其美拉姆,胡洹圓,曾南方,陳弟詩(shī),李 晏,顏其貴

1.西藏自治區(qū)林芝市察隅縣上察隅鎮(zhèn)農(nóng)牧綜合服務(wù)中心,西藏 察隅 860614 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,四川 成都 611130 3.巨星農(nóng)牧有限公司,四川 樂(lè)山 614899 4.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,四川 成都 610041

0 引言

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,Pm)是兩端鈍圓的革蘭陰性小桿菌或小球菌,為條件致病菌常存在于動(dòng)物和人的呼吸道中,當(dāng)宿主抵抗力下降時(shí)或受到其他影響便會(huì)引發(fā)感染,感染的宿主有廣泛性,包括牲畜、家禽和野生動(dòng)物等。動(dòng)物巴氏桿菌病主要表現(xiàn)為出血性敗血癥和出血性炎癥等[1],同時(shí)它也是人獸共患性傳染病病原,嚴(yán)重時(shí)可引起人菌血癥[2-3],對(duì)人體健康造成威脅。Pm可以感染各種年齡階段的豬,主要引起豬萎縮性鼻炎和豬肺炎等病癥,這2種疾病均可導(dǎo)致豬出現(xiàn)呼吸障礙,影響生長(zhǎng)和生產(chǎn)性能,甚至造成豬只死亡,同時(shí)該病會(huì)反復(fù)出現(xiàn),使養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟(jì)遭受?chē)?yán)重的創(chuàng)傷[4]。

Pm是一種具有多種血清型的細(xì)菌。這些血清型的區(qū)分是根據(jù)細(xì)菌體內(nèi)不同抗原成分的差異得出的。其中,根據(jù)脂多糖抗原和菌體抗原的不同被分為16個(gè)血清型和12個(gè)血清型。根據(jù)莢膜抗原的不同,又可以將其分5個(gè)血清型包括A、B、D、E、F。這些不同莢膜血清型的Pm對(duì)于動(dòng)物的感染性不同[5],其中莢膜血清型A、B、D 3種都能引起豬的疾病發(fā)生,但引發(fā)的疾病有所差異,如:A型主要引起豬肺炎,主要為呼吸系統(tǒng)疾病;B型主要引起豬出血性敗血癥,導(dǎo)致豬出現(xiàn)嚴(yán)重的血液感染;D型則主要引起豬萎縮性鼻炎,導(dǎo)致豬鼻腔組織出現(xiàn)萎縮和損傷。Pm的致病性與其多種毒力因子的存在和表達(dá)密切相關(guān)[6],毒力因子的編碼基因在細(xì)菌體內(nèi)起著重要的作用,決定了細(xì)菌的致病能力和侵襲性。其中,Pm的主要毒力基因包括黏附素相關(guān)的編碼基因(ptfA、pfhA)、鐵攝取蛋白有關(guān)的編碼基因(tonB)、外膜蛋白有關(guān)的編碼基因(plpB)、編碼唾液酸酶相關(guān)的基因(nanB)以及超氧化物歧化酶相關(guān)的基因(sodA)[7-8],此外,研究還發(fā)現(xiàn)莢膜Kmt1基因在Pm血清型分型中起著重要的作用,同時(shí)它還是Pm中重要的毒力因子之一[9]。

本試驗(yàn)對(duì)四川某豬場(chǎng)的發(fā)病豬肺臟等器官進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定,并對(duì)分離株進(jìn)行莢膜血清型、主要毒力基因鑒定、藥敏試驗(yàn)以及動(dòng)物回歸試驗(yàn),來(lái)說(shuō)明該菌的致病性,以期為該病的預(yù)防和控制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料

四川地區(qū)某豬場(chǎng)發(fā)病豬的肺臟、氣管、心臟等器官。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

3頭28日齡斷奶仔豬,臨床健康、體質(zhì)量相近,由巨星農(nóng)牧有限公司提供。

1.1.3 主要試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)均購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司;革蘭染色液、瑞士吉姆薩染色液、胎牛血清、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、瓊脂糖均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;藥敏紙片均購(gòu)自杭州濱和生物試劑有限公司;細(xì)菌DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;DL2000 DNA Marker、2×Green Taq Mix均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌的分離及染色鏡檢

將采集的病死豬肺臟組織在含有5%胎牛血清、0.1%NAD胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSA)平板上劃線接種,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后從疑似菌落中挑取單菌落并將其接種到新的TSA平板上培養(yǎng)純化,觀察記錄菌落形態(tài)。接下來(lái),在新平板中挑取單菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢觀察菌體的形態(tài)學(xué)特征,這些信息為后續(xù)的鑒定和研究提供基礎(chǔ)。

1.2.2 16S rRNA的擴(kuò)增

將分離的菌純培養(yǎng)物與ddH2O稀釋后作為模板,進(jìn)行16S rRNA菌落PCR擴(kuò)增。引物序列信息見(jiàn)表1,引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系為20 μL,如表2所示;PCR反應(yīng)程序:95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s;45 ℃ 15 s;72 ℃ 30 s,共34個(gè)循環(huán);額外延伸72 ℃ 5 min。最后,用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。將含目的片段的產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,并把測(cè)序結(jié)果與Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中參考菌株進(jìn)行序列比對(duì)。

表1 16S rRNA 擴(kuò)增引物

表2 PCR反應(yīng)體系

1.2.3 細(xì)菌種屬鑒定與莢膜分型

將分離得到的菌株加至含有5%牛血清與0.1%NAD的TSB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng),參照細(xì)菌DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū),提取菌株DNA作為PCR擴(kuò)增模板,參照文獻(xiàn)[10]合成Kmt1特異性和莢膜血清型引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物的序列信息見(jiàn)表3。PCR擴(kuò)增體系與程序同1.2.2節(jié)一致。

表3 種屬鑒定與莢膜分型引物信息表

1.2.4 分離菌株主要毒力基因檢測(cè)

針對(duì)6種Pm主要毒力基因:4型菌毛蛋白(ptfA)、血球凝集素(pfhA)、超氧化物歧化酶(sodA)、外膜蛋白(plpB)、鐵調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白(tonB)、神經(jīng)氨酸酶(nanH)等合成相關(guān)引物對(duì)分離菌主要的6種毒力基因進(jìn)行PCR檢測(cè)[11],引物信息見(jiàn)表4。PCR擴(kuò)增體系與程序同1.2.2節(jié)一致。

表4 毒力基因引物信息

1.2.5 藥敏試驗(yàn)

采用K-B法對(duì)分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。首先,挑取純化培養(yǎng)后的單菌落接種于營(yíng)養(yǎng)TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng),使菌液最終濃度為1×108CFU/mL左右;使用滅菌棉簽沾取少量菌液涂布于營(yíng)養(yǎng)TSA培養(yǎng)基上,并放置抗菌藥物的藥敏紙片至平板上。37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后,觀察抑菌圈是否出現(xiàn)并測(cè)量抑菌圈的直徑大小,直徑大小可以反映抗菌藥物的抑菌效果,參考微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(CLSI)2019版進(jìn)行結(jié)果判定。

1.2.6 分離菌動(dòng)物回歸試驗(yàn)

用純化后的分離菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期活細(xì)菌量約為1×109CFU/mL,將3頭28日齡巴氏桿菌陰性豬分成3組,將分離株進(jìn)行動(dòng)物回歸試驗(yàn)[12],一組748號(hào)為滴鼻+肌注各1 mL Pm培養(yǎng)物(總量2 mL/10 kg),一組795號(hào)僅為用滴鼻(2 mL/10 kg);并以PBS作為陰性對(duì)照,感染后每天觀察并記錄各組的臨床癥狀。用無(wú)菌棉簽采集每組豬的鼻拭子進(jìn)行分離致病菌;若感染豬發(fā)病致死,剖檢觀察感染組各器官的病理變化以及與對(duì)照組各器官對(duì)比;同時(shí),將肝臟觸片進(jìn)行瑞氏吉姆薩染色后,觀察細(xì)菌形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離及染色鏡檢

將無(wú)菌采集的病死豬肺臟內(nèi)容物接種于營(yíng)養(yǎng)TSA平板上,置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),可見(jiàn)呈圓形、微凸起、表面光滑、邊緣規(guī)則、半透明的露滴狀細(xì)小菌落如圖1(a)所示。對(duì)分離菌進(jìn)行革蘭染色,鏡檢可見(jiàn)革蘭陰性細(xì)小、兩端鈍圓的短桿菌,呈單個(gè)或雙個(gè)存在如圖1(b)所示,符合Pm的特征。

圖1 細(xì)菌分離及染色鏡檢圖(1 000×)

2.2 16S rRNA的擴(kuò)增

對(duì)分離菌純培養(yǎng)物作為DNA模板進(jìn)行16S rRNA菌落PCR擴(kuò)增,獲得為1 420 bp左右的基因條帶(圖2)。將測(cè)序結(jié)果與Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中參考菌株進(jìn)行序列比對(duì),結(jié)果表明分離菌與Pm參考菌株(OL958441.1)的序列同源性高達(dá)99.6%。

M—DL2000 DNA Maker;1—分離菌;2—陰性對(duì)照。

2.3 細(xì)菌種特異性鑒定與莢膜血清型鑒定

利用Kmt1(460 bp)對(duì)分離菌進(jìn)行特異性鑒定;同時(shí),利用capA(1 044 bp)、capB(760 bp)、capD(657 bp)、capE(511 bp)、capF(851 bp)5種莢膜血清型對(duì)分離菌進(jìn)行血清型鑒定。在Kmt1基因鑒定中獲得大小為460 bp左右的基因條帶(圖3),與預(yù)期大小相符合,符合Pm的鑒定特征。在莢膜血清型鑒定中,結(jié)果顯示獲得1 044 bp左右條帶,符合莢膜A型Pm基因條帶大小(圖3),測(cè)序后經(jīng)NCBI序列比對(duì),鑒定結(jié)果為莢膜血清型A型Pm的基因序列。

M—DL2000 DNA Maker;1、2—分離菌種PCR鑒定; 3、4—分離菌莢膜血清型分型。

2.4 分離菌主要毒力基因檢測(cè)

對(duì)分離菌進(jìn)行6種主要毒力基因PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,該分離菌攜帶有plpB(282 bp)、ptfA(488 bp)、pfhA(286 bp)、sodA(361 bp)、tonB(261 bp)、nanH(287 bp)6種毒力基因,陰性對(duì)照均成立(圖4)。

M—DL2000Marker;1、2—plpB,陰性對(duì)照;3、4—ptfA, 陰性對(duì)照;5、6—pfhA,陰性對(duì)照;7、8—sodA,陰性對(duì)照; 9、10—tonB,陰性對(duì)照;11、12—nanH,陰性對(duì)照。

2.5 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)

采用藥敏紙片擴(kuò)散(K-B)法對(duì)該分離菌進(jìn)行22種抗菌素藥物敏感性檢測(cè),抗生素的純化物進(jìn)行藥敏試驗(yàn),藥敏試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果如表5,該分離菌對(duì)氨芐西林、羧芐西林、頭孢唑啉、頭孢哌酮、多西環(huán)素、復(fù)方新諾、慶大霉素、諾氟沙星、氟苯尼考、氧氟沙星10種抗菌藥物敏感;對(duì)頭孢曲松、磺胺異噁唑、丁胺卡那、環(huán)丙沙星、呋喃唑酮5種藥物中度敏感;對(duì)青霉素、頭孢氨芐、四環(huán)素、阿米卡星、多黏菌素B、紅霉素、克林霉素7種抗菌藥物耐。

表5 分離菌的藥敏試驗(yàn)

2.6 分離菌動(dòng)物回歸試驗(yàn)

2.6.1 臨床觀察

攻毒后12 h,攻毒組748號(hào)運(yùn)動(dòng)稍有減少,嗜睡,但刺激反應(yīng)、呼吸均正常,對(duì)照組與攻毒組795號(hào)一切正常;攻毒后24 h,攻毒組748號(hào)體溫偏低,食欲減少,但呼吸正常,對(duì)照組與攻毒組795號(hào)一切正常;攻毒后48 h,攻毒組748號(hào)不活躍,能站立但出現(xiàn)斜倚,食欲明顯減退,精神沉郁,耳后背部出現(xiàn)紅斑點(diǎn),頻繁搖鼻,攻毒組795號(hào)不活躍,嗜睡,采食減少,對(duì)照組一切正常;攻毒后62 h,攻毒組748號(hào)蜷臥狀態(tài),食欲明顯減退,精神沉郁,眼瞼發(fā)腫,有血性眼分泌物,鼻腔有少量鼻液,攻毒組795號(hào)食欲減少,反應(yīng)不敏,對(duì)照組一切正常;攻毒后82 h,攻毒組748號(hào)死亡,攻毒組795號(hào)食欲減少,反應(yīng)不敏,對(duì)照組一切正常。

2.6.2 剖檢觀察

對(duì)死亡仔豬進(jìn)行剖檢,肺臟充血,出現(xiàn)肉質(zhì)病變;氣管內(nèi)有少量黏液分泌物并出現(xiàn)血性泡沫。對(duì)照組組織器官無(wú)病理變化。同時(shí),將試驗(yàn)豬肝組織觸片進(jìn)行瑞氏吉姆薩染色,在顯微鏡下可以觀察到呈藍(lán)色且兩極濃染、兩端鈍圓的小桿菌存在(圖5)。

箭頭所指部分為兩極濃染細(xì)菌所在位置。

3 討論

研究表明Pm有5種莢膜血清型,由于莢膜血清型與致病性之間存在一定的相關(guān)性,且它的每種莢膜血清型之間交叉的免疫保護(hù)效果差[13],因此,了解不同血清型Pm的感染性和致病特點(diǎn),對(duì)于預(yù)防和控制相關(guān)疾病具有重要意義。其中血清型A、B、D均可誘發(fā)豬的疾病,A型主要引起豬肺炎[14]。本試驗(yàn)從病死豬肺臟氣管心臟等器官中分離培養(yǎng)獲得一株細(xì)菌,經(jīng)過(guò)細(xì)菌分離鑒定、染色鏡檢、血清型與主要毒力基因檢測(cè)等一系列的試驗(yàn)確定為莢膜血清型A型的Pm,這與發(fā)病豬主要表現(xiàn)為肺炎的臨床癥狀相符。由于長(zhǎng)期的濫用和不合理使用抗生素,Pm對(duì)許多常用的抗菌藥物已經(jīng)產(chǎn)生了耐藥性。為了更好地了解Pm的耐藥性情況,對(duì)此次A型Pm分離株進(jìn)行藥敏檢測(cè),結(jié)果顯示,在22種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)中有10種抗菌藥物對(duì)Pm較為敏感,5種藥物中度敏感,而有7種抗菌藥物則顯示出較為嚴(yán)重的耐藥性。特別是對(duì)于大環(huán)內(nèi)酯類和青霉素藥物,Pm表現(xiàn)出了明顯的耐藥性,這意味著這些藥物在治療Pm感染時(shí)的療效可能較差。此外,研究還發(fā)現(xiàn)Pm對(duì)同類藥物的耐藥性存在差異,推測(cè)可能是因?yàn)榕R床中經(jīng)常使用的抗生素有所關(guān)系,長(zhǎng)期使用某一種抗生素會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)該類藥物產(chǎn)生逐漸增強(qiáng)的耐藥性,從而使該類藥物在治療Pm感染時(shí)的療效減弱。這提示在使用抗生素時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎,以免加劇細(xì)菌的耐藥情況,進(jìn)而影響到感染的治療效果。而且,在豬場(chǎng)的日常養(yǎng)殖生產(chǎn)中,要做到預(yù)防為主、養(yǎng)治結(jié)合。

細(xì)菌的毒力因包括細(xì)菌毒素、細(xì)菌附著因子、細(xì)菌內(nèi)毒素等,可以影響細(xì)菌的致病性、存活力和繁殖力。細(xì)菌性病原是動(dòng)物呼吸道感染和死亡的主要原因,這些細(xì)菌能夠通過(guò)空氣中的微小顆粒或直接接觸傳播到宿主的呼吸道,引發(fā)疾病癥狀,其中Pm是常見(jiàn)的呼吸道致病菌[15],在動(dòng)物中引起呼吸道感染的發(fā)病率較高。Pm菌株具有一系列的毒力因子,這些因子可以使細(xì)菌更容易附著于宿主呼吸道上皮細(xì)胞,并進(jìn)一步侵入宿主組織。此外,其還能產(chǎn)生細(xì)菌毒素,這些毒素可以損害宿主細(xì)胞、破壞免疫系統(tǒng)的功能,從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和組織損傷。為了更好地了解Pm菌株的致病機(jī)制,研究人員可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)室中的細(xì)菌培養(yǎng)和動(dòng)物感染模型來(lái)評(píng)估其毒力和致病性。從毒力基因檢測(cè)和動(dòng)物回歸試驗(yàn)得到的結(jié)果中,推測(cè)本次分離到的A型Pm具有較強(qiáng)的致病性。首先,對(duì)分離株進(jìn)行毒力基因檢測(cè),發(fā)現(xiàn)該分離菌攜帶6種主要毒力基因(ptfA、pfhA、sodA、plpB、tonB、nanH)。然后,對(duì)28日齡仔豬進(jìn)行動(dòng)物回歸試驗(yàn),聯(lián)合滴鼻、滴鼻加肌內(nèi)注射途徑攻毒,攻毒后出現(xiàn)了食欲減退甚至厭食、精神不振、腹式呼吸、耳后、背部出現(xiàn)紅斑、消瘦,眼瞼發(fā)腫等典型臨床癥狀;對(duì)其進(jìn)行病理解剖發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)豬肺臟充血,出現(xiàn)肉質(zhì)病變;氣管內(nèi)有少量血性黏液分泌物并呈泡沫狀等病理變化,在對(duì)肝組織觸片進(jìn)行瑞氏吉姆薩染色后,在顯微鏡下觀察到呈藍(lán)色且兩極濃染的細(xì)菌存在,成功建立了豬巴氏桿菌病發(fā)病模型,并探討了其在本源動(dòng)物中發(fā)生發(fā)展的規(guī)律,有助于更好的應(yīng)對(duì)和預(yù)防相關(guān)感染疾病的發(fā)生。

4 結(jié)論

本次試驗(yàn)成功分離得到一株莢膜血清型A型的豬源Pm,毒力基因檢測(cè)結(jié)果與動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果均顯示該分離菌具有較強(qiáng)的致病性,為研究Pm的致病性提供一定參考,也對(duì)四川地區(qū)豬場(chǎng)防控具有警示意義。同時(shí),該分離菌在22種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果僅有10種藥物對(duì)該分離菌有敏感性,為臨床上治療該病提供有效、快捷的方法。