趙 沱 白鵬飛 孫 婧 程 濤

（長安醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西 西安 710016）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是常見的心血管疾病，由動(dòng)脈粥樣硬化引起冠狀動(dòng)脈管腔閉塞和斑塊破裂導(dǎo)致[1]。AMI起病急、病情危重，對(duì)于AMI的早期診斷尤為重要，臨床常用心肌酶譜[肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶MB同工酶（creatine kinase MB isoenzyme，CK-MB）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）]和心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）診斷AMI[2]。但cTnI和CK-MB升高還與其他原因?qū)е滦募〖?xì)胞損傷或細(xì)胞通透性增加有關(guān)，并且上述心肌細(xì)胞損傷標(biāo)志物檢測受多種因素的影響[3]。因此，有必要尋找新的AMI分子標(biāo)志物。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一種不能編碼蛋白質(zhì)、長度≥200 nt的長鏈RNA，可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為[4]。核富集轉(zhuǎn)錄體 1（nuclear paraspeckle assembly transcript 1，NEAT1）是近年來發(fā)現(xiàn)的lncRNA，已有研究發(fā)現(xiàn)心力衰竭合并肺部感染患者血清lncRNA NEAT1表達(dá)顯著升高[5]，干擾lncRNA NEAT1表達(dá)能減輕缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和心肌細(xì)胞凋亡[6]，提示lncRNA NEAT1在心肌相關(guān)疾病中起重要作用。本研究擬探討lncRNA NEAT1在AMI診斷中的價(jià)值，及其與心肌酶譜的相關(guān)性，為臨床診斷和治療AMI提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年6月—2020年12月長安醫(yī)院AMI患者77例（AMI組）、不穩(wěn)定型心絞痛（unstable angina pectoris，UAP）患者70例（疾病對(duì)照組）、體檢健康者76名（正常對(duì)照組）。

AMI納入標(biāo)準(zhǔn)：1）符合AMI診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；2）入院時(shí)發(fā)病時(shí)間≤24 h；3）入院前未接受過心肌梗死治療；4）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）合并嚴(yán)重肝、腎、肺功能障礙；2）合并惡性腫瘤；3）近期使用過免疫抑制劑或存在嚴(yán)重免疫功能缺陷；4）合并嚴(yán)重血液傳染性疾病；5）合并先天性心臟病或嚴(yán)重心律失常；6）合并精神疾病。UAP患者符合《不穩(wěn)定型心絞痛中醫(yī)診療專家共識(shí)》[8]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）合并嚴(yán)重的肝、腎功能衰竭；2）合并精神疾病。本研究經(jīng)長安醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集

收集所有研究對(duì)象的臨床資料，包括年齡、性別、吸煙史、糖尿病史、高血壓史、血脂情況等。

1.2.2 lncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)量檢測

采集AMI和UAP患者入院時(shí)、正常對(duì)照者體檢當(dāng)日空腹靜脈血5 mL，3 000×g離心10 min，分離血清。采用TRIzol試劑（美國ThermoFisher Scientific公司）提取血清總RNA，將總RNA溶于10 μL超純水，測定RNA的濃度和純度，以1.7

以cDNA為模板，采用ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國ABI公司）和SYBR Green PCR試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]檢測lncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)量，檢測方法為實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTqPCR），以GAPDH為內(nèi)參。反應(yīng)體系：共10 μL，其中SYBR Green Mix 5.0 μL，PCR F Primer 0.2 μL，PCR R Primer 0.2 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 2.6 μL。引物序列：lncRNA NEAT1上游引物為5'-GGATGATGCAAACAATTACTG-3'，下游引物為5'-TCCACCTACACACCCAC-3'；GAPDH上游引物為5'-GATGGCTAGTCGTAGCATCG-3'，下游引物為5'-AGCTGGCATGCCCGATCGATC-3'。引物設(shè)計(jì)和合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。采用2-ΔΔCt計(jì)算lncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 心肌酶譜和cTnI水平檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測cTnI，試劑盒購自武漢菲恩生物科技有限公司。采用DXC600全自動(dòng)生化分析儀（美國貝克曼公司）和配套試劑檢測CK、CK-MB、LDH和AST水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0和Origin 9.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用K-S檢驗(yàn)評(píng)估計(jì)量資料的正態(tài)性。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。呈非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25，P75）]表示，多組間比較采用Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用例或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)估lncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)量診斷AMI的效能。采用Pearson或Spearman相關(guān)分析評(píng)估lncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)量與血清心肌酶譜和cTnI的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組之間臨床資料比較

3組之間年齡、性別、吸煙史、糖尿病史、高血壓史、高血脂等臨床資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 3組之間臨床資料比較

2.2 正常對(duì)照組、疾病對(duì)照組和AMI組lncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)量比較

正常對(duì)照組、疾病對(duì)照組和AMI組血清lncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)量分別為1.04±0.23、1.76±0.35、2.54±0.47。3組之間血清lncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=17.461，P<0.001）。見圖1。

圖1 3組lncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)量比較

2.3 正常對(duì)照組、疾病對(duì)照組和AMI組血清心肌酶譜和cTnI水平比較

與正常對(duì)照組和疾病對(duì)照組比較，AMI組cTnI、CK、CK-MB、LDH、AST水平升高（P<0.05）。與正常對(duì)照組比較，疾病對(duì)照組cTnI、CK、CK-MB、LDH、AST水平升高（P<0.05）。見表2。

表2 正常對(duì)照組、疾病對(duì)照組和AMI組血清心肌酶譜和cTnI水平比較

2.4 lncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)量診斷AMI的效能

ROC曲線分析結(jié)果顯示，lncRNA NEAT1診斷AMI的曲線下面積（95%可信區(qū)間）為0.825（0.754～0.895），最佳臨界值為1.595，Youden指數(shù)為0.582，敏感性為77.9%，特異性為80.3%；鑒別診斷AMI和UAP的曲線下面積（95%可信區(qū)間）為0.759（0.680～0.838），最佳臨界值為1.385，Youden指數(shù)為0.478，敏感性為67.5%，特異性為78.3%。見圖2、圖3。

圖2 lncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)量診斷AMI的ROC曲線

2.5 lncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)量與心肌酶譜和cTnI水平的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析和Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，lncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)量與CK、CKMB、LDH、AST和cTnI水平均呈正相關(guān)（r值分別為3.081、3.772、2.915、3.004、4.021，P<0.05）。

3 討論

近年來，越來越多的證據(jù)表明lncRNA在心肌損傷中具有重要作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在心肌缺血再灌注損傷小鼠模型中，lncRNA NEAT1呈高表達(dá)，高水平的lncRNA NEAT1會(huì)促進(jìn)心肌損傷，敲低lncRNA NEAT1可減輕心肌缺血再灌注損傷[10]。有研究結(jié)果顯示，lncRNA NEAT1下調(diào)可顯著抑制LDH、丙二醛、活性氧和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)的心肌細(xì)胞凋亡[11-12]。由此可見，高表達(dá)的lncRNA NEATI與心肌損傷密切相關(guān)。郭俊等[13]的研究結(jié)果顯示，老年AMI患者外周血lncRNA NEAT1表達(dá)顯著上調(diào)，對(duì)AMI的早期診斷有一定的價(jià)值。CHEN等[14]的研究結(jié)果顯示，血清外泌體lncRNA NEAT1是診斷急性ST段抬高型心肌梗死的有效生物標(biāo)志物，與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，AMI患者血清lncRNA NEATI相對(duì)表達(dá)量顯著高于疾病對(duì)照組和正常對(duì)照組（P<0.05）；ROC曲線分析結(jié)果顯示，lncRNA NEAT1診斷AMI的曲線下面積為0.825，可作為診斷AMI潛在的分子標(biāo)志物。

心肌酶譜和cTnI是常用的AMI診斷指標(biāo)，AMI患者心肌酶譜和cTnI水平顯著升高[15-16]。本研究Spearman相關(guān)分析和Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，lncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)量與CK、CK-MB、LDH、AST和cTnI均呈正相關(guān)（r值分別為3.081、3.772、2.915、3.004、4.021，P<0.05）。cTnI和CK-MB等生物標(biāo)志物的定量檢測可能會(huì)受抗凝劑使用等多種因素的影響，導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)偏差，且cTnI一般是在AMI發(fā)生6 h后才出現(xiàn)升高，可能會(huì)導(dǎo)致漏診等情況發(fā)生，降低了臨床診斷效率[17]。因此，多種血清生物標(biāo)志物的聯(lián)合檢測或可提高AMI早期診斷的準(zhǔn)確性。

綜上所述，AMI患者血清lncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)量顯著升高，且與心肌酶譜和cTnI水平呈正相關(guān)，或可作為AMI潛在的生物標(biāo)志物。