鄭 鵬,張 玥

(1.麗江師范高等?？茖W(xué)校,云南麗江 674100;2.滇西北高原特色農(nóng)業(yè)研究中心,云南麗江 674100)

健康的土壤是維持土壤生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能的關(guān)鍵,一個(gè)具有高生物多樣性的健康土壤一定具有較為優(yōu)良的理化性質(zhì)[1]。土壤中蘊(yùn)藏著巨大微生物多樣性,是聯(lián)系大氣圈、水圈、巖石圈及生物圈物質(zhì)與能量交換的重要紐帶,而每克土壤中,高達(dá)99%的物種及其功能尚屬未知[2]。土壤微生物多樣性可以敏感地反映土壤環(huán)境的微小變化,能夠監(jiān)測(cè)土壤質(zhì)量變化,是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要生物學(xué)指標(biāo)[3]。研究表明,微生物多樣性越高,土壤將表現(xiàn)出更多的生態(tài)功能、病蟲(chóng)害抵抗力、抗環(huán)境脅迫性和更高的作物生產(chǎn)能力[4-6]。

早在1904年,德國(guó)學(xué)者Hiltner就提出了“根際”一詞,按相關(guān)微生物提供的定植生態(tài)位特性,可細(xì)分為根際(rhizosphere)、根表(rhizoplane)和根系內(nèi)部(endorhiza),近年來(lái),根際微生物組的巨大潛力在相關(guān)的研究中得到證實(shí)[7]。了解內(nèi)生細(xì)菌多樣性有助于闡明它們的功能和潛在作用,進(jìn)而優(yōu)化植物生長(zhǎng)狀態(tài)[8]。根際微生物的群落結(jié)構(gòu)、數(shù)量變化會(huì)直接影響地上植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和水分的吸收及植物的抗逆性[9]。植物生長(zhǎng)過(guò)程中釋放20%～60%的光合產(chǎn)物,如糖、有機(jī)酸等進(jìn)入根際微域,根系分泌物在碳、氮、硫等循環(huán)中發(fā)揮重要作用,從而改變根系的釋水特性和根際土壤養(yǎng)分濃度,影響根際土壤微生物的活動(dòng),進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)[10]。研究表明,植物根系選擇性地招募特定的土壤微生物,如變形桿菌(Proteobacteria)、放線菌(Actinobacteria)等,而微生物特異性富集也取決于植物根際區(qū)系、土壤類型、營(yíng)養(yǎng)狀況和發(fā)育階段等因素[11]。

目前,國(guó)內(nèi)外研究集中在從青刺果中分離鑒定單體化合物如L-表兒茶素、β-谷甾醇-β-葡萄糖苷等[12],以及青刺果果實(shí)酚類成分和相關(guān)抗氧化特性[13-14]等方面;對(duì)青刺果根際土壤微生物多樣性相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,探究青刺果根際微生物多樣性的影響,對(duì)改善青刺果根際土壤菌群結(jié)構(gòu)及促進(jìn)青刺果生長(zhǎng)和土壤肥料的施用具有重要意義。

青刺果(PrinsepiautilisRoyle),是一種較耐旱并與滇西北少數(shù)民族共同生活了幾千年的野生植株,也是麗江市政府大力推廣退耕還林的主要樹(shù)種。青刺果又名總花扁核木,是薔薇科李亞科扁核木屬植物[15],生長(zhǎng)在海拔2 200～2 700 m中國(guó)南部和印度的北部[16],全株可以入藥,種子可榨油,是一種天然的高級(jí)食用油。目前,高通量測(cè)序已被廣泛應(yīng)用于污水、土壤和深海等復(fù)雜環(huán)境的微生物多樣性分析中[17]。高通量測(cè)序技術(shù)不需要分離培養(yǎng),直接從DNA層面進(jìn)行種群組成分析,并可提供更加豐富的細(xì)菌多樣性相關(guān)信息[18],因而,高通量測(cè)序已被越來(lái)越多地應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)及群體多樣性分析中。

探究植物根際微生物群落特征及微生物多樣性分析,有助于能夠準(zhǔn)確掌握植物根際土壤微生物群落豐度及微生物群落多樣性水平上的變化。筆者以青刺果為研究對(duì)象,采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)青刺果根際與非根際土壤內(nèi)生細(xì)菌菌群豐度、多樣性及潛在功能進(jìn)行深入全面分析,為全面揭示野生生境青刺果根際與非根際土壤內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異、功能菌株的挖掘和對(duì)環(huán)境條件變化引起的土壤細(xì)菌菌落動(dòng)態(tài)變化提供參考,并為今后人工大面積栽培青刺果植株土傳病害、優(yōu)化植株生長(zhǎng)及土壤生態(tài)系統(tǒng)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集2021年1月11日,于云南省麗江市(100°20′E,26°53′N,海拔2 686 m),選擇青刺果子房膨大期采樣,隨機(jī)選擇3株,分別采集青刺果根際土壤和非根際土壤,共采取土樣6份帶回實(shí)驗(yàn)室,獲得2組平行樣品(非根際土壤與根際土壤),編號(hào)分別為A組、B組。

青刺果根際、非根際土壤采集方法采用吳秋芳等[19]的方法。挖取青刺果植株根系,抖動(dòng)根部松散系土壤,用消毒的刷子收集粘在青刺果根際的土壤至2 mL離心管中,視為青刺果根際土壤樣品;而非根際土壤為距離青刺果根系表面5～10 cm范圍內(nèi)5～20 cm的土壤;裝入無(wú)菌袋中,過(guò)100目篩,于-80 ℃中保存。

1.2 土壤樣品基因組DNA提取及16S rRNA擴(kuò)增測(cè)序土壤樣品微生物群落DNA提取采用NucleoSpin Soil kit(Macherey-Nagel,Germany)試劑盒;用qubit?dsDNA BR(Invitrogen,USA)及 qubit?熒光計(jì),檢測(cè)其濃度和純度。測(cè)序靶標(biāo)DNA為16S rRNA基因V3～V4可變區(qū),所用引物為341F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG- 3′)和806R(5′ -GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′)。正反向引物標(biāo)記有Illumina adapter序列。取質(zhì)量合格的基因組DNA樣品30 ng及對(duì)應(yīng)的融合引物配制PCR反應(yīng)體系(50 uL)。PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 3 min,94 ℃ 30 s,56 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s,30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min。使用Agencourt AMPure XP磁珠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化并溶于Elution Buffer,貼上標(biāo)簽,完成建庫(kù)。使用Agilent 2100 Bioanalyzer對(duì)文庫(kù)的片段范圍及濃度進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)合格的文庫(kù)根據(jù)插入片段大小,選擇HiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。以上工作由華大基因科技有限公司(武漢分公司)完成。

1.3 數(shù)據(jù)分析將能匹配到引物的reads,用軟件cutadapt v2.6截取掉引物和接頭污染,得到目標(biāo)區(qū)域片段;采用按窗口去低質(zhì)量的方法:設(shè)置25 bp為窗口長(zhǎng)度,如果窗口平均質(zhì)量值低于20,從窗口開(kāi)始截除read末端序列,移除最終read長(zhǎng)度低于原始read長(zhǎng)度75%的read。去除含N的reads;去除低復(fù)雜度的reads(連續(xù)10個(gè)ATCG),最終得到Cleandata。序列拼接使用軟件FLASH(Fast length Adjustment of short reads,V1.2.11),質(zhì)控指標(biāo)(最小匹配長(zhǎng)度15 bp;重疊區(qū)域允許錯(cuò)配率為0.1)利用重疊關(guān)系將雙末端測(cè)序得到的成對(duì)reads組裝成一條序列,得到高變區(qū)的Tags。利用軟件USEARCH(v7.0.1090_i86linux32)將拼接好的Tags按照97%序列相似性聚類生成OTU。得到OTU代表序列后,通過(guò)RDP classifer(1.9.1)軟件將OTU代表序列與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行物種注釋,置信度閾值設(shè)置為0.6,對(duì)注釋結(jié)果進(jìn)行如下過(guò)濾:去除沒(méi)有注釋結(jié)果的OTU;去除注釋結(jié)果不屬于分析項(xiàng)目中的物種。最終采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析,并在界門(mén)綱目科屬種水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤細(xì)菌高通量測(cè)序結(jié)果青刺果非根際土壤樣本測(cè)序共獲得148 148×2條,質(zhì)控后得到139 238條高質(zhì)量的clean reads,拼接為75 960條Tag;根際土壤樣本測(cè)序共獲得221 696×2條,質(zhì)控后得到208 306條高質(zhì)量的clean reads,拼接為118 738條Tag。由表1可知,按照97%序列相似性聚類生成OTU,非根際土壤樣本共獲得4 102個(gè)OTU;根際土壤樣本共獲得6 197個(gè)OTU。

2.2 根際與非根際土壤樣品細(xì)菌菌群的α多樣性分析由表1可知,從Coverage指數(shù)來(lái)看,數(shù)值都在94%以上,說(shuō)明本次測(cè)序結(jié)果代表了樣本的真實(shí)情況和樣本物種的多樣性,基本能反映樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成,數(shù)據(jù)可靠。樣品B中Shannon指數(shù)、Chao指數(shù)、ACE指數(shù)都高于樣本A組,反映出B組樣品細(xì)菌數(shù)量、物種數(shù)和均勻度高于A組;simpson指數(shù)表明A組細(xì)菌多樣性高于B組,且兩組樣品差異不顯著。

表1 不同樣品OTU值和α多樣性指數(shù)Table 1 OTU and alpha diversity index of different samples

韋恩圖可以展示多樣品共有和特有的OTU數(shù)目,可直觀展示樣品間OTU的重疊情況,從而可以反映出樣品間相似性和重疊情況。從韋恩圖(圖1)可以看出,青刺果非根際土壤細(xì)菌菌群與根際土壤細(xì)菌菌群共有的OTU數(shù)量為2 201個(gè);A組(非根際土壤)特有的OTU數(shù)為98個(gè);B組(根際土壤)特有的OTU數(shù)為184個(gè)。B組特有的OTU值明顯多于A組,表明青刺果根際土壤細(xì)菌菌群豐度大于非根際土壤細(xì)菌菌群豐度。

圖1 青刺果非根際、根際土壤細(xì)菌菌群OTU韋恩分布Fig.1 Venn diagram of OTU distribution of bacterial flora in rhizosphere and nonrhizosphere soil from Prinsepia utilis Royle

2.3 青刺果土壤細(xì)菌群落組成及差異分析

2.3.1基于門(mén)水平上的非根際與根際土壤細(xì)菌群落組成比較。在門(mén)分類水平上,青刺果非根際與根際土壤細(xì)菌歸類到11個(gè)門(mén)(圖2)。其中非根際土壤細(xì)菌相對(duì)豐度大于1%的門(mén)有8個(gè),分別為Actinobacteria(放線菌門(mén))、Nitrospirae(硝化螺旋菌門(mén))、Proteobacteria(變形菌門(mén))、Acidobacteria(酸桿菌門(mén))、Chloroflexi(綠彎菌門(mén))、Gemmatimonadetes(芽單孢菌門(mén))、Cyanobacteria(藍(lán)細(xì)菌門(mén))、Bacteroidetes(擬桿菌門(mén)),分別占土壤細(xì)菌總序列的12.8%、1.2%、33.8%、27.1%、4%、3.1%、1.1%和4.5%。根際土壤細(xì)菌相對(duì)豐度大于1%的門(mén)也有8個(gè),分別為Actinobacteria(放線菌門(mén))、Proteobacteria(變形菌門(mén))、Acidobacteria(酸桿菌門(mén))、Chloroflexi(綠彎菌門(mén))、Gemmatimonadetes(芽單孢菌門(mén))、Cyanobacteria(藍(lán)細(xì)菌門(mén))、Bacteroidetes(擬桿菌門(mén))、Candidatus_Saccharibacteria,分別占土壤細(xì)菌總序列的14.4%、34.4%、22.5%、3.4%、2.2%、7%、4.8%和1.2%。A組與B組共有的菌門(mén),豐度占比最大的是Proteobacteria(變形菌門(mén)),分別占非根際、根際土壤內(nèi)生細(xì)菌總序列的33.8%、34.4%;其次是Acidobacteria(酸桿菌門(mén)),分別占27.1%、22.5%;Actinobacteria(放線菌門(mén))分別占12.8%、14.4%。另外,A組中Cyanobacteria(藍(lán)藻細(xì)菌門(mén))1.1%豐度明顯低于B組7%;Nitrospirae(硝化螺旋菌門(mén))在A組中豐度>1%,而B(niǎo)組中豐度<1%;Candidatus_Saccharibacteria在B組中豐度>1%,而A組中豐度<1%。;A組和B組其他菌門(mén)無(wú)顯著差異。

2.3.2基于綱水平上的非根際與根際土壤細(xì)菌群落組成比較。由圖3可知,在綱分類水平上,按照豐度>1%,青刺果根際與非根際土壤內(nèi)生細(xì)菌共有10個(gè)優(yōu)勢(shì)菌綱:Cytophagia(噬纖維菌綱)、Acidobacteria(酸桿菌綱)、Anaerolineae(厭氧繩菌綱)、Alphaproteobacteria(α-變形菌綱)、Betaproteobacteria(β-變形菌綱)、Gemmatimonadetes(芽單孢菌綱)、Actinobacteria(放線菌綱)、Sphingobacteriia(鞘脂桿菌綱)、Gammaproteobacteria(γ-變形桿菌綱)、Deltaproteobacteria(δ-變形菌綱)。其中,B組特有的菌綱為Deinococci(異常球菌綱)、Elusimicrobia、Fibrobacteria(纖維桿菌綱),但其相對(duì)豐度<0.1%。A組特有的菌綱為Negativicutes(厭氧菌綱),相對(duì)豐度<0.1%。

圖3 綱分類水平上細(xì)菌菌落豐度分布Fig.3 Abundance of bacterial community at the class level

2.3.3基于屬水平上的非根際與根際土壤細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)組成。在屬分類水平上,青刺果根際土壤細(xì)菌與非根際土壤細(xì)菌共有110個(gè)屬,相對(duì)豐度位居前30的土壤細(xì)菌菌群組分分析結(jié)果顯示(圖4),A組中相對(duì)豐度大于1%的青刺果非根際土壤細(xì)菌有9個(gè)屬:Gp6(13.6%)、消化螺菌屬Nitrospira(1.2%)、Aridibacter(1.2%)、Gpl(1.1%)、鞘脂單孢菌屬Sphingomonas(2.6%)、Gp4(4.9%)、Gp16(1.5%)、Gp3(1.8%)、芽單孢菌屬Gemmatimonas(3.1%);B組中相對(duì)豐度大于1%的青刺果根際土壤細(xì)菌有13個(gè)屬:Gp6(11.5%)、新鞘脂菌屬Novosphingobium(1.0%)、Saccharibacteria(1.2%)、Chryseolinea(1.1%)、節(jié)桿菌屬Arthrobater(1.3%)、Gpl(7.0%)、鞘脂單孢菌屬Sphingomonas(2.2%)、Gp4(4.3%)、Gp16(1.0%)、Gp10(1.0%)、Gp3(1.2%)、芽單孢菌屬Gemmatimonas(2.2%)、鏈霉菌屬Streptomyces(1.6%)。其中,A組與B組中細(xì)菌豐度占比最高的是Gp6,分別占13.6%、11.5%。以上結(jié)果顯示,青刺果非根際土壤細(xì)菌與根際土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬組成非常相似,除B組中Gpl(7.0%)豐度值高于A組Gpl(1.1%)外,其他菌屬在青刺果非根際與根際土壤細(xì)菌菌群豐度差異不顯著。

2.3.4樣品間細(xì)菌LEfSe聚類分析。LEfSe聚類樹(shù)分析,是一種用于發(fā)現(xiàn)和解釋高緯度數(shù)據(jù)生物標(biāo)識(shí)的分析工具,可以實(shí)現(xiàn)分組之間的比較,從而了解不同組之間微生物菌群在豐度上有顯著差異的物種(biomaker)。青刺果土壤細(xì)菌樣品A組與B組LEfSe聚類分析結(jié)果顯示(圖5),與B組相比,A組中Negativicutes(LDA 4.432,P值0.036 9<0.05)、selenomonadales(LDA 4.432,P值0.036 9<0.05)、鞘氨醇單孢菌屬Sphingomonas(LDA 3.873,P值0.049 5<0.05)為起到重要作用的微生物類群,豐度上存在顯著差異。其余綠色著色差異物種Biomarker為B組中起到重要作用的細(xì)菌類群,其豐度與A組相比也有顯著差異(P<0.05)。著色黃色的為無(wú)顯著差異細(xì)菌類群。

2.3.5青刺果根際與非根際土壤微生物功能基因預(yù)測(cè)分析?；贙EGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了功能預(yù)測(cè)(圖6),在一級(jí)功能層面共獲得6類生物代謝功能,為遺傳信息處理(genetic information processing)、人類疾病(human diseases)、代謝(metabolism)、有機(jī)系統(tǒng)(organismal systems)、環(huán)境信息處理(environmental information processing)和細(xì)胞過(guò)程(cellular processes)。其中,遺傳信息處理、代謝和細(xì)胞過(guò)程是一級(jí)功能中重要的部分,分別占11.4%、82.0%、3.6%。

在二級(jí)功能層面進(jìn)行預(yù)測(cè)基因分析(圖7),發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌菌落主要涉及到輔助因子和維生素的代謝(metabolism of cofactors and vitamins)、碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)、萜類化合物和聚酮類化合物的代謝(Metabolism of terpenoids and polyketides)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)(cell motility)、氨基酸代謝(Amino acid metabolism)、脂質(zhì)代謝(Lipid metabolism)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(signal transduction)等27個(gè)功能。

圖7 基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)二級(jí)功能層預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.7 Predicted results of secondary function layer based on KEGG database

3 討論

青刺果是我國(guó)寶貴的民族野生油料作物資源,也是麗江市政府大力推廣的退耕還林重要樹(shù)種。青刺果耐寒、耐旱能力強(qiáng),全株可入藥,具有極高的開(kāi)發(fā)和利用價(jià)值,特別是對(duì)高血壓、高血脂、心腦血管疾病等都有很好的預(yù)防效果;青刺果油富含維生素且脂肪酸組成與人體脂肪酸的構(gòu)成相似,利于人體的吸收和利用,是一種高級(jí)食用油[20-21]。青刺果一直以來(lái)是滇西北少數(shù)民族地區(qū)重要的油料經(jīng)濟(jì)作物,麗江納西族人民食用及外用青刺果尖、果已經(jīng)有幾千年的歷史,但目前對(duì)青刺果植株種植技術(shù)、肥料施用技術(shù)、微生物多樣性等研究方面還存在空白。因此,開(kāi)展野生青刺果土壤微生物研究意義重大,可為今后青刺果土壤生態(tài)系統(tǒng)改良、優(yōu)化植物生長(zhǎng)狀態(tài)、施肥和病蟲(chóng)害防控等提供重要參考。

該研究首次利用高通量測(cè)序?qū)σ吧城啻坦歉H與根際土壤細(xì)菌16S rRNA基因序列進(jìn)行分析,從青刺果非根際土壤樣本共獲得4 102個(gè)OTU;根際土壤樣本共獲得6 197個(gè)OTU。通過(guò)α多樣性分析,并結(jié)合維恩圖進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)青刺果根際土壤細(xì)菌菌群豐度大于非根際土壤細(xì)菌菌群豐度,這與以往研究結(jié)果相似[22-23]。其原因主要是,根際土壤中養(yǎng)分高于非根際土壤,植物根系不斷向土壤中分泌大量的有機(jī)物質(zhì),從而形成“根際沉積”,這些“根際沉積”作為聯(lián)系植物、土壤、微生物的橋梁,發(fā)揮著非常重要的作用,為根際微生物的活動(dòng)提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),而土壤微生物可借助趨化感應(yīng),向含有根系分泌物的根表面進(jìn)行活動(dòng)[24],因此,“根際沉積”影響了根際微生物群落的結(jié)構(gòu)與功能,該沉積過(guò)程,也造成了植物根際與無(wú)植物土壤在物理、化學(xué)等特性的差異[25]。當(dāng)然,土壤類型也是影響根際微生物群落原始結(jié)構(gòu)重要因素之一,不同類型的土壤決定了根際微生物區(qū)系最初的狀態(tài),研究表明,土壤類型是影響根際細(xì)菌和菌根真菌群落結(jié)構(gòu)最重要的因素[26]。土壤中的細(xì)菌也可以通過(guò)植物開(kāi)放性結(jié)構(gòu)進(jìn)入植物組織細(xì)胞內(nèi),并能夠促使其形成具有生態(tài)功能的群落[27]。

該研究結(jié)果也顯示,在門(mén)分類水平上,青刺果非根際與根際土壤細(xì)菌歸類到11個(gè)門(mén)。優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為Actinobacteria(放線菌門(mén))、Proteobacteria(變形菌門(mén))、Acidobacteria(酸桿菌門(mén))。其中,Proteobacteria(變形菌門(mén))豐度最高,這與許多研究類似。王橋美等[28]研究普洱地區(qū)茶葉根際土壤細(xì)菌中豐度較高的是變形菌門(mén)(Proteobacteria),張玲豫等[29]研究河西走廊沙地蘆葦根際土壤微生物群落中,變形菌門(mén)(Proteobacteria)在4種沙地類型中的相對(duì)豐度最高,吳秋芳等[19]研究北艾根際與非根際土壤微生物多樣性中,從細(xì)菌組成分析,2種土壤細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)門(mén)均為變形菌門(mén)(Proteobacteria)。此外,除在土壤中變形菌門(mén)(Proteobacteria)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)外,變形菌門(mén)(Proteobacteria)在植物體內(nèi)也存在優(yōu)勢(shì)。楊多等[30]研究表明胡楊葉片優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門(mén)(Proteobacteria),藍(lán)柏成等[31]研究降香黃檀內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)及多樣性,其心材優(yōu)勢(shì)菌為變形菌門(mén)和藍(lán)細(xì)菌門(mén)。 該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在門(mén)分類水平上,青刺果根際與非根際土壤細(xì)菌菌群豐度具有差異性,但差異不顯著。在綱分類水平上,青刺果根際與非根際土壤內(nèi)生細(xì)菌共有10個(gè)優(yōu)勢(shì)菌綱;但根際土壤細(xì)菌特有的菌綱為Deinococci(異常球菌綱)、Elusimicrobia、Fibrobacteria(纖維桿菌綱);非根際土壤細(xì)菌特有的菌綱為Negativicutes(厭氧菌綱),說(shuō)明植物根系的生長(zhǎng)以及從外界環(huán)境吸收養(yǎng)分與水分需要氧氣,因此,在根際土壤細(xì)菌中尚未檢測(cè)到厭氧菌綱。在屬水平上,酸桿菌屬(Acidobacterium)總豐度最高,為優(yōu)勢(shì)屬;其次豐度較高的屬為消化螺菌屬Nitrospira、Aridibacter、鞘脂單孢菌屬Sphingomonas、芽單孢菌屬Gemmatimonas、新鞘脂菌屬Novosphingobium、Saccharibacteria、Chryseolinea、節(jié)桿菌屬Arthrobater、鏈霉菌屬Streptomyces。在土壤中,酸桿菌屬細(xì)菌是土壤微生物的重要組成成員,數(shù)量占細(xì)菌總量的20%左右[32],其在土壤物質(zhì)循環(huán)和生態(tài)環(huán)境的構(gòu)建中起著非常重要的作用[33]。另外,酸桿菌相對(duì)豐度隨海拔呈單峰變化,即低海拔和高海拔多樣性高于中海拔,這與該研究結(jié)果基本一致[34]。目前基于16S rDNA序列分析,酸桿菌門(mén)細(xì)菌被劃分為26個(gè)亞群(GP1～GP26),該研究經(jīng)高通量測(cè)序到的酸桿菌亞群有GP1、GP3、GP4、GP6、GP7、GP10、GP16和GP17,其余亞群并未檢測(cè)到。同時(shí),該研究還檢測(cè)到鏈霉菌屬Streptomyces,豐度也較高,為核心屬;鏈霉菌一直以來(lái)都是醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等研究的熱點(diǎn),且多數(shù)為非致病菌,該菌株能夠產(chǎn)生抗腫瘤、抗蟲(chóng)、抗病毒等活性代謝物,是人類開(kāi)發(fā)新藥的重要代謝物來(lái)源[35]。

通過(guò)LEfSe聚類樹(shù)分析,發(fā)現(xiàn)A組中起到重要作用的細(xì)菌類群biomaker明顯少于B組,說(shuō)明B組(根際土壤細(xì)菌)細(xì)菌菌群豐度高于A組(非根際土壤細(xì)菌),為極顯著差異。根際土壤細(xì)菌與非根際土壤細(xì)菌的差異,主要是因?yàn)橹参锿ㄟ^(guò)根系活動(dòng)改變根際土壤的養(yǎng)分含量和土壤理化性質(zhì),從而改變了根際微生物群落組成,根系微生物能夠利用“根際沉積”效應(yīng)將土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解,轉(zhuǎn)化為植物可吸收的狀態(tài),促進(jìn)植物生長(zhǎng)同時(shí)提高自身的抗逆性,最終導(dǎo)致根際與非根際土壤微生物群落組成和多樣性的差異[36]。此外,微生物群落的活動(dòng)變化與植物生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān),特別是根系有益菌群能夠促進(jìn)植物根系對(duì)氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素的吸收,從而增強(qiáng)植物對(duì)生物及非生物抵御的能力[37]。

該研究進(jìn)一步對(duì)基因功能預(yù)測(cè)分析,在一級(jí)功能層面共獲得6類生物代謝功能,即遺傳信息處理、人類疾病、代謝、有機(jī)系統(tǒng)、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過(guò)程;在二級(jí)功能層面上,主要涉及輔助因子和維生素代謝、碳水化合物代謝、萜類化合物和聚酮類化合物代謝、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制等27個(gè)二級(jí)功能,以上結(jié)構(gòu)提示人們作為涼拌而食用的青刺果莖尖、用果進(jìn)行榨油,其植株體內(nèi)可能含有的微生物會(huì)對(duì)人類健康存在潛在威脅。同時(shí)也提示土壤微生物與植株存在相關(guān)物質(zhì)和能量的交流。值得一提的是,基因功能預(yù)測(cè)也提示青刺果根際與非根際土壤內(nèi)生細(xì)菌表現(xiàn)出較高的萜類化合物、聚酮類化合物活性物質(zhì),這表明青刺果土壤內(nèi)生細(xì)菌在抗菌、抗腫瘤、抗癌等菌株篩選方面值得關(guān)注。

綜上,野生生境青刺果根際與非根際土壤細(xì)菌的菌群組成及豐度具有一定的差異,青刺果體內(nèi)同樣也存在多樣的內(nèi)生細(xì)菌,這些青刺果體內(nèi)內(nèi)生細(xì)菌是否與野生生境青刺果根際土壤存在一定的關(guān)聯(lián),還需要進(jìn)一步研究。此外,通過(guò)基因功能預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)野生生境下的青刺果根際土壤細(xì)菌的代謝物可能對(duì)經(jīng)常食用青刺果嫩葉和青刺果油的納西族人民的健康存在潛在風(fēng)險(xiǎn),這需要關(guān)注?？傊?該研究只是針對(duì)生長(zhǎng)在野生環(huán)境條件下青刺果根際與非根際土壤細(xì)菌進(jìn)行了初步研究,對(duì)青刺果生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用細(xì)菌的分離及鑒定將是下一步要開(kāi)展的工作。