王文杰,陳博錦,姜欣彤,顧祎鑫,張 正,魏艷超,王 偉

(大連海洋大學遼寧省北方魚類應用生物學與增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧大連 116023)

氧氟沙星(Ofloxacin)屬于第三代喹諾酮類抗生素,自1981年研發(fā)成功后,因其抗菌譜廣、殺菌能力強、毒副作用少等優(yōu)點被廣泛應用于水產養(yǎng)殖領域。隨著氧氟沙星一類抗生素的廣泛使用,廢水中許多殘留抗生素流入到環(huán)境中,通過對環(huán)境的非目標性效應使生態(tài)系統(tǒng)受到破壞[1]。盡管在2015年農業(yè)部第2292號文件規(guī)定,停止包含氧氟沙星在內的多種獸藥在食品動物飼養(yǎng)中的使用。但在全球環(huán)境中仍有很多廢水中存在氧氟沙星殘留,如醫(yī)療廢水、處理廠廢水和制藥廠廢水等。其中的抗生素殘留依舊會對水生生物乃至人類產生影響。

黃蓋鰈(Pseudopleuronectesyokohamae)俗名小嘴、黃蓋等,屬于鰈形目(Pleuronectiformes)鰈科(Pleuronectidae)黃蓋鰈屬(Pseudopleuronecte),主要分布在太平洋西部海岸國家,在我國主要分布在東海、黃海、渤海,因其肉質鮮美,已經成為我國北方價值較高的經濟物種之一[2]。

有學者使用達氟沙星對施氏鱘(Acipenserscherensckii)進行口灌,連續(xù)20 d,結果會對其肝臟中超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性造成影響;陳旭等[3]發(fā)現(xiàn)恩諾沙星對卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)幼魚肝臟和后腎的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶存在顯著(P<0.05)的誘導作用,并與藥物濃度及作用時間有關;鯽(Carassiusauratus)在恩諾沙星的暴露下會引起酶活性的變化,并與暴露濃度和暴露時間有一定的相關性。 同樣的結果也在探究氧氟沙星對錦鯉(Cyprinuscarpio)體內超氧化物歧化酶和丙二醛的影響探究中得到證實。以上相關研究表明,喹諾酮類抗生素的使用會對水生生物抗氧化酶的活性造成影響[4]。這些抗生素不僅會對魚體造成損害,當人體攝入這些含有抗生素殘留的水產品時,由于抗生素在人體內代謝緩慢,其在人體的長期蓄積可能會引起人體關節(jié)或軟骨損傷、泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等疾病[5]。

該試驗研究不同濃度氧氟沙星的慢性脅迫下,黃蓋鰈肌肉、鰓和肝臟組織中SOD、CAT活性和MDA含量變化,探究不同濃度氧氟沙星對黃蓋鰈機體氧化應激狀態(tài)的影響,以期指導生產一線開展健康養(yǎng)殖。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚試驗用黃蓋鰈全部取自大連顥霖水產有限公司,規(guī)格為平均體長(90.70 ±8.23)mm、平均體重(30.15±6.43)g的健康個體,試驗前在實驗室以24 h連續(xù)曝氣的條件下暫養(yǎng)于200 L水箱7 d,暫養(yǎng)期間不進行投食以排空黃蓋鰈體內食物殘渣。

1.2 試驗試劑超氧化物歧化酶等試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。其余試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1濃度設計及分組。試驗設3個處理組(氧氟沙星濃度分別為0.6、6.0和60.0 mg/L)和1個空白對照組。每個試驗組設3次重復,每個平行組放10尾黃蓋鰈,水體60.0 L。

1.3.2日常管理。試驗共進行30 d,每天投喂1次;換水時按比例補充氧氟沙星藥液。試驗用水為近海沙濾海水,保持水溫溫度為(10.0±1.0) ℃,水體pH為8.0±0.5,溶解氧為(9.0±1.0)mg/L。

1.3.3樣品收集及前處理。試驗結束后,使用丁香酚(75 mg/L)進行麻醉,置于冰盤上進行解剖。取黃蓋鰈肌肉組織、鰓組織和肝臟組織,與生理鹽水以1∶9的比例制成10%勻漿液,在4 ℃下12 000 r/min離心10 min后,待測。

1.3.4生長指標。試驗開始前后測量試驗用魚個體質量,記錄魚體個數(shù)用于生長指標計算。

RWG=(Wf-Wi)/Wi

RSG=(lnWf-lnWi)/d

式中:RWG為增重率,%;RSG為特定增長率,%;Wf為末體質量,g;Wi為初體質量,g;d為試驗周期,30 d。

1.3.5酶活性的測定。SOD與CAT活性及MDA含量的測定均按照試劑盒說明書的方法進行。

SOD單位的定義:該反應體系中SOD抑制率達50%時所對應的酶量為1個SOD活力單位,U/mg。

CAT單位的定義:該反應中每毫克蛋白每秒分解1 μmol的H2O2的量為1個活力單位,U/mg。

MDA單位定義:該反應中每毫克蛋白中所含的MDA含量,單位nmol/mg。

1.3.6氧氟沙星殘留測定。試驗結束后收集試驗水樣,并與解剖得到的肌肉組織、鰓組織和肝臟組織一同使用高效液相色譜法測定氧氟沙星含量。

1.3.7數(shù)據(jù)處理。試驗所得數(shù)據(jù)使用IBM SPSS Statistics 19軟件進行單因素ANOVA分析,使用Origin 2019b軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 氧氟沙星含量測試結果由表1可知,隨著試驗組設計的氧氟沙星濃度的升高,水樣樣品中的氧氟沙星濃度也逐漸升高,60.0 mg/L濃度組的結果與其他3個組間差異顯著(P<0.05)。肌肉組織、鰓組織和肝臟組織中氧氟沙星含量均隨著各個試驗組氧氟沙星濃度的升高而升高,各組間差異顯著(P<0.05)。

2.2 不同氧氟沙星濃度脅迫下黃蓋鰈的生長指標如表2所示,不同水平氧氟沙星添加量對黃蓋鰈的增重率和特定生長率均無顯著影響(P>0.05)。增重率在0.6 mg/L試驗組中最高,然后隨著氧氟沙星添加量的增加逐漸降低。特定生長率空白對照組最高,隨著氧氟沙星添加量的增加逐漸降低。

表2 不同水平氧氟沙星添加量對生長指標的影響Table 2 Effects of ofloxacin supplementation at different levels on growth indexes

2.3 不同濃度氧氟沙星對肌肉組織SOD、CAT活性和MDA含量的影響如圖1所示,在黃蓋鰈肌肉組織中,SOD和CAT活性均在空白對照組最高,在海水中氧氟沙星濃度60.0 mg/L時最低(P<0.05),隨著海水中氧氟沙星濃度的升高2種酶的活性呈逐漸降低的趨勢。MDA含量在空白對照組時最低,在海水中氧氟沙星濃度60.0 mg/L時最高(P<0.05),隨著海水中氧氟沙星濃度的升高,黃蓋鰈肌肉組織中MDA含量呈逐漸升高的趨勢。

2.4 不同濃度氧氟沙星對鰓SOD、CAT活性和MDA含量的影響圖2表明,在黃蓋鰈鰓中,SOD和CAT活性均在空白對照組最低,在海水中氧氟沙星濃度60.0 mg/L時最高(P<0.05),隨著海水中氧氟沙星濃度的升高兩種酶的活性總體呈逐漸升高的趨勢。MDA含量在空白對照組時最低,在海水中氧氟沙星濃度60.0 mg/L時最高(P<0.05),隨著海水中氧氟沙星濃度的升高,黃蓋鰈鰓組織中MDA含量呈逐漸升高的趨勢。

注:不同小寫字母表示不同處理組間顯著差異(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate significant difference between different treatment groups (P<0.05).圖2 鰓組織中SOD、CAT活性及MDA含量Fig.2 SOD and CAT activities and MDA content in gills tissue

2.5 不同濃度氧氟沙星對肝臟組織SOD、CAT活性和MDA含量的影響圖3表明,在黃蓋鰈肝臟組織中,SOD活性在空白對照組時最低,在海水中氧氟沙星濃度為0.6 mg/L時含量最高,各組間差異顯著(P<0.05)。CAT活性和MDA含量均在空白對照組最低,在海水中氧氟沙星濃度60.0 mg/L時最高(P<0.05)。

注:不同小寫字母表示不同處理組間顯著差異(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate significant difference between different treatment groups (P<0.05).圖3 肝臟組織中SOD、CAT活性及MDA含量Fig.3 SOD and CAT activities and MDA content in liver tissue

3 討論

3.1 環(huán)境因子喹諾酮類抗生素一直以來是水產養(yǎng)殖業(yè)較常見的抗菌藥,主要功能就是通過干擾DNA超螺旋結構的解旋阻礙DNA的復制,從而干擾細菌正常的生理活動。當氧氟沙星作為環(huán)境因子進入魚體后可以形成多種中間產物,其中許多可以再進入氧化循環(huán)產生危害性更大的中間代謝產物,同時伴隨產生大量活性氧離子(ROS),主要包括超氧陰離子(O2·-)、羥自由基(·OH)和過氧化氫(H2O2)等。此時機體的抗氧化防御系統(tǒng)被激活,系統(tǒng)內的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)的活性增強,以清除多余ROS[6]。但是熊鏵龍等[7-8]指出,喹諾酮類漁藥使用后,對魚類抗氧化系統(tǒng)中的SOD、CAT等諸多酶類均存在先誘導后抑制的效應。在該試驗中,由于不同組織對于這種環(huán)境因子的刺激耐受度不盡相同,所以不同組織中的氧化應激酶活性變化也不同。

已有研究表明,氧氟沙星在水體中存在一個光化學轉化的現(xiàn)象,這種光化學轉化會造成氧氟沙星在海水中的光解現(xiàn)象,造成氧氟沙星含量的降低[8]。同時申立娜等[9]研究指出,喹諾酮類抗生素具有較強的吸附能力,可以與水中的有機質發(fā)生吸附沉降,進而使水環(huán)境中的氧氟沙星濃度降低,最終使魚體的富集減少。

該研究表明,水樣中的氧氟沙星濃度雖與試驗組設定的濃度不一致,但濃度的確按照試驗設計梯度存在差異,所以認為濃度梯度的設定是有效的。在自然水體中人為導致的氧氟沙星類抗生素的增加,也同樣存在一定的光解和沉降現(xiàn)象。該研究結果表明,在不同濃度氧氟沙星海水中生活的黃蓋鰈,其體內的肌肉組織、鰓組織和肝臟組織中存在不同程度的氧氟沙星富集現(xiàn)象,這可能是造成黃蓋鰈器官損傷的原因之一。

3.2 超氧化物歧化酶(SOD)正常狀態(tài)下,體內的ROS不斷生成也不斷被消耗,處于一個動態(tài)平衡的狀態(tài)。SOD是機體抗氧化防御系統(tǒng)抵抗外界環(huán)境因子變化的第一道防線,它可以直接將體內的O2·-歧化為H2O2和O2[10]。該試驗發(fā)現(xiàn),在黃蓋鰈的鰓組織中,當氧氟沙星濃度增加到60.0 mg/L時其SOD活性顯著提高(P<0.05)。其原因可能是對于鰓組織而言,海水中氧氟沙星濃度變化從0.6 mg/L升高到6.0 mg/L時尚未達到SOD酶活性顯著改變的閾值。鰓組織是魚體直接與外部水體環(huán)境接觸的器官,故其抗逆性比較強,但隨著環(huán)境中氧氟沙星含量的加大,組織機體抗氧化活動也在加強,SOD活性會出現(xiàn)代償性增強[11]。當生物體受到環(huán)境輕度脅迫時,SOD活性往往升高,當出現(xiàn)SOD活性降低的情況,則說明體內已經積累過量的ROS導致生物體出現(xiàn)損傷,已經影響到了體內SOD的正常工作[7]。從試驗結果來看,黃蓋鰈肌肉組織中SOD活性水平隨著海水中氧氟沙星濃度的不斷升高呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢,說明隨著海水中氧氟沙星濃度的增加已經逐漸對黃蓋鰈的肌肉組織造成損害,且這種損害呈現(xiàn)劑量效應。

李紹戊等[11]在有關恩諾沙星對小體鱘(AcipenserruthenusLinnaeus)及史氏鱘(AcipenserschrenckiiBrandt)研究結果中指出,造成SOD升高和降低的本質原因可能是,機體在受到環(huán)境刺激時,ROS誘導體內抗氧化酶活力的增強與ROS對組織細胞的直接損傷,從而引起抗氧化酶活力的下降。當機體受到氧化應激刺激時SOD活性的高低變化取決于這兩個過程哪一個占據(jù)了主導地位;肝臟是魚體內重要的解毒器官,肝臟內相關的作用的酶類較多,其酶活敏感性整體高于肌肉和鰓組織;張彬彬[12]在對鯽魚(Carassiusauratus)肝臟內膜系統(tǒng)的超氧化物歧化酶研究中也曾指出,當機體受到脅迫產生大量的ROS超出機體自身清除能力時,會表現(xiàn)出SOD活性受到一定抑制的結果。在該試驗中,通過黃蓋鰈肝臟組織中SOD水平變化看出,當海水中氧氟沙星濃度在0.6 mg/L時,SOD活性顯著升高, ROS誘導抗氧化酶活性增高的過程占據(jù)主導地位,此時對肝臟組織損傷程度較輕;當濃度增加到6.0 mg/L后SOD活性又顯著降低,這時ROS對細胞的損傷和抗氧化酶活性的影響占據(jù)主導,海水中氧氟沙星濃度已經逐漸超出了肝臟組織的承受水平,說明該濃度下的氧氟沙星已經對肝臟造成了損害。

3.3 過氧化氫酶(CAT)作為抗氧化系統(tǒng)的初級部分,CAT可以與SOD互相配合,將SOD歧化產生的H2O2再分解成水和氧氣以維持組織細胞的正常生理活動[13]。該現(xiàn)象在該試驗結果中得到證實,黃蓋鰈肌肉組織和鰓組織的CAT活性隨著SOD活性的變化而變化。而在肝臟組織中,與氧氟沙星濃度較低的試驗組比較,氧氟沙星濃度為6.0 mg/L試驗組SOD活性下降而CAT活性卻上升,其原因可能是該濃度下肝臟組織已經積累過多的H2O2,需要提高CAT活性水平來分解過多的H2O2。同理當海水中氧氟沙星的濃度最后變?yōu)?0.0 mg/L時,SOD活性水平重新升高,H2O2繼續(xù)積累,所以CAT活性水平也繼續(xù)升高。

在許多學者的試驗中,當機體受到不同環(huán)境脅迫因子刺激后SOD與CAT活性基本處于一個先升后降的模式。在同一鹽酸恩諾沙星濃度下對雜交鱘魚幼魚的抗氧化酶試驗中發(fā)現(xiàn),SOD與CAT的活性均存在先升后降的變化趨勢,且在時間上存在差異性[14];陳旭等[3]在研究使用恩諾沙星對卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)抗氧化酶活性影響時也同樣發(fā)現(xiàn)了SOD活性先升后降的趨勢,但是低濃度組的CAT活性卻在一直升高,他們認為是藥物處理濃度過低,尚未達到機體的承受極限,在該試驗中鰓和肝臟組織的CAT活性隨著海水中氧氟沙星含量增加而逐漸升高可能就是因為這個原因;但當CAT活性沒有升高反倒出現(xiàn)抑制時,如該試驗中的肌肉組織,造成這種現(xiàn)象的主要原因還是由于受到SOD活性的影響,該現(xiàn)象與鄭棟赫等[15]使用諾氟沙星和氧氟沙星在斑馬魚上的試驗一致。

3.4 丙二醛(MDA)MDA作為多不飽和脂肪酸氧化的主要產物,同樣也可以反映機體受氧化應激損傷的程度[16- 17]。MDA能夠通過脂質過氧化途徑破壞細胞膜結構和功能引發(fā)蛋白質交聯(lián),從而破壞有關酶活性,造成組織損傷[18]。有研究指出,通過向飼料中添加抗生素長期喂養(yǎng)團頭魴會使其體內MDA含量升高并陷入長期應激狀態(tài)[19]。李洪娟等[20]在有關軍曹魚(Rachycentroncanadum)幼魚低氧脅迫試驗的氧化應激指標中也曾得出相似的結論。上述結論在該試驗MDA含量的結果中得到證實,各個組織中的MDA含量均隨著海水中氧氟沙星含量的增加而增加。這主要是因為魚體在受到氧氟沙星的脅迫下,長期處于氧化應激狀態(tài),此時機體內MDA的含量會適當增加以用來清除體內受損的細胞、保證正常細胞的健康,維持機體正常新陳代謝[21]。同時由于MDA是脂質過氧化反應終止階段產生的小分子產物,其含量和SOD活性密切相關[22]。所以當海水中氧氟沙星含量增高,機體受到ROS攻擊程度加重,該研究發(fā)現(xiàn),當機體中SOD活性增高,MDA含量也隨之增加。

4 結論

不同濃度氧氟沙星慢性脅迫(30 d)并不會對黃蓋鰈生長產生影響,但其會在黃蓋鰈體內富集。SOD、CAT活性及MDA含量的氧化應激指標結果得出,氧氟沙星在海水中的使用會對黃蓋鰈肌肉組織、鰓組織和肝臟組織造成氧化應激影響,并且隨著氧氟沙星濃度的提高,造成的影響也逐漸加大;在該試驗中,海水中氧氟沙星濃度超過0.6 mg/L會對黃蓋鰈肝臟造成較大的損傷,其余組織的SOD、CAT活性和MDA含量曲線均為單一變化趨勢,未出現(xiàn)峰值,說明不同組織對海水中氧氟沙星的耐受度不盡相同,該試驗尚未達到閾值,其變化曲線還需進一步研究。綜上所述,黃蓋鰈的肝臟組織對海水中氧氟沙星的變化最為敏感,因此肝臟組織中SOD的活性變化可以反映魚體的損傷程度,也可將肝臟組織中SOD活性作為生物標志物對水體污染程度作出預警。