李彬琦 李文明

1.河北省邯鄲市中心醫(yī)院綜合科，河北邯鄲 056001；2.河北省邯鄲市中心醫(yī)院院前急救，河北邯鄲 056001

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，具有易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)[1-2]。膀胱癌患者早期僅出現(xiàn)無痛性血尿，往往不夠重視，延誤病情，導(dǎo)致晚期膀胱癌患者治療效果不夠理想，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[3-5]。因此，深入研究膀胱癌發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制對(duì)進(jìn)一步提高膀胱癌的早期診斷和治療具有重要的意義[6-8]。層粘連蛋白γ1（recombinant laminin gamma 1，LAMC1）作為細(xì)胞外基質(zhì)的重要調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞的增殖、分化和黏附中發(fā)揮著重要的作用[9]。LAMC1 在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為發(fā)揮重要作用[10-12]。但LAMC1 對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的影響及其相關(guān)機(jī)制尚不清楚。本研究以膀胱癌細(xì)胞5637 作為研究對(duì)象，檢測(cè)干擾LAMC1 基因表達(dá)后對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響并探討其潛在的相關(guān)機(jī)制，旨在探討LAMC1 與膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)特性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究從河北省邯鄲市中心醫(yī)院采集了2019 年1 月至2021 年12 月的行根治膀胱全切術(shù)并經(jīng)病理確診的48 例膀胱癌患者的癌及癌旁組織，癌旁組織選擇距癌灶邊緣5 cm 以上并病理診斷為正常組織。其中包括男32 例，女16 例；＜60 歲14 例，≥60 歲34 例；平均年齡（66.3±14.2）歲；T2期26 例，T3～4期22 例。本研究經(jīng)河北省邯鄲市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過（20190124），并在采集標(biāo)本前均獲得患者知情同意并簽署了知情同意書。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①原發(fā)性腫瘤，且術(shù)后病理組織活檢證實(shí)為膀胱癌；②有完整的臨床、病理及預(yù)后隨訪資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠期及哺乳期的婦女；②合并其他惡性腫瘤；③肝、腎功能障礙；④合并自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病及其他器官或系統(tǒng)惡性腫瘤；⑤術(shù)前行放、化療及免疫治療。

1.3 材料

人膀胱癌UMUC3、T24、5637 及J82 細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞庫；RPMI-1640（SH30809。01）培養(yǎng)基和胎牛血清（貨號(hào)：SV30087.03）購于美國Hyclone 公司；LipofectamineTM2000、青霉素/鏈霉素雙抗、SuperScript ⅣFirst-Strand Synthesis System 試劑盒購于美國賽默飛公司；RNA 提取試劑盒（貨號(hào)：DP424）購于北京天根生化科技有限公司；二甲基亞砜細(xì)胞凍存液（貨號(hào)：ST1276）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution,PBS）（貨號(hào)：C0221B）、0.25%胰蛋白酶（貨號(hào)：C0209）、電轉(zhuǎn)緩沖液（貨號(hào)：P0021A）、電泳緩沖液（貨號(hào)：ST466）、吐溫20（貨號(hào)：ST2789）、蛋白質(zhì)裂解緩沖液（貨號(hào)：P0013B）、PVDF 膜即聚偏二氟乙烯膜（貨號(hào)：FFP19 和FFP24）、BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：P0010S）、電化學(xué)發(fā)光ECL 試劑盒（貨號(hào)：P0018S）及Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒（貨號(hào)：C0038）購于碧云天生物有限公司；細(xì)胞周期試劑盒（貨號(hào)：KGA511）凱基生物有限公司；SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（30～50 gels）（貨號(hào)：AR0138）購于武漢博士德生物工程有限公司。LAMC1 干擾質(zhì)粒及其陰性對(duì)照質(zhì)粒購于上海和元生物技術(shù)股份有限公司。兔抗人LAMC1 單克隆抗體（貨號(hào)：ab233389）、兔抗人cyclin D1 單克隆抗體（貨號(hào)：ab134175）、兔抗人cyclin A 單克隆抗體（貨號(hào)：ab181591）、兔抗人p16 單克隆抗體（貨號(hào)：ab51243）、兔抗人p21 單克隆抗體（貨號(hào)：ab109520）購于Abcam 生物公司。

1.4 研究方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 人膀胱癌細(xì)胞UMUC3、T24、5637 及J82 用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。選擇處于對(duì)數(shù)生長期的5637 細(xì)胞接種于6 孔板中，設(shè)置LAMC1 沉默組和陰性對(duì)照組，培養(yǎng)12～24 h 后待細(xì)胞融合度至60%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，根據(jù)Lipofectamine 2000 說明書進(jìn)行操作轉(zhuǎn)染。待細(xì)胞轉(zhuǎn)染6～12 h 后更換新鮮培養(yǎng)基，48 h 后收集細(xì)胞并提取RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法和Western blot 驗(yàn)證LAMC1 mRNA 及蛋白表達(dá)水平，驗(yàn)證干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果。

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time quantity polymerase chain reaction，RTqPCR）常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，設(shè)置LAMC1 沉默組和陰性對(duì)照組，使用RNA 提取試劑盒提取5637 細(xì)胞中的總RNA；使用SuperScript ⅣFirst-Strand Synthesis System試劑盒逆轉(zhuǎn)錄cDNA，使用SYBR Green 試劑盒在Bio-Rad IQ5 PCR 系統(tǒng)上進(jìn)行Rt-qPCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系：cDNA 模板1 μl，SYBR Green Mix 10 μl，PCR 正反向引物（20 μmol/L）各1 μl，RNA 無酶水20 μl。PCR擴(kuò)增條件為：95℃30 s，95℃5 s，60℃30 s，循環(huán)30次；95 ℃15 s；65℃1 min，以GAPDH 作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因LAMC1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，RT-qPCR 引物由武漢金斯瑞生物公司合成，引物序列見表1。

表1 qPCR 引物序列

1.4.3 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖 取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，于96 孔板上接種5637 細(xì)胞（每組1×104個(gè)/孔），設(shè)置LAMC1 沉默組和陰性對(duì)照組，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔；向每孔加入10 μl CCK-8 溶液并置于恒溫培養(yǎng)箱中孵育，37℃避光孵育2～3 h，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀分別在24、48、72 h 時(shí)間點(diǎn)每孔在450 nm波長處的OD 值，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.4.4 克隆形成試驗(yàn) 用0.25%胰蛋白酶消化制作出單細(xì)胞懸液，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)，將500 個(gè)細(xì)胞數(shù)量/孔種植在6 孔板中，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔；2～3 周，每隔4 d 換1 次新的培養(yǎng)基。將6 孔板移出，用4%多聚甲醛固定、1%晶體紫染色、PBS 連續(xù)沖洗5～8 次，拍攝照片，計(jì)數(shù)克隆數(shù)目，取平均值。

1.4.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 于6 孔板上接種5637 細(xì)胞（每組1×105個(gè)/孔），培養(yǎng)24～72 h 后胰酶消化并收集細(xì)胞；PBS 洗滌2 次；70%冷乙醇置于冰箱內(nèi)固定2 h，PBS 洗2 次，加入5 μl RNaseA（濃度為30mg/L）去除RNA 的影響，加入5μl 碘化丙啶（50 mg/L）染液避光孵育30 min；PBS 洗滌2 次，用600 μl PBS重懸細(xì)胞，最后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。

1.4.6 免疫組織化學(xué)法 采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法（streptavidin-perosidase，SP）檢測(cè)LAMC1 表達(dá)，通過二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、過氧化氫離子水孵育、高溫高壓抗原修復(fù)，隨后滴加兔抗人LAMC1 一抗（1∶100）4℃孵育過夜，次日滴加二抗室溫孵育1 h。二氨基二苯胺顯色，蘇木精復(fù)染，膠封。陰性對(duì)照組則以相同劑量的PBS 替代一抗。在對(duì)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的解讀過程中，由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)生進(jìn)行雙盲讀片，最后的免疫組織化學(xué)得分是以染色的強(qiáng)度及陽性細(xì)胞所占的比例這兩項(xiàng)乘積。在顯微鏡下隨機(jī)選擇5 個(gè)高倍鏡視野（400×），每個(gè)視野中計(jì)數(shù)100 個(gè)腫瘤細(xì)胞。染色強(qiáng)度評(píng)分：未著色為0 分，淡黃色為1 分，黃褐色為2 分，褐色為3分。陽性細(xì)胞所占的百分比：無陽性細(xì)胞為0 分；1%～25%為1 分；＞25%～50%為2 分；＞50%為3 分。LAMC1 表達(dá)強(qiáng)度的總分評(píng)判：＞4 分為高表達(dá)，≤4 分為低表達(dá)。

1.4.7 Western blot 實(shí)驗(yàn)5637 細(xì)胞用蛋白質(zhì)裂解緩沖液溶解，并提取總蛋白質(zhì)；用BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度并進(jìn)行變性處理。然后將樣品電泳，轉(zhuǎn)膜，10%的脫脂牛奶密封，加入兔抗人LAMC1 單克隆抗體（1∶5 000）、兔抗人cyclin D1 單克隆抗體（1∶3 000）、兔抗人cyclin A 單克隆抗體（1∶4 000）、兔抗人p16 單克隆抗體（1∶2 000）、兔抗人p21 單克隆抗體（1∶2 000）在4℃下孵育過夜。TBST 洗膜3 次，每次10 min，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫下孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min。最后用ECL 發(fā)光試劑盒顯影。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LAMC1 mRNA 在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)水平

RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，5637 細(xì)胞中LAMC1 mRNA 表達(dá)水平高于UMUC3、T24、J82 細(xì)胞（P＜0.05）。因此，本研究中選取表達(dá)水平最高的5637 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 LAMC1 在膀胱癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

LAMC1 在癌旁組織中呈現(xiàn)呈淡灰色或無著色，染色強(qiáng)度較淺，而在膀胱癌組織中呈棕色或棕褐色，染色強(qiáng)度較深（圖2）。LAMC1 在膀胱癌組織中陽性表達(dá)率為64.58%（31/48），在癌旁組織中陽性表達(dá)率為35.41%（55/48），膀胱癌組織與癌旁組織中LAMC1陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.54，P＞0.05）。

圖2 層粘連蛋白γ1 在膀胱癌及癌旁組織中的表達(dá)水平

2.3 LAMC1 沉默穩(wěn)定細(xì)胞株的建立

LAMC1 沉默組中的LAMC1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平低于陰性對(duì)照組（P＜0.01）。見圖3。

圖3 RT-qPCR 和Western blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染LAMC1 siRNA 后膀胱癌細(xì)胞5637 中LAMC1 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平（n=3）

2.4 沉默LAMC1 對(duì)5637 細(xì)胞增殖及克隆形成能力的抑制作用

CCK-8 法檢測(cè)結(jié)果顯示，LAMC1 沉默組在24、48、72 h 時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖活力低于陰性對(duì)照組（P＜0.01）（圖4A）。此外，細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LAMC1 沉默組5637 細(xì)胞集落形成率低于陰性對(duì)照組（P＜0.01）（圖4B～C）。

圖4 CCK-8 法及克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察LAMC1 基因沉默對(duì)5637 細(xì)胞的增殖的影響（n=3）

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)沉默LAMC1 對(duì)膀胱癌細(xì)胞周期的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，LAMC1 沉默組中細(xì)胞中S 期細(xì)胞所占的百分比低于陰性對(duì)照組（P＜0.01），G1 期細(xì)胞所占的百分比高于陰性對(duì)照組（P＜0.01）。見圖5。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)沉默LAMC1 表達(dá)對(duì)人膀胱癌5637 細(xì)胞周期的影響（n=3）

2.6 Western blot 檢測(cè)沉默LAMC1 對(duì)膀胱癌細(xì)胞周期蛋白表達(dá)水平的影響

Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，LAMC1 沉默組中cyclin D1 和cyclin A 蛋白的表達(dá)水平低于陰性對(duì)照組（P＜0.01），而p16 和p21 蛋白的表達(dá)水平高于陰性對(duì)照組（P＜0.01）。見圖6。

圖6 Western blot 檢測(cè)干擾LAMC1 表達(dá)對(duì)膀胱癌5637 細(xì)胞周期蛋白表達(dá)水平的影響（n=3）

3 討論

LAMC1 作為層粘連蛋白家族中的一員，由α、β和γ 鏈組成的三聚體化合物，是細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrixc，ECM）的重要調(diào)節(jié)因子，調(diào)控細(xì)胞黏附、遷移、分化及細(xì)胞增殖[13]。在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中，LAMC1 在腫瘤中高表達(dá)并促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[14-15]。Kashima 等[16]發(fā)現(xiàn)高級(jí)別子宮內(nèi)膜癌的LAMC1 轉(zhuǎn)錄水平明顯高于低級(jí)別子宮內(nèi)膜癌，且LAMC1 的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌FIGO 分期、肌層浸潤、頸/附件受累、血管淋巴結(jié)侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性。Ke 等[17]通過檢測(cè)32 例不同病理亞型的腦膜瘤患者中LAMC1 的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)LAMC1 在Ⅲ級(jí)腦膜瘤中的表達(dá)顯著高于Ⅰ級(jí)腦膜瘤（P＜0.05），且LAMC1 的表達(dá)升高與腫瘤復(fù)發(fā)及無瘤生存期縮短呈正相關(guān)。提示LAMC1 可作為腦膜瘤復(fù)發(fā)和患者生存的預(yù)測(cè)指標(biāo)，有可能成為治療腦膜瘤的新靶點(diǎn)。Kinoshita 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，LAMC1 在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)，沉默LAMC1 表達(dá)可明顯抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Nishikawa 等[19]發(fā)現(xiàn)LAMC1 在前列腺癌中高表達(dá)，進(jìn)一步的研究表明，miR-29s 可通過直接靶向LAMC1 從而發(fā)揮抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲的作用。這些研究均表明，LAMC1 基因在不同腫瘤中的表達(dá)及其相關(guān)作用可能取決于腫瘤的類型和不同腫瘤細(xì)胞的特性[20-21]。雖然有研究報(bào)道了多種腫瘤存在LAMC1 表達(dá)異常，并初步闡明其在腫瘤中的大致作用；但LAMC1 在膀胱癌中表達(dá)如何，以及其在膀胱癌中的作用及其相關(guān)機(jī)制鮮見相關(guān)報(bào)道。

本研究免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，LAMC1 在膀胱癌組織中的陽性表達(dá)率高于癌旁組織，提示其在膀胱癌中異常高表達(dá)，可能在膀胱癌的發(fā)生與發(fā)展過程中扮演癌基因的促癌作用。為了進(jìn)一步證實(shí)LAMC1 對(duì)膀胱癌生物學(xué)功能的影響，本研究結(jié)果顯示下調(diào)LAMC1 的表達(dá)明顯抑制了5637 細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞集落形成能力；提示LAMC1 在膀胱癌中可能發(fā)揮促癌作用。

研究報(bào)道，正常細(xì)胞增殖嚴(yán)格有序地進(jìn)行是通過細(xì)胞周期有規(guī)律地實(shí)現(xiàn)的，而腫瘤細(xì)胞的無限制增殖的相關(guān)機(jī)制與細(xì)胞周期的失控密切相關(guān)[22]。細(xì)胞周期是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，其中由細(xì)胞周期蛋白（cyclin）、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶和細(xì)胞周期蛋白依賴抑制性蛋白組成的細(xì)胞周期蛋白組成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程進(jìn)行嚴(yán)格而有序的調(diào)控，從而控制細(xì)胞增殖進(jìn)程[23-25]。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LAMC1沉默導(dǎo)致G0/G1期細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖；同時(shí)cyclin D1 和cyclin A 的表達(dá)明顯下調(diào)，而p16 和p21 蛋白的表達(dá)水平增加。提示LAMC1 可能通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的快速增殖潛能。

綜上所述，沉默LAMC1 基因表達(dá)后能夠明顯抑制膀胱癌5637 細(xì)胞的增殖和克隆形成能力，促使其發(fā)生G0/G1期細(xì)胞周期阻滯；其機(jī)制可能是調(diào)控細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)引起細(xì)胞周期分布的改變而起作用，提示LAMC1 可作為膀胱癌潛在的分子治療靶標(biāo)。