驗(yàn)同樣優(yōu)化了boPAG18基因密碼子,克隆的boPAG18基因全長為1 143 bp,編碼381個(gè)氨基酸。

考慮到影響蛋白表達(dá)效率的因素有很多種,例如誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)劑濃度和溶氧等,且各因素之間相關(guān)性較大,所以需要優(yōu)化表達(dá)條件,才能夠從可控變量中篩選出最佳優(yōu)化方案。外源蛋白的最佳表達(dá)時(shí)間和溫度與大腸桿菌的最佳生長時(shí)間和溫度不一定相同,這些因素不僅影響菌體生長,也會影響外源蛋白的表達(dá)量[14,15]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間對蛋白表達(dá)影響最大,確定了boPAG18的最佳表達(dá)條件為OD600 nm值為0.6時(shí)加入終濃度為0.2 g/L的IPTG,37 ℃誘導(dǎo)4 h。因目的蛋白攜帶His標(biāo)簽,純化后boPAG18純度高達(dá)98%。

對于很多難于純化的蛋白質(zhì),無法獲得其精確的結(jié)構(gòu),所以生物信息學(xué)預(yù)測成為了預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的首選,且隨著生物信息學(xué)工具的升級,預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確率越來越高。楊亞軍等做了大量的基礎(chǔ)工作,已經(jīng)成功表達(dá)了boPAG2、boPAG7和boPAG8,預(yù)測了它們的功能,研究表明boPAG2可能參與了蛋白質(zhì)的消化和吸收[13],BoPAG7和boPAG8與催乳素相關(guān)蛋白有相互作用[6]。這與本試驗(yàn)中boPAG18預(yù)測的相互作用蛋白有很大的差異,說明boPAG2、boPAG7、boPAG8和boPAG18可能參與了母牛泌乳期的不同功能。也就解釋了為何不同的boPAGs在表達(dá)時(shí)間和空間上存在差異。此外,本試驗(yàn)生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示,boPAG18無跨膜結(jié)構(gòu),1～16位氨基酸為信號肽,屬于不穩(wěn)定、親水分泌型蛋白質(zhì),擁有較多的修飾位點(diǎn)和B細(xì)胞表位。這些特征與其他boPAGs情況非常相似。這些因素都會增加天然蛋白的純化難度。boPAG18含有與β淀粉樣蛋白N末端肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、淀粉樣蛋白前體的銅結(jié)合結(jié)構(gòu)域,還與PRP1、CATHL2、DEFB和PRP6有相互作用。PRP1和PRP6是生長激素/催乳素蛋白超家族成員,牛PRP1是滋養(yǎng)細(xì)胞分化的優(yōu)良標(biāo)志物,也是妊娠診斷的候選蛋白[16]。DEFB家族中,β-防御素對導(dǎo)致奶?；既榉垦椎闹虏【幸种乒π?同時(shí)牛CATHL2具有較強(qiáng)的陽離子抗菌效果。有研究表明,牛擁有迄今為止確定的最多樣化的防御素基因庫,其中4個(gè)基因簇包含至少57個(gè)基因,防御素具有顯著的免疫調(diào)節(jié)功能[17]。β淀粉樣蛋白的表達(dá)高低可以影響骨代謝的平衡,且β淀粉樣蛋白的表達(dá)異常和基因突變可以導(dǎo)致阿爾茨海默氏癥[18]。因此推測,boPAG18可能對母體在妊娠期的泌乳、抗菌和神經(jīng)保護(hù)起到調(diào)節(jié)作用,但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

綜上,本試驗(yàn)構(gòu)建了boPAG18重組表達(dá)載體,優(yōu)化了boPAG18重組載體的表達(dá)條件,制備了高純度boPAG18,并預(yù)測了其生物信息學(xué)特征和可能功能,可為后續(xù)boPAG18的診斷和功能研究等提供參考。