王 瑞,劉 濤,閆 明

信陽農(nóng)林學(xué)院,河南 信陽 464000

0 引言

姜(ZingiberofficinaleRosc.),為姜科姜屬的多年生草本植物,在我國有著悠久的食用及藥用歷史[1]。我國生姜產(chǎn)品主要為初級產(chǎn)品,深加工的精細產(chǎn)品較少,主要利用部分為根莖,莖葉一般丟棄或者焚燒。王紅萍 等[2]采用不同方法對文山生姜葉的營養(yǎng)成分進行了研究,發(fā)現(xiàn)姜葉中含有多種營養(yǎng)物質(zhì)。為開發(fā)和利用生姜副產(chǎn)品——姜莖,對不同工藝下姜莖提取物的抑菌效果進行了研究,以期為養(yǎng)殖業(yè)替抗減抗,提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

由河南省駐馬店市新蔡縣生姜種植地提供姜莖。

1.2 儀器與試劑

智能溫控電熱套(鄭西儀器科技(上海)有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE5520/RE52-99(上海亞榮生化儀器廠);大制冷量循環(huán)冷卻器DL10-10000G(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);超凈工作臺(上海蘇凈實業(yè)有限公司);電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司);振蕩培養(yǎng)箱(上海知楚儀器有限公司)。

大腸桿菌、沙門氏菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌菌種由信陽農(nóng)林學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實驗室提供。

1.3 姜莖有效成分提取

參考生姜有效成分的提取工藝[3-5]。

水提法:稱取已處理好的姜莖100 g,加入1 500 mL蒸餾水浸泡10 min,用電磁爐加熱至微沸并保持30 min,重復(fù)3次,合并3次煎液并過濾。

醇提法:稱取100 g姜莖放入圓底燒瓶中,加入適當(dāng)50%乙醇溶液,組裝回流提取裝置,設(shè)置提取溫度為65 ℃,提取3次,料液比依次為1：10、1：5、1：5(g/mL),每次提取時間為1.5 h。合并3次濾液,減壓回收乙醇。

用pH值為10的溶液提取姜莖有效成分,稱取100 g姜莖放入圓底燒瓶中,加入蒸餾水,用濃度為1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為10,提取溫度為65 ℃,分3次提取,提取的料液比依次為1：8、1：6、1：5(g/mL),提取時間依次為1、0.6、0.5 h,合并3次提取液并過濾。

1.4 抑菌效果測定

采用紙片擴散法(K-B法):將濾紙用打孔器制成圓形,放入高壓滅菌鍋中滅菌,烘干備用。將不同工藝下姜莖提取物原液均濃縮至50 mL,相當(dāng)于1 mL濃縮液中含有2 g姜莖原料,每種工藝提取的姜莖濃縮液一部分滅菌處理,另一部分不做任何處理,將濾紙片放入濃縮液中浸泡2 h。在超凈工作臺內(nèi)用移液槍吸取0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊拇郎y菌液500 μL接種到固體培養(yǎng)基上用涂布棒涂抹均勻,貼上制備好的藥敏片3片。水提法、醇提法、堿溶液提取法中的空白對照為無菌水浸泡的濾紙片。操作完成的平板放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),到細菌生長旺盛時取出平板用十字法測量抑菌圈直徑(mm),記錄抑菌圈的平均值。

1.5 最低抑菌濃度(MIC)測定

采用微量二倍稀釋法:將不同工藝下姜莖提取物再濃縮至8 g/mL,保存?zhèn)溆?。將一次?6孔板放入超凈工作臺內(nèi)用紫外線照射30 min以上,每孔均加入營養(yǎng)肉湯100 μL,在第1孔加入姜莖提取物100 μL。用移液槍將提取物和營養(yǎng)肉湯混合均勻后吸取100 μL加入第2孔中再次吹打均勻,重復(fù)此操作到第10孔。將待測菌稀釋至105CFU/mL,每孔加入稀釋好的菌液100 μL,第11孔加入無菌水作為陰性對照,第12孔作為陽性對照。最終提取物的濃度依次為:4 000、2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.812 5 mg/mL。

將96孔板密封好后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h,由于提取物顏色過深,前幾孔無法觀察到有無沉淀或澄清度變化,所以結(jié)合平板涂布法判定結(jié)果。培養(yǎng)結(jié)束后,將每孔液體全部吸出接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,涂布均勻后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h,取出平板進行菌落計數(shù)。平板上無細菌生長對應(yīng)的一孔即為最低抑菌濃度(MIC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜莖水提物的抑菌效果

記錄細菌培養(yǎng)4 h時,未滅菌與滅菌的姜莖水提物對大腸桿菌、沙門氏菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑,數(shù)據(jù)用Excel統(tǒng)計分析,由表1可知,姜莖水提物是否滅菌處理的抑菌效果差異不明顯,說明姜莖水提物具有耐高溫的特性,化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

表1 姜莖水提物平均抑菌圈直徑 單位:mm

由表2可知,姜莖水提物濃度大于等于4 000 mg/mL時,大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長完全受到抑制,低于此濃度抑制效果減弱有少量細菌生長;且隨著濃度降低,菌落數(shù)增多,空白對照孔液體澄清,陽性對照孔液體渾濁。

2.2 姜莖醇提物的抑菌效果

記錄細菌培養(yǎng)4h時,未滅菌與滅菌的姜莖醇提物對大腸桿菌、沙門氏菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑,數(shù)據(jù)用Excel統(tǒng)計分析制表。由表3可知,姜莖醇提物是否滅菌對其抑菌效果沒有顯著影響,表明姜莖醇提物耐高溫。姜莖醇提物對沙門氏菌的抑制作用明顯強于其他3種菌,抑菌圈可達19.12 mm。

表3 姜莖醇提物平均抑菌圈直徑 單位:mm

由表4可知,當(dāng)醇提物濃度大于等于4 000 mg/mL時,沙門氏菌與鏈球菌的生長狀態(tài)被完全抑制,低于此濃度時有少量細菌生長,且隨著濃度降低菌落數(shù)增加。

表4 姜莖醇提物最低抑菌濃度

2.3 姜莖pH值為10的堿溶液提取物抑菌效果

記錄細菌培養(yǎng)4 h時,未滅菌與滅菌的姜莖pH值為10的堿溶液對大腸桿菌、沙門氏菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑,數(shù)據(jù)用Excel統(tǒng)計分析制表。由表5可知,堿溶液提取物是否滅菌對抑菌效果沒有顯著影響,說明提取物耐高溫。

表5 姜莖pH10堿溶液提物平均抑菌圈直徑 單位:mm

由表6可知,當(dāng)姜莖堿提物濃度4 000 mg/mL時對鏈球菌生長沒有抑制作用,而對其他3種菌的生長完全抑制,濃度為2 000 mg/mL時只有少數(shù)細菌生長,所以姜莖堿提物對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為4 000 mg/mL。

表6 姜莖堿提物最低抑菌濃度

3 討論

抗生素使用不當(dāng),會使細菌產(chǎn)生耐藥性并加速傳播,大大增加環(huán)境中致病菌抵御抗生素的可能性,導(dǎo)致動物抗藥性增強,對疾病的抵抗力降低,使得疾病不僅多發(fā)而且難治。在我國,由于很長一段時間內(nèi)養(yǎng)殖門檻低、飼養(yǎng)體量大、散戶多、飼養(yǎng)管理不善、動物發(fā)病率較高、飼養(yǎng)者安全用藥意識缺乏等多種原因,普遍存在抗生素過量使用甚至濫用等問題,導(dǎo)致細菌耐藥性增強,動物源性食品抗生素殘留等問題日益凸顯,為養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展帶來風(fēng)險隱患[6]。2020年1月1日起我國飼料中將全面禁止添加抗生素,“減抗”成為畜牧業(yè)發(fā)展的大趨勢。推進安全、高效、綠色、環(huán)保的新型飼料添加劑及飼料產(chǎn)品的研究與開發(fā),加快抗菌藥替代品的技術(shù)集成與推廣應(yīng)用,是畜牧業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的技術(shù)保證。盧仲鉞 等[7]的研究表明生姜中黃酮類物質(zhì)、姜油、姜辣素的粗提取物對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有抑菌效果。另外,鄭悄然 等[8]、鄧方年[9]和劉瑞 等[10]的研究都表明生姜乙醇提取液均有一定抑菌作用,表現(xiàn)出一定抑菌活性。但對于其附屬產(chǎn)物姜莖提取物的抑菌作用研究較少。而本試驗結(jié)果表明,生姜莖葉含有抗菌活性物質(zhì)。生姜提取物中成分復(fù)雜,已分離鑒定出400多種化學(xué)成分,不同工藝下姜莖提取物成分構(gòu)成不同,這可能是導(dǎo)致抑菌效果差異的原因。2021年全國生姜種植面積達553萬畝(1畝≈666.67 m2),生姜產(chǎn)能達1 219萬t,隨之產(chǎn)生的大量姜莖具有潛在的開發(fā)利用價值。合理利用這類資源,不但可以開發(fā)新型非常規(guī)飼料資源,且為畜禽養(yǎng)殖行業(yè)面臨的抗生素替代、健康養(yǎng)殖問題提供了解決思路。

4 結(jié)論

試驗采用紙片擴散法初步探討了不同工藝下姜莖提取物的抑菌效果,同時也對提取物是否耐高溫、高壓進行了評估。結(jié)果為培養(yǎng)4h時姜莖水提物對鏈球菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用要優(yōu)于大腸桿菌和沙門氏菌;醇提物對沙門氏菌的抑制作用明顯優(yōu)于其他3種菌;pH值為10的堿溶液提取物對4種病原菌的抑制作用基本相同;不同工藝下姜莖提取物是否高壓滅菌對其抑菌效果沒有明顯的影響,說明各提取物具有熱穩(wěn)定性。姜莖水提物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的最低抑菌濃度均為4 000 mg/mL,在此濃度下對其他2種菌沒有抑制作用;醇提物對沙門氏菌、鏈球菌最低抑菌濃度均為4 000 mg/mL,在此濃度下對其他2種菌沒有抑制作用;pH值為10的堿溶液提取物對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度均為4 000 mg/mL,在此濃度下對鏈球菌沒有抑制作用。從4 h時各提取物對試驗菌的抑制作用來看,對大腸桿菌的抑制作用從大到小排序為堿提物、姜莖醇提物、水提物;對沙門氏菌的抑制作用從大到小排序為醇提物、堿提物、水提物;對鏈球菌的抑制作用從大到小排序為水提物、醇提物、堿提物;對金黃色葡萄球菌的抑制作用從大到小排序為醇提物、水提物、堿提物。從提取物對4種菌的最低抑菌濃度來看,堿提物抑菌效果最好,其次為水提物和醇提物。