田梓翰, 吳 昊, 阮勝男, 任文慧, 吳昊蔚, 何啟蓋,3

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院, 湖北 武漢 430000 ; 2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心, 湖北 武漢 430000 ;3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用診斷制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北 武漢 430000)

副豬格拉瑟菌(Glaesserellaparasuis,G.parasuis)是一種革蘭陰性菌,屬巴氏桿菌科,是豬上呼吸道中的常在菌之一,在特定情況下可引起豬全身性疾病,主要表現(xiàn)為4～8周齡豬發(fā)生纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎,稱(chēng)為格拉瑟病(Gl?sser's disease)[1],是當(dāng)前危害養(yǎng)豬業(yè)的一種重要的細(xì)菌性疾病。豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),也稱(chēng)“藍(lán)耳病”,是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一種免疫抑制性和高度接觸性的傳染病。2006年以后出現(xiàn)的類(lèi)HP-PRRSV毒株和類(lèi)NADC-30毒株等表現(xiàn)出更強(qiáng)的致病力和傳播力,為防控該病帶來(lái)新的難題[2-4]。豬感染PRRSV可導(dǎo)致免疫細(xì)胞損傷,造成機(jī)體免疫系統(tǒng)障礙,使機(jī)體對(duì)其他病原更為易感[5]。臨床上常見(jiàn)PRRSV與致病菌混合感染情況,給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

本試驗(yàn)對(duì)某豬場(chǎng)育肥豬群多種病原混合感染的案例開(kāi)展綜合診斷,根據(jù)診斷結(jié)果提出用藥和防控等相關(guān)措施,并評(píng)價(jià)其防控效果,為廣大生豬養(yǎng)殖企業(yè)防控相關(guān)疫病提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(Tryptone soy agar,TSA)和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(Tryptone soy broth,TSB),均購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司;犢牛血清,購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司;氧化型輔酶Ⅰ(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD),購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒苗(R98株),購(gòu)自湖南中岸生物藥業(yè)有限公司;復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液,購(gòu)自成都中牧生物藥業(yè)有限公司;5%酒石酸泰萬(wàn)菌素預(yù)混劑,購(gòu)自濰坊華英生物科技有限公司;2×TaqMaster Mix,購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒,購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;Animal Detection U+ Probe qPCR Super PreMix、病毒DNA/RNA提取試劑盒和HiScript III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR,均購(gòu)自南京諾維贊生物科技股份有限公司。

1.2 主要儀器 生物安全柜,海爾生物醫(yī)療有限公司產(chǎn)品;核酸電泳儀,北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品;CFX Connect熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)和T100 PCR儀,均為美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.3 現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查 調(diào)查發(fā)病豬場(chǎng)背景信息,觀(guān)察發(fā)病豬臨床癥狀,剖檢8頭臨床癥狀明顯的發(fā)病豬,觀(guān)察并記錄其器官病理變化。采集肺臟、脾臟、腹股溝淋巴結(jié)和心包積液,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)室病原檢測(cè)。

1.4 實(shí)驗(yàn)室診斷

1.4.1 細(xì)菌分離鑒定 無(wú)菌采集剖檢病豬的肺臟和心包積液,接種到含NAD和5%犢牛血清的TSA培養(yǎng)基,置于CO2恒溫培養(yǎng)箱,37 ℃培養(yǎng)24～48 h后觀(guān)察結(jié)果,挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。挑取純化后的單菌落接種到含NAD和10%犢牛血清的TSB培養(yǎng)基,37 ℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)。吸取200 μL菌液,使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒按說(shuō)明書(shū)操作提取細(xì)菌DNA,并通過(guò)PCR方法檢測(cè)副豬格拉瑟菌(Glaesserellaparasuis,G.parasuis)、豬鏈球菌(Streptococcussuis,S.suis)、胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)和支氣管敗血波氏桿菌(Bordetellabronchiseptica,Bb)的DNA片段,PCR所用引物和序列見(jiàn)表1。所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4.2 病毒核酸檢測(cè) 分別采集發(fā)病豬的腹股溝淋巴結(jié)、脾臟和肺臟組織約1 g,于2 mL EP管中剪碎,加入1 mL Hank's平衡鹽溶液進(jìn)行勻漿處理。勻漿后于-80 ℃反復(fù)凍融3次,離心取組織上清液,同一頭豬的不同組織上清液合并為1份樣品,共得到8份樣品,使用病毒DNA/RNA提取試劑盒提取樣品DNA和RNA,并對(duì)提取的RNA樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄處理得到cDNA。對(duì)得到的DNA和cDNA進(jìn)行熒光定量PCR,檢測(cè)PRRSV、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)、偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)和豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)核酸,所用引物和探針序列見(jiàn)表2。所用引物和探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2 病毒檢測(cè)所用引物和探針序列

1.5 防控措施

1.5.1 治療 結(jié)合臨床癥狀、病理變化和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果,綜合診斷本次疫情為副豬格拉瑟菌和PRRSV混合感染。制定的治療方案為:全群給藥酒石酸泰萬(wàn)菌素(混飲,每1 L水,50～75 mg)和復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液(肌內(nèi)注射,每次20～30 mg/(kg·bw),1日1～2次,每連用3 d停藥1 d),持續(xù)給藥1周。全群給藥1周后,對(duì)A和B棟豬群接種PRRSV弱毒苗(R98株),用專(zhuān)用稀釋液稀釋成每頭份2 mL,肌內(nèi)注射。

1.5.2 評(píng)價(jià) 豬場(chǎng)每天記錄轉(zhuǎn)入數(shù)、轉(zhuǎn)出數(shù)、死淘數(shù)和存欄量,計(jì)算各棟舍的周死淘率,直至豬群出欄。采用GraphPad Prism 8軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,使用t檢驗(yàn)對(duì)各棟舍免疫前后的周死淘率進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn),以評(píng)估該綜合防控方案對(duì)發(fā)病豬場(chǎng)生產(chǎn)成績(jī)的影響。P>0.05表示差異不顯著,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查 該場(chǎng)育肥豬來(lái)自于偽狂犬病和豬瘟凈化的繁殖場(chǎng)。本育肥場(chǎng)于2021年10月12日陸續(xù)轉(zhuǎn)入豬只(約70日齡),10月29日轉(zhuǎn)入結(jié)束,該豬群未接種PRRSV疫苗,PCV2疫苗免疫程序?yàn)?4日齡首免、35日齡加強(qiáng)免疫。豬群轉(zhuǎn)入后,陸續(xù)出現(xiàn)豬只精神沉郁,食欲下降,體溫升高至41 ℃以上,畏寒扎堆,喜臥,行動(dòng)不便,咳嗽和噴嚏等癥狀,部分患豬呈犬坐式呼吸;輕度腹瀉,肛周可見(jiàn)黃色稀糞,尿液深黃、氨味重。腹股溝和陰門(mén)等柔軟部位有藍(lán)紫色淤血斑,體表可見(jiàn)紅色斑疹;剖檢8頭臨床癥狀明顯的發(fā)病豬,均觀(guān)察到大葉性肺炎,肺臟腫大充血、質(zhì)地變硬(圖1A),被膜下可見(jiàn)膠凍樣物質(zhì),肺間質(zhì)明顯增寬,可見(jiàn)多處出血斑相連成片,胸腔纖維素性滲出、積液(圖1B);出血性淋巴結(jié)炎,腹股溝淋巴結(jié)腫大至正常豬的3～4倍(圖1C);纖維素性心外膜炎(絨毛心),心包粘連、積液(圖1D)。

2.2 實(shí)驗(yàn)室診斷

2.2.1 細(xì)菌分離鑒定 TSA培養(yǎng)基上長(zhǎng)出針尖大小、無(wú)色、透明、光滑、濕潤(rùn)的菌落。挑取菌落提取DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果顯示,在750～1 000 bp位置可見(jiàn)清晰條帶,與副豬格拉瑟菌陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果一致,陰性對(duì)照對(duì)應(yīng)位置未見(jiàn)條帶(圖2),其他細(xì)菌PCR擴(kuò)增結(jié)果均為陰性,表明樣品中存在副豬格拉瑟菌。

圖2 副豬格拉瑟菌PCR擴(kuò)增

2.2.2 病毒核酸檢測(cè) 提取病料核酸得到的DNA和cDNA,進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè),結(jié)果顯示,8份樣品均為PRRSV和PCV2核酸陽(yáng)性(圖3)。

圖3 熒光定量PCR檢測(cè)PRRSV(A)和PCV2(B)

分析臨床癥狀、病理剖檢和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果,結(jié)合豬群的免疫背景進(jìn)行綜合診斷,最終判定本次發(fā)病為副豬格拉瑟菌和PRRSV的混合感染。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)雖然檢測(cè)到PCV2,但考慮豬群已經(jīng)按程序免疫過(guò)2次PCV2疫苗,并結(jié)合背景和臨床發(fā)病表現(xiàn),故判定PCV2并非本次疾病的主要原因。

2.3 防控措施評(píng)價(jià)

2.3.1 周死淘率和存欄量 采取防控措施時(shí),A棟豬群處于疫病暴發(fā)階段;B棟豬群開(kāi)始出現(xiàn)少量發(fā)病豬。A和B棟豬群存欄量和周死淘率結(jié)果如圖4所示,2021年12月11日,A棟豬群突然出現(xiàn)大量咳嗽、喘氣和發(fā)熱的病豬,1周內(nèi)豬群周死淘率急劇上升至19.85%;2021年12月16日全群投藥,1周后周死淘率下降至6.53%;隨后,2021年12月23日接種PRRSV弱毒苗,2周后周死淘率下降至1.00%左右,疫病得到有效控制(圖4A)。B棟豬群周死淘率維持在3%以下,經(jīng)2022年12月16日給藥和12月23日緊急接種,直至育肥豬出欄,豬群未出現(xiàn)大規(guī)模病情(圖4B)。說(shuō)明即使場(chǎng)內(nèi)相鄰豬舍發(fā)生PRRS,及時(shí)進(jìn)行全群給藥和接種PRRSV弱毒苗,能夠有效遏制疾病的發(fā)展,降低發(fā)病豬死淘率,減輕發(fā)病棟舍對(duì)相鄰棟舍的影響。

圖4 豬群周死淘率和存欄量

2.3.2 免疫前后周死淘率對(duì)比 A和B棟豬舍免疫前后各4周(2021年11月25日—12月23日和2021年12月23日—2022年1月20日)周死淘率對(duì)比結(jié)果如圖5所示,A棟豬群平均周死淘率由免疫前的7.74%下降至免疫后的1.57%,免疫后的周死淘率與免疫前相比具有極顯著差異(P<0.01)。B棟豬群免疫前后的平均周死淘率均維持在2.00%以下,免疫后的周死淘率與免疫前相比未見(jiàn)顯著差異(P>0.05),表明接種PPRSV弱毒苗有效地遏制了疾病的繼續(xù)發(fā)展。

圖5 免疫前后周死淘率對(duì)比

上述結(jié)果證明,使用復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液和酒石酸泰萬(wàn)菌素,并緊急接種PRRSV弱毒苗,極大降低了發(fā)病豬只死淘率,可有效控制和預(yù)防副豬格拉瑟菌和PRRSV的混合感染。

3 討論

據(jù)走訪(fǎng)調(diào)查,該豬場(chǎng)員工防疫意識(shí)淡薄,加上生豬市場(chǎng)行情低迷導(dǎo)致資金緊張,并未及時(shí)免疫相關(guān)疫苗和進(jìn)行預(yù)防性用藥,導(dǎo)致了疾病蔓延擴(kuò)大,造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。各棟舍沒(méi)有嚴(yán)格執(zhí)行定人定崗制度,員工在不同棟舍交叉工作;員工為了減小冬季豬舍內(nèi)的晝夜溫差,降低了舍內(nèi)通風(fēng)量和送風(fēng)頻率,豬舍內(nèi)刺激性氣體濃度升高,導(dǎo)致豬呼吸系統(tǒng)損傷,從而更容易受到呼吸道病毒和病原菌的侵襲[14,15]。上述問(wèn)題極大增加了疫病傳播和發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

在本試驗(yàn)中,豬場(chǎng)在使用藥物和疫苗的同時(shí),全面加強(qiáng)了飼養(yǎng)管理和生物安全的工作,包括阻斷人員和物資在棟舍間的流動(dòng)、淘汰發(fā)病豬、及時(shí)通風(fēng)和控制豬舍內(nèi)的溫濕度和氨氣水平、及時(shí)清理豬欄中的糞污等措施。研究表明,泰萬(wàn)菌素可以抑制PRRSV復(fù)制,縮短PRRSV病毒血癥周期,從而減輕PRRSV感染動(dòng)物的臨床癥狀和減少動(dòng)物病死率[16,17]。復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶注射液具有非常高效的廣譜抗菌作用,常用于緩解豬無(wú)名高熱癥狀[18]。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室多年來(lái)對(duì)該豬場(chǎng)抗菌藥敏感性監(jiān)測(cè)結(jié)果,該場(chǎng)流行的副豬格拉瑟菌對(duì)復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶鈉中度敏感。因此,這2種藥物被選為該豬場(chǎng)的常備藥物。值得注意的是,生產(chǎn)數(shù)據(jù)表明,接種PRRSV弱毒苗能夠有效降低豬群中PRRSV感染后的死淘率,這與先前研究中臨床免疫效果觀(guān)察一致[19,20]。酒石酸泰萬(wàn)菌素和復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶鈉的聯(lián)合用藥,停藥后配合使用PRRSV弱毒苗,進(jìn)一步降低了案例豬場(chǎng)發(fā)病豬的死淘率,為防治副豬格拉瑟菌和PRRSV的混合感染提供了方法參考。

養(yǎng)殖企業(yè)應(yīng)堅(jiān)持“預(yù)防為主,防大于治”的原則方針,把生物安全作為疫病防控的第一道防線(xiàn)。謹(jǐn)慎引種,引種后加強(qiáng)檢測(cè)。嚴(yán)抓舍內(nèi)衛(wèi)生環(huán)境和通風(fēng)換氣工作,做好豬只的越冬保暖工作。建立科學(xué)的消毒、藥品和疫苗使用制度,做好各階段豬只的保健預(yù)防工作,提高綜合防病水平[21,22];通過(guò)提高飼料的營(yíng)養(yǎng)配比,增加微量元素和益生菌等,增強(qiáng)豬群整體免疫力[23,24],從而保障生產(chǎn)的健康有序性。