楊玉強 全曉麗 王劉玉 鮮文峰 楊 紅

（1.南陽市第二人民醫(yī)院骨一科，河南 南陽 473000；2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 鄭州 450001）

骨肉瘤是兒童和青少年人群高發(fā)的原發(fā)性間葉組織惡性腫瘤，病死率較高[1]。盡管針對骨肉瘤的診療策略不斷優(yōu)化，但對于發(fā)生轉移的患者療效仍有限，患者復發(fā)率和死亡率依然較高[2]。目前，骨肉瘤發(fā)病機制尚不完全清楚。有研究結果顯示，內(nèi)質網(wǎng)應激蛋白參與了骨肉瘤細胞的惡性增殖[3]。還有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質網(wǎng)應激可誘導骨肉瘤細胞凋亡和自噬[4]。核糖體結合蛋白1（ribosome-binding protein 1，RRBP1）作為一種粗面內(nèi)質網(wǎng)蛋白，在新生蛋白跨膜易位和內(nèi)質網(wǎng)應激中發(fā)揮重要作用[5]，其在多種惡性腫瘤組織中表達異常[6]，與前列腺癌預后密切相關[7]，也是判斷食管癌患者預后的潛在生物標志物[8]。但RRBP1是否參與了骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展尚不明確。本研究擬通過檢測骨肉瘤組織中RRBP1蛋白的表達情況，分析其在不同臨床病理參數(shù)骨肉瘤患者中表達的差異，并觀察下調(diào)其表達對骨肉瘤細胞特性的影響。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2014年6月—2020年6月在南陽市第二人民醫(yī)院和鄭州大學第一附屬醫(yī)院行手術治療的骨肉瘤患者91例，其中男52例、女39例，年齡（19.62±8.15）歲。所有患者經(jīng)病理學檢查確診為骨肉瘤，排除繼發(fā)性骨腫瘤。組織學類型：纖維母細胞型15例，軟骨母細胞型17例，骨母細胞型43例，混合型16例；腫瘤部位：四肢骨72例，中軸骨19例；Enneking分期：ⅡA期28例，ⅡB～Ⅲ期63例；發(fā)生遠隔轉移42例。另選取南陽市第二人民醫(yī)院骨科行手術治療且排除骨腫瘤的患者45例，其中男27例、女18例，年齡（20.05±9.05）歲。骨肉瘤患者和骨科手術患者之間性別和年齡差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。本研究經(jīng)南陽市第二人民醫(yī)院倫理委員會批準（NYSDERMYY20130809113），所有患者均知情同意。

1.2 主要儀器和試劑

兔抗人RRBP1多克隆抗體（克隆號bs-6574R，北京博奧森生物公司），免疫組化試劑盒和配套試劑（上海研卉生物公司），人骨肉瘤細胞系U-2OS（上海通派生物公司），Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）、胎牛血清和青霉素-鏈霉素（美國Gibco公司）。RRBP1干擾序列（si-RRBP1）和對照序列（si-NC）由上海捷蘭生物公司合成，Trizol試劑和Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司），逆轉錄和擴增試劑盒（日本TaKaRa公司）。RRBP1和內(nèi)參[甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）]引物由生工生物（上海）股份有限公司合成。CCK-8試劑盒（上海碧云天公司），Transwell小室（美國Corning公司），基質膠（美國BD公司）。StepOne Plus實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司），GellDoc XR+凝膠電泳分析系統(tǒng)、xMark酶標儀（美國伯樂公司），DP50顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 骨肉瘤組織和正常骨組織RRBP1蛋白表達的檢測

分別收集骨肉瘤患者和骨科手術患者的骨肉瘤組織和正常骨組織樣本，石蠟包埋，以4 μm厚度切片，經(jīng)烤片、脫臘、脫水、透明至水，浸入pH值為6.0的檸檬酸鈉液行抗原修復，用3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）沖洗3次。滴加兔抗人RRBP1抗體（1∶800稀釋），4 ℃孵育過夜，PBS沖洗，滴加二抗，孵育60 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復染，透明、封片觀察。在光學顯微鏡的高倍鏡下隨機取5個視野。按文獻[9]方法進行評分。1）染色評分：無染色為0分，淡黃為1分，棕黃為2分，棕褐為3分；2）染色細胞百分比評分：<5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。以染色評分與染色細胞百分比評分的乘積為最終得分，≥1分為陽性。

1.4 病例隨訪

從手術當日開始，每3個月對患者電話隨訪1次，每6個月來院復查1次，對于未按時復查者，進行電話隨訪。隨訪截止日期為2021年12月，記錄患者生存情況。

1.5 細胞學實驗

1.5.1 細胞培養(yǎng)和處理

將U-2OS細胞置于含10%胎牛血清的DMEM中，在5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。當細胞融合度≥80%時，消化，傳代。將對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板中，待細胞密度>70%時，用Lipofectamine 2000轉染不同序列。1）si-RRBP1組：轉染RRBP1干擾序列5'-GCAAGCCAGGATGGATATTTA-3'；2）si-NC組：轉染陰性對照序列5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'；3）空白對照組：僅加入轉染試劑。處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。以常規(guī)培養(yǎng)的U-2OS細胞作為對照。

1.5.2RRBP1 mRNA表達的檢測

取U-2OS細胞和si-RRBP1組、si-NC組和空白對照組細胞，加入裂解液，采用Trizol試劑提取細胞總RNA。用逆轉錄試劑將RNA逆轉錄為互補DNA（complementary DNA，cDNA），以cDNA為模版，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTqPCR）擴增。RRBP1 mRNA上游引物為5'-AACCTAATGGGAAGATACCTGA-3'，下游引物為5'-CATGGCTGGAACTGTGGC-3'；GAPDH上游引物為5'-CTGAACGGGAAGCTCACTGG-3'，下游引物為5'-TGAGGTCCACCACCCTGTTG-3'。反應條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，58 ℃30 s，70 ℃ 30 s，36個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算RRBP1 mRNA相對表達量。

1.5.3 RRBP1蛋白表達的檢測

采用免疫印跡法檢測RRBP1蛋白的表達。取U-2OS細胞和si-RRBP1組、si-NC組和空白對照組細胞，加入蛋白裂解液，離心后取上清，用二喹啉甲酸（bicinchonic acid，BCA）試劑盒測定總蛋白濃度。取50 μg蛋白，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉封閉120 min，加入兔抗人RRBP1多克隆抗體（1∶600稀釋），4 ℃過夜孵育，三羥甲基氨基甲烷-吐溫緩沖液（trishydroxymethyl aminomethane-Tween，TBST）沖洗3次，加入二抗，室溫孵育120 min，TBST沖洗3次，加入顯色劑，以GAPDH為內(nèi)參，采用Image J軟件（美國國立衛(wèi)生研究院）分析條帶的灰度值，計算相對表達量。

1.5.4 細胞增殖實驗

取si-RRBP1組、si-NC組和空白對照組細胞，離心后取沉淀，用培養(yǎng)液復懸，接種于96孔板，密度為2×103個/孔，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)12、24、48、72和96 h時加入20 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，采用xMark酶標儀檢測各孔吸光度（A）值。

1.5.5 細胞遷移實驗

取si-RRBP1組、si-NC組和空白對照組細胞，胰蛋白酶消化，用無血清培養(yǎng)液制備單細胞懸液，密度為2.5×105個/mL，將200 μL單細胞懸液加入Transwell小室的上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，固定，1%結晶紫染色25 min，在DP50顯微鏡下觀察，隨機取5個高倍鏡視野（按左上、左下、中央、右上、右下選擇）計數(shù)穿膜細胞數(shù)，實驗重復3次。

1.5.6 細胞侵襲實驗

用培養(yǎng)液稀釋基質膠，平鋪于Transwell小室的上室，風干備用。其余實驗步驟同“細胞遷移實驗”。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier生存曲線和Log-rankχ2檢驗評估骨肉瘤患者的生存情況。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 骨肉瘤組織和正常骨組織中RRBP1蛋白陽性表達的比較

骨肉瘤組織中RRBP1蛋白陽性表達率為74.73%（68/91），高于正常骨組織[22.22%（9/45）]（χ2=36.714，P<0.001）。見圖1。

圖1 骨肉瘤組織和正常骨組織中RRBP1蛋白表達（×200）

2.2 不同臨床病理參數(shù)的骨肉瘤患者之間RRBP1陽性表達的比較

Enneking分期ⅡB～Ⅲ期、有遠隔轉移的骨肉瘤患者RRBP1蛋白陽性率分別高于Enneking分期ⅡA期、無遠隔轉移的患者（P<0.05）。不同性別、年齡、腫瘤部位、組織學類型和腫瘤大小的骨肉瘤患者RRBP1蛋白陽性率差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 不同臨床病理參數(shù)的骨肉瘤患者之間RRBP1陽性表達的比較

2.3 RRBP1表達與骨肉瘤患者預后的關系

91例骨肉瘤患者中，有80例（87.91%）完成隨訪，隨訪時間為2～86個月。RRBP1陽性組生存率為26.23%（16/61），生存時間為（39.30±2.53）個月；RRBP1陰性組生存率為68.42%（13/19），生存時間為（57.52±4.78）個月。2個組之間生存率差異有統(tǒng)計學意義（Logrankχ2=8.647，P=0.003）。見圖2。

圖2 不同RRBP1表達的骨肉瘤患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.4 si-RRBP1組、si-NC組、空白對照組細胞和U-2OS細胞RRBP1 mRNA相對表達量比較

si-RRBP1組細胞RRBP1 mRNA相對表達量為0.25±0.07，顯著低于si-NC組（1.00±0.10）、空白對照組（1.03±0.09）細胞和U-2OS細胞（1.01±0.08）（P<0.05），si-NC組、空白對照組細胞和U-2OS細胞之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖3。

圖3 si-RRBP1組、si-NC組、空白對照組細胞和U-2OS細胞中RRBP1 mRNA相對表達量比較

2.5 si-RRBP1組、si-NC組、空白對照組細胞和U-2OS細胞RRBP1蛋白表達量比較

si-RRBP1組細胞RRBP1蛋白表達量為0.21±0.07，顯著低于si-NC組（0.84±0.07）、空白對照組（0.86±0.09）細胞和U-2OS細胞（0.90±0.05）（P<0.05）。見圖4。

圖4 4組細胞中RRBP1蛋白表達的免疫印跡法圖

2.6 si-RRBP1組、si-NC組和空白對照組細胞增殖能力比較

與si-NC組和空白對照組比較，si-RRBP1組培養(yǎng)24、48、72和96 h細胞增殖能力均降低（P<0.05）。見表2、圖5。

表2 si-RRBP1組、si-NC組和空白對照組培養(yǎng)不同時間的細胞增殖能力比較（A值）

圖5 si-RRBP1組、si-NC組和空白對照組培養(yǎng)不同時間的增殖能力比較

2.7 si-RRBP1組、si-NC組和空白對照組細胞遷移和侵襲能力比較

si-RRBP1組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均低于si-NC組和空白對照組（P<0.05）。見表3、圖6、圖7。

表3 si-RRBP1組、si-NC組和空白對照組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)比較 個

圖6 si-RRBP1組、si-NC組和空白對照組細胞侵襲能力（結晶紫染色，×200）

圖7 si-RRBP1組、si-NC組和空白對照組細胞遷移能力（結晶紫染色，×200）

3 討論

骨肉瘤是發(fā)病率最高的惡性骨腫瘤，致殘率高、致死率高，腫瘤惡性程度高，且呈局部侵襲性生長，易出現(xiàn)遠隔轉移[10-11]。RRBP1作為一種定位于內(nèi)質網(wǎng)內(nèi)，由1 410個氨基酸構成的蛋白，在新生蛋白折疊、運輸、分泌中發(fā)揮重要作用[12]。正常生理條件下，內(nèi)質網(wǎng)參與維持蛋白質穩(wěn)態(tài)，但若此過程受干擾，便會出現(xiàn)大量未折疊的蛋白，蓄積在內(nèi)質網(wǎng)內(nèi)，導致內(nèi)質網(wǎng)應激[13-14]，進一步導致未折疊蛋白反應激活[15]，導致腫瘤細胞大量增殖，引發(fā)腫瘤[16]。有研究結果顯示，RRBP1可通過調(diào)節(jié)未折疊蛋白反應激活而促進腫瘤細胞存活[17]。本研究結果顯示，骨肉瘤組織中RRBP1蛋白陽性表達率高于對照組（P<0.001），說明RRBP1蛋白在骨肉瘤組織中高表達，可能與骨肉瘤發(fā)生有關；Enneking分期ⅡB～Ⅲ期和有遠隔轉移患者的骨肉瘤組織中RRBP1蛋白陽性表達率顯著升高（P<0.05），說明RRBP1可能參與骨肉瘤惡性進展和轉移過程。

有研究發(fā)現(xiàn)，RRBP1過表達與子宮內(nèi)膜癌、膀胱癌進展和不良預后有關[18-19]，是影響結直腸癌患者預后的危險因素[20]。本研究結果顯示，與RRBP1陰性患者比較，RRBP1陽性患者生存率更低，生存時間更短，說明RRBP1蛋白陽性表達與患者生存率和生存時間相關，可能是影響患者預后的危險因素。

本研究結果顯示，與si-NC組、空白對照組細胞和U-2OS細胞比較，si-RRBP1組細胞RRBP1 mRNA和蛋白相對表達量均明顯降低（P<0.05），提示成功構建低表達的骨肉瘤細胞。有研究結果顯示，高糖可通過上調(diào)RRBP1表達促進原發(fā)性肝癌細胞增殖和轉移[21]。本研究結果顯示，si-RRBP1組細胞培養(yǎng)12、48、72和96 h時A值均明顯低于si-NC組和空白對照組（P<0.05），說明RRBP1低表達可降低骨肉瘤細胞的增殖能力，提示RRBP1可能與骨肉瘤細胞增殖過程有關。有研究證實，RRBP1與膀胱癌T24細胞的遷移和侵襲有關[22]。本研究結果顯示，抑制骨肉瘤細胞RRBP1的表達可顯著抑制細胞遷移和侵襲的能力，提示RRBP1可能參與了骨肉瘤細胞的遷移、侵襲。

綜上所述，骨肉瘤組織RRBP1蛋白高表達，且與患者預后有關。下調(diào)RRBP1表達可抑制骨肉瘤細胞的增殖活性，抑制細胞的遷移和侵襲。因此，RRBP1有望成為骨肉瘤靶向治療的新靶位，但其具體作用機制和可能的作用途徑還有待更深入的研究予以明確。