王 儀，陳秀山

（1.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟南 250014 ；2.東營天東制藥有限公司，山東 東營 257100）

近年來，受生活節(jié)奏快，工作壓力大，高脂、高鹽、高糖食物攝入量增加等因素的影響，高血糖的發(fā)病率逐漸增高[1]。高血糖可通過多種途徑損害機體健康[2-3]，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。其臨床治療方法包括改善胰島素抵抗和血糖控制[4]。肝素是一種高度硫酸化帶負電荷的非均一線性糖胺聚糖，屬于天然生物聚合物[5]。其由糖鏈的異質(zhì)混合物組成[6-7]，平均MW 為12 000 ～16 000 Da[8-9]。天然的異質(zhì)分子可引起相關(guān)結(jié)構(gòu)變化，這有利于肝素與各種蛋白質(zhì)相互作用產(chǎn)生多種生物活性[10]。研究表明，肝素具有抗病毒、抗炎、促進傷口愈合等非抗凝活性[11]。有研究[12-13]證實，肝素具有抑制血管生成的作用，其衍生物sevuparin[14]被報道對抑制惡性瘧原蟲具有輔助作用。肝素在胰島素降血糖機制中也發(fā)揮著重要作用[15]，負載氧化銅納米酶的肝素水凝膠治療糖尿病創(chuàng)面可取得顯著的療效[16]。針對肝素本身對于高血糖的影響目前臨床上尚無深入的研究，本研究采用數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)藥理學分析等方法初步探討了肝素與高血糖的聯(lián)系。

1 數(shù)據(jù)與方法

1.1 數(shù)據(jù)

使用的數(shù)據(jù)庫及平臺：SwissTargetPrediction ,Uniprot , PubChem, DrugBank, OMIM, GeneCards v5.13,Metascape , STRING v11.5, Cytoscape v3.9.1。

1.2 潛在藥物靶點篩選

在數(shù)據(jù)庫Uniprot、SwissTargetPrediction、PubChem及DrugBank 中篩選肝素鈉的潛在靶點信息，匯總靶點，去除重復(fù)項。

1.3 疾病靶點獲取

在數(shù)據(jù)庫GeneCards 和OMIM 中，以“hyperglycemia”為關(guān)鍵詞查詢疾病靶點，去除重復(fù)項，取與1.2 所得肝素鈉靶點的交集。

1.4 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

將1.3 所得成分- 疾病共同靶點導(dǎo)入STRING，選擇Homo sapiens 物種，設(shè)置medium confidence 為0.4，斷開隱藏網(wǎng)絡(luò)中連接的節(jié)點（即游離基因）。各節(jié)點的重要性使用“度值（degree）”“介數(shù)中心性(betweenness)”表示：度值和介數(shù)中心性的大小分別表示此節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中所具有的直接作用關(guān)系的多少及在網(wǎng)絡(luò)中所起的橋梁作用的情況。

1.5 基因本體（GO）功能及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

在metascape 平臺中導(dǎo)入得到的交集靶點，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，行富集分析，分析其可能的主要生物學過程與代謝通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥物干預(yù)高血糖潛在靶點

將GeneCards 及OMIN 數(shù)據(jù)庫中檢索到的疾病靶點合并去重，得到1143 個疾病相關(guān)靶點。對1143 個疾病靶點與143 個藥物靶點取交集，得到33 個肝素鈉與高血糖交集靶點。

2.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)

將33 個交集基因置入數(shù)據(jù)庫String 中，構(gòu)建了33 個節(jié)點、97 條邊、平均度值5.88 的PPI 網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape 軟件對其進行拓撲分析，見圖1a。將度值和介數(shù)中心性均大于中位值的6 個靶點確定為肝素鈉干預(yù)高血糖的潛在關(guān)鍵靶點，得出與藥物干預(yù)高血糖關(guān)系密切的蛋白主要有TLR4、HIF1A、SERPINE1、CXCR4、FGF2、MTOR 等，見表1。這表明，肝素與高血糖存在聯(lián)系，可干預(yù)高血糖的治療。

圖1 蛋白互作、GO 和KEGG 富集分析圖

表1 治療疾病重要靶點

2.3 GO 功能及KEGG 通路富集分析

使用DAVID 數(shù)據(jù)庫對31 個交集靶點進行GO 功能〔生物過程（BP）、分子功能（MF）和細胞成分（CC）〕和KEGG 通路富集分析。分析GO 的BP 20 個條目、CC 5 個條目、MF 8 個條目，發(fā)現(xiàn)肝素鈉干預(yù)高血糖可能富集在炎癥反應(yīng)、細胞遷移正調(diào)控、傷口愈合調(diào)節(jié)、細胞對有機氮化合物響應(yīng)、低氧應(yīng)答、細胞因子產(chǎn)生正調(diào)控和第二信使介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)等BP（圖1b），血小板α 粒、細胞膜筏、早期核內(nèi)體、內(nèi)吞囊泡及核斑點等CC（圖1c），肝素結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、內(nèi)肽酶活性、磷蛋白結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑活性、蛋白質(zhì)異二聚活性、以醇基為受體的磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、細胞因子受體結(jié)合等MF（圖1d）。GO 功能分析表明肝素鈉可能通過影響B(tài)P 中炎癥反應(yīng)、細胞遷移正調(diào)控、傷口愈合調(diào)節(jié)、細胞對有機氮化合物響應(yīng)、低氧應(yīng)答、細胞因子產(chǎn)生正調(diào)控和第二信使介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)等過程，CC 中血小板α 粒、細胞膜筏、早期核內(nèi)體、內(nèi)吞囊泡及核斑點等成分，MF 中肝素結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、內(nèi)肽酶活性、磷蛋白結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑活性、蛋白質(zhì)異二聚活性、以醇基為受體的磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、細胞因子受體結(jié)合等功能發(fā)揮治療作用。KEGG 通路分析顯示，基因主要富集于HIF-1 信號通路、癌癥途徑、鈣信號通路、Apelin 信號通路、鞘氨醇脂質(zhì)信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、補體和凝血級聯(lián)等通路，見圖1e。

3 討論

長期的高血糖一定程度上會損傷機體神經(jīng)、血管等器官，進而引發(fā)諸多疾病。肝素存在于細胞外基質(zhì)和循環(huán)血液中，可抗凝血，并參與機體的免疫調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)肝素對動物的葡萄糖穩(wěn)態(tài)具有重要的調(diào)節(jié)作用[17]。葡萄糖穩(wěn)態(tài)是血糖維持穩(wěn)定的重要因素，因此，本研究假設(shè)肝素可干預(yù)高血糖，并通過網(wǎng)絡(luò)藥理學技術(shù)進行預(yù)測。網(wǎng)絡(luò)藥理學預(yù)測表明，肝素鈉與高血糖有多種共同靶點，且GO 和KEGG 分析表明肝素鈉可能通過TLR4、HIF1A、SERPINE1、CXCR4、FGF2、MTOR 等蛋白及HIF-1 信號、鈣信號、Apelin 信號、鞘氨醇脂質(zhì)信號、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、補體和凝血級聯(lián)等多種調(diào)控通路影響血糖。

綜上所述，本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學初步預(yù)測得出肝素鈉可能通過作用于TLR4、HIF1A、SERPINE1、CXCR4、FGF2、MTOR 等多個關(guān)鍵靶點基因，干預(yù)炎癥反應(yīng)、細胞遷移正調(diào)控、血小板α 粒、細胞膜筏、肝素結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合及絲氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑結(jié)合等功能，調(diào)控HIF-1 信號通路、癌癥途徑、鈣信號通路、Apelin 信號通路、鞘氨醇脂質(zhì)信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、補體和凝血級聯(lián)等進程干預(yù)高血糖，其作用機制涉及多種靶點基因和信號通路。但后續(xù)仍需要進行相關(guān)實驗，以確定肝素對血糖的作用。