張霞 程江豪 李曦 朱明利

路鄧葡萄球菌作為條件致病菌，最常定居于人體腹股溝、會陰部、下肢、腋窩、鼻腔黏膜等汗液分泌較多的部位[1-4]，隨著機體免疫力降低，大量抗菌藥物的濫用，器官移植患者的日益增多，路鄧葡萄球菌引起相關(guān)侵襲性感染的報道逐年增加，已成為危害人類生命的重要機會性致病菌，路鄧葡萄球菌可引起嚴重的傷口感染、菌血癥、心內(nèi)膜炎、聯(lián)合感染、尿路感染、移植物瓣膜炎[5-7]。有報道發(fā)現(xiàn)該菌可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染進而引發(fā)腦血管意外[8]，甚至可能出現(xiàn)路鄧葡萄球菌感染被誤診而導(dǎo)致患者死亡的情況。

目前在全球范圍內(nèi)，凝固酶陰性葡萄球菌耐藥情況比較嚴重。而路鄧葡萄球菌屬于凝固酶陰性的葡萄球菌，國內(nèi)對其耐藥僅有個案報道。崔嵬等[9]分析34 例路鄧葡萄球菌感染，發(fā)現(xiàn)耐甲氧西林路鄧葡萄球菌（methicillin- resistant Staphylococcus lugdunensis，MRSL）檢出率低于50%，但例數(shù)偏少且與甲氧西林敏感路鄧葡萄球菌（methicillin-sensitivity Staphylococcus lugdunensis，MSSL）差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而其他學(xué)者對路鄧葡萄球菌的研究更少，更鮮有不同標本來源的路鄧葡萄球菌耐藥性及其炎癥指標差異的研究。本研究收集近年來臨床分離出引起感染的路鄧葡萄球菌菌株，分別對其鑒定、耐藥及致病情況進行分析，以期為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2017 年1 月1 日至2022 年12 月31 日分離出的83 株路鄧葡萄球菌，根據(jù)納入標準和排除標準剔除32 株，最終納入51 例患者的51 株可致病的路鄧葡萄球菌，其中，杭州市西溪醫(yī)院22 例，浙江省人民醫(yī)院29 例。納入標準：（1）所選菌株均為致病性菌株，患者出現(xiàn)臨床感染癥狀，血常規(guī)提示細菌感染；（2）所有就診患者樣本分離出的致病性菌株及完整的臨床資料；（3）菌株鑒定需通過涂片革蘭染色、部分生化反應(yīng)及VITEK2 Compact 細菌鑒定儀（法國梅里埃生物公司）和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（desorption ionization time-off light mass spectrometry，MALDITOF MS）儀（法國梅里埃生物公司）鑒定，且鑒定率為95%以上。排除標準：（1）排除同一例患者的重復(fù)菌株；（2）臨床資料缺失；（3）臨床懷疑定植菌或污染菌。樣本主要來自皮膚軟組織感染膿液29株（56.86%），血液10 株（19.61%），胸水7 株（13.73%），尿液2 株（3.92%），皮膚拭子2 株（3.92%），腦脊液1 株（1.96%）。根據(jù)對甲氧西林耐藥情況，將51 株路鄧葡萄球菌分為MRSL 22株（43.14%）和MSSL 29 株（56.86%）。本研究經(jīng)杭州市西溪醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過（批準文號：杭西醫(yī)倫審2023 研第045 號）。

1.2 菌株鑒定及藥物敏感試驗

1.2.1 初步鑒定 嚴格按照臨床作業(yè)指導(dǎo)書在生物安全柜內(nèi)進行無菌操作，不同標本采用不同處理方式：傷口軟組織膿液標本3 000 r/min 離心5 min，棄上清液，取沉渣，用一次性無菌棉簽蘸取樣本涂抹于血瓊脂平板一區(qū)（若膿液量過少，亦可直接將所有膿液取出置于血瓊脂平板上）；將收集尿液標本的容器輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，用無菌移液器吸取尿液10 μL 涂抹于血平板和麥康凱平板上，再密集劃線，35～37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落生長情況，將平板菌落數(shù)乘以102，即為每1 mL 尿液中所含有的細菌數(shù)（CFU/mL），如菌落生長過多無法精確計數(shù)時，則報告＞104CFU/mL；血液及胸水標本在培養(yǎng)箱內(nèi)報告陽性后取出，用注射器抽取部分血液或胸水（20 μL 左右）接種在血平板上；用接種環(huán)在紅外線滅菌器上高熱滅菌后四區(qū)劃線，將劃好的平板放于35 ℃CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)18～24 h，第2 天取出用接種環(huán)/針挑取純種單顆菌落進行分離鑒定，先將可疑菌落涂片并革蘭染色，顯微鏡下觀察菌落形態(tài)。同時做生化反應(yīng)顯示氧化酶陰性，玻片凝固酶陽性，觸酶陽性，初步確定菌株類型，若可疑菌落較小或菌量不夠，取單顆菌落繼續(xù)接種于血平板上，培養(yǎng)18～24 h 后獲得純菌落。

1.2.2 最終鑒定 （1）VITEK2 Compact 鑒定：再挑取分離純化后的3～4 顆菌落充分混懸于專用0.45%氯化鈉溶液中，配制麥氏濁度為0.5～0.63 McF（麥氏單位）的菌懸液，從第1 管中取出280 μL 菌懸液加入第2 管中稀釋混勻，將卡片（鑒定卡GP 和藥敏卡AST-GP67）[杭州市怡丹（藍）生物技術(shù)有限公司購買]按順序分別放入載卡架上，輸樣管插入到菌液管中，采用法國梅里埃公司生產(chǎn)的VITEK2 Compact 細菌鑒定儀進行鑒定及藥敏。待藥敏結(jié)果出來后，嚴格按照最新美國臨床實驗室標準化協(xié)會CLSI 規(guī)則及標準進行[10]，測定最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC），判定其藥敏情況，質(zhì)控菌株采用金黃色葡萄球菌ATCC25923。（2）MALDI-TOF MS 技術(shù)進行鑒定：先將質(zhì)控品大腸埃希菌ATCC8739 均勻涂抹于質(zhì)控圈內(nèi)，用牙簽蘸取單顆部分菌落，均勻涂抹于鑒定圈內(nèi)，待菌落干燥后，在涂有細菌的圈內(nèi)加入1 滴基質(zhì)液，等基質(zhì)液干燥，打開儀器。將鑒定板塞入儀器內(nèi)，開始鑒定。待鑒定結(jié)果出來，利用VITEK2 Compact 儀器進行藥敏試驗。

1.3 血常規(guī)及CRP 檢測 抽取患者手指末梢血（不低于30 μL）或EDTA/肝素抗凝全血（不低于30 μL），部分按1∶4 比例用樣本稀釋液稀釋，輕搖10 s 充分混勻后利用Nephstar plus 儀器進行常規(guī)檢測CRP，部分全血直接放在希森美康XN 流水線上進行血常規(guī)檢測WBC、中性粒細胞（neutrophil，NEUT）及中性粒細胞/WBC 比值（NEUT/WBC），最后將結(jié)果直接上傳至lis 系統(tǒng)，結(jié)合鑒定結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)處理。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0、WHONET 5.6 和Excel 2010 統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 路鄧葡萄球菌感染患者的臨床情況分析 分離出致病性路鄧葡萄球菌的感染患者中，男性居多，不同感染部位患者中，MRSL 與MSSL 感染患者的占比比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

表1 路鄧葡萄球菌感染患者的臨床情況分析

2.2 路鄧葡萄球菌藥敏結(jié)果 51 株路鄧葡萄球菌藥敏結(jié)果中，青霉素耐藥率最高，其次是紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、莫西沙星、左氧氟沙星和復(fù)方新諾明；22 株MRSL 藥敏結(jié)果中，青霉素耐藥率最高，其次是紅霉素、克林霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、莫西沙星、左氧氟沙星；29 株MSSL 藥敏結(jié)果中，青霉素耐藥率最高，其次是紅霉素、克林霉素、復(fù)方新諾明、四環(huán)素；MRSL 與MSSL 對青霉素和環(huán)丙沙星的耐藥率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），其余抗菌藥物的耐藥率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

2.3 MRSL 與MSSL 感染患者相關(guān)部分炎癥指標的比較 結(jié)果顯示，MRSL 感染患者與MSSL 感染患者的CRP 水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示機體在感染MRSL 后，CRP 水平可出現(xiàn)明顯升高，可以輔助臨床診斷細菌感染。而NEUT、WBC 及NEUT/WBC比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示在明確路鄧葡萄球菌感染時，常規(guī)感染指標需結(jié)合臨床其他炎癥指標進行診斷，見表3。

表3 MRSL 與MSSL 感染患者相關(guān)部分炎癥指標的比較

3 討論

目前，葡萄球菌機會性感染已成為院內(nèi)感染的主要原因之一，導(dǎo)致院內(nèi)發(fā)病率和死亡率明顯升高。國內(nèi)外對于路鄧葡萄球菌感染的病例報道逐年增多，如嬰幼兒及新生兒通過尿道或血液感染路鄧葡萄球菌[11-12]，部分患者感染后引起關(guān)節(jié)感染、足部膿腫及心內(nèi)膜炎等[13-15]。有研究表明，早期鑒定出路鄧葡萄球菌并及時使用抗生素治療可降低瓣膜型心內(nèi)膜炎感染的死亡率[16]。因此，及早鑒定路鄧葡萄球菌是否為致病菌觀察該菌對抗生素的耐藥情況，避免誤診漏診，指導(dǎo)臨床用藥顯得尤為重要。但目前國內(nèi)外的相關(guān)報道多數(shù)為個例[17-18]，通常，凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌被認為是毒性最強、侵襲力最大的菌種。而凝固酶陰性的葡萄球菌則被認為致病性較低，常被作為污染菌或正常菌群。但自1988 年凝固酶陰性葡萄球菌之一路鄧葡萄球菌被發(fā)現(xiàn)以來[19]，其毒性似乎與金黃色葡萄球菌有相似之處，如可產(chǎn)生黏附因子、蛋白水解酶、生物膜等。當患者免疫力低下時，路鄧葡萄球菌可引起嚴重的侵襲性機會性感染，如皮膚軟組織感染、心肌炎、骨髓炎、傷口感染、尿路感染甚至神經(jīng)系統(tǒng)感染導(dǎo)致腦血管意外等，尤其是路鄧葡萄球菌引起的瓣膜性感染性心內(nèi)膜炎時若不能及時治療，可引起患者出現(xiàn)感染性休克乃至死亡。本研究發(fā)現(xiàn)，膿液中分離出的路鄧葡萄球菌占比最高（56.86%），其次為血液（19.61%）、胸水（13.73%）、尿液（3.92%）、皮膚拭子（3.92%）及腦脊液（1.96%）等，提示路鄧葡萄球菌引起的軟組織感染比例較高，不可輕易將其定義為污染菌而不加處理。

路鄧葡萄球菌與金黃色葡萄球菌雖有不同，但其致病性卻諸多相似，如路鄧葡萄球菌可產(chǎn)生與金黃色葡萄球菌相似的毒力因子，比凝固酶陰性葡萄球菌更具有侵襲性。本研究收集的51 株路鄧葡萄球菌中，多數(shù)分離自免疫力較低或合并基礎(chǔ)性疾病的患者，這與國外研究報道多數(shù)感染該菌的患者有潛在的免疫抑制病史，包括糖尿病、慢性類固醇類藥物治療、移植物瓣膜等[6]一致，但本研究發(fā)現(xiàn)感染者多為男性，占比超過90%，這可能與收治患者類型的局限性有關(guān)，杭州市西溪醫(yī)院是以治療肝病、艾滋病等?？萍膊樘厣木C合性醫(yī)院，入院患者以男性居多。本研究中多數(shù)樣本分離自膿液（56.86%），與此前報道的路鄧葡萄球菌感染最常引起膿腫一致[3]，有研究認為，采集患者機體深部的樣本分離到路鄧葡萄球菌，被認為是致病菌，而對于皮膚拭子或在定植部位（如腹股溝、鼻腔、腋窩等）分離出的該菌則需要根據(jù)患者的臨床感染情況慎重考慮是否為定植甚至是污染菌。國外有報道1例路鄧葡萄球菌感染引起新生兒尿路感染，而本研究從尿液分離出2 株路鄧葡萄球菌作為致病菌，均為成人樣本，經(jīng)鑒定為MRSL 對多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥，其余從尿液中分離的路鄧葡萄球菌作為污染菌處理。

本研究發(fā)現(xiàn)，分離出的51 株路鄧葡萄球菌均作為致病菌，引起不同程度的臨床癥狀，嚴重者可出現(xiàn)各類膿腫、移植物瓣膜炎、菌血癥、膿毒血癥、敗血癥，進而危及生命。而另有32 株分離出的路鄧葡萄球菌被認為是污染菌未做處理，該部分患者預(yù)后狀況不佳，甚至死亡1 例，這是否與未將路鄧葡萄球菌作為致病菌進行用藥有關(guān)仍待研究。根據(jù)2014 年桑福德指南提示，青霉素是治療路鄧葡萄球菌的首選藥物，有國外研究發(fā)現(xiàn)67%的菌株對青霉素敏感[20]，青霉素曾是治療路鄧葡萄球菌侵襲性感染的首選藥物。本研究的藥敏結(jié)果顯示，MSSL 對青霉素的敏感率僅為48.28%，而MRSL 則對青霉素全部耐藥。MRSL 與MSSL 針對青霉素耐藥率的比較發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），針對MSSL，青霉素治療效果可能優(yōu)于MRSL。而這與多年來抗菌藥物濫用可能有關(guān)，并不是所有路鄧葡萄球菌對青霉素均有效，臨床需根據(jù)藥敏情況擇優(yōu)選擇合適的抗菌藥物。針對喹諾酮類藥物如環(huán)丙沙星，MRSL與MSSL 耐藥率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而左旋氧氟沙星卻無明顯變化，這可能與樣本例數(shù)較少有關(guān)，仍需增加樣本量繼續(xù)探索。無論是MRSL 亦或MSSL，對氨基糖苷類、利福平、四環(huán)素類、利奈唑胺、糖肽類及甲氧芐啶/磺胺甲惡唑類抗菌藥物具有較好的敏感性，這與Taha 等[21]報道的藥敏結(jié)果不盡相同。

CRP 屬于急性期反應(yīng)蛋白，是針對感染或創(chuàng)傷的一種炎癥指標，CRP 水平升高與可能細菌感染有關(guān)，也可因自身免疫性疾病、心臟疾病等引起。因此本研究針對CRP 及WBC、NEUT 及NEUT/WBC 進行比較發(fā)現(xiàn)，MRSL 與MSSL 感染者的CRP 水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而其他炎癥指標則差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。提示感染MRSL 后，其血液中炎性因子CRP 水平明顯升高，提示在患者機體處于低免疫力狀態(tài)時，定植菌可發(fā)展成機會性致病菌并引起嚴重的并發(fā)癥或膿毒血癥，需引起臨床注意。國外研究發(fā)現(xiàn)，路鄧葡萄球菌引起侵襲性感染主要依賴于其基因序列中含有可編碼鐵依賴性的表面位點系統(tǒng)[22]，有助于路鄧葡萄球菌從Hb 中獲得血紅素，進而造成血液中較為嚴重的侵襲性感染，這與金黃色葡萄球菌的侵襲方式相似，且對苯唑西林敏感性的解釋亦與金黃色葡萄球菌相同。但國外報道過1 例攜帶SCCmecV 型基因的路鄧葡萄球菌被誤診為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的病例，該患者是1 例73 歲老年女性，患有系統(tǒng)性動脈高壓和慢性阻塞性肺疾病等基礎(chǔ)性疾病，入院后出現(xiàn)急性呼吸衰竭及膿毒癥，由于用藥不當最終死亡，對其膿性分泌物進行基因檢測同時對藥敏進行分析最終確定為路鄧葡萄球菌引起的侵襲性感染。而對本研究收集的51 株路鄧葡萄球菌引起感染的患者，根據(jù)藥敏結(jié)果進行合理用藥后，患者癥狀減輕，復(fù)查結(jié)果顯示路鄧葡萄球菌被抑制或殺滅，未引起進一步的菌血癥或膿毒血癥。

總之，針對路鄧葡萄球菌的研究仍處于初級階段，亦出現(xiàn)將致病菌誤診污染菌而不去治療，最終導(dǎo)致菌血癥甚至膿毒血癥，引起嚴重的臨床癥狀。因此，仍需加大樣本量對路鄧葡萄球菌進一步探索，進而挽救因路鄧葡萄球菌造成嚴重感染的患者性命。