劉國榮，劉洋碩，聶蓉

（1 北京工商大學食品與健康學院 北京100048 2 北京工商大學老年營養(yǎng)與健康教育部重點實驗室 北京100048 3 北京工商大學北京市食品添加劑工程技術研究中心 北京 100048）

乳酸菌細菌素是在乳酸菌生長過程中自身產生的一種具有抗菌活性的多肽類物質，大部分乳酸菌細菌素具有高疏水性、高等電點以及陽離子性的特性[1-2]。與抗生素不同，細菌素可以被胰凝乳蛋白酶以及胃蛋白酶等人體中常見的蛋白酶降解，具有無毒、無抗藥性、無殘留等優(yōu)點[3-4]。然而，細菌素的產量受多種因素的影響，例如培養(yǎng)條件、相關合成基因的表達、是否添加外源刺激物質等。由于外源物質的安全性較高且成本較低，因此目前的研究集中于構建外源微生物與產細菌素乳酸菌的共培養(yǎng)體系，以此提高細菌素的產量。有研究表明，外源微生物可以誘導乳酸菌細菌素的高效合成[5]，Man等[6]研究發(fā)現嗜熱鏈球菌STY-31 與植物乳桿菌KLDS1.0391 共培養(yǎng)會提高植物乳桿菌素（Plantaricin）MG 的產量；另外，Tabasco等[7]研究表明德氏乳桿菌保加利亞亞種CECT4005 和德氏乳桿菌乳酸亞種CECT282 等都會增強嗜酸乳桿菌La-5 產生乳桿菌素（Lactacin）B 的能力。

群體感應系統(tǒng)（Quorum sensing，QS）是一種細胞間相互交流的“語言”，分為種內和種間群體感應系統(tǒng)；信號分子隨著細菌的生長不斷產生，當積累到一定量后，便會被自身或其它細菌所感知，從而誘導特定基因的表達，使菌群表現出如形成生物被膜、產生細菌素等生理活動[8-9]。在純培養(yǎng)中，植物乳桿菌素EF 的合成受到種內群體感應系統(tǒng)的調控，即：首先，植物乳桿菌自身通過plnA 基因編碼合成信號分子自誘導肽（Autoinducing peptide，AIP）；當細菌大量繁殖，種群密度不斷增加致AIP 大量積累達到閾值時，激活位于細胞膜上的由plnB 基因編碼的組氨酸蛋白激酶，并以磷酸化的方式將群體感應信號分子傳遞給相應的反應調節(jié)蛋白，這兩個蛋白則分別由plnC 和plnD編碼；接著調控操縱子plnEFI 產生植物乳桿菌素EF，并通過ABC 轉運系統(tǒng)分泌到胞外[10-14]。而在共培養(yǎng)體系中，同時存在種間群體感應與種內群體感應兩種信號分子。目前有研究發(fā)現植物乳桿菌DC400 和羅氏乳桿菌A7 在共培養(yǎng)過程中，LuxS基因的表達量上升，AI-2 的分泌量增加[15]。植物乳桿菌NMD-17 與瑞士乳桿菌NMD-137 進行共培養(yǎng)時，會顯著增加AI-2 信號分子的活性，因此推測AI-2/LuxS 介導的種間群體感應系統(tǒng)在其中發(fā)揮一定的作用[16]。

本課題組發(fā)現植物乳桿菌RX-8 與枯草芽孢桿菌1.8715 共培養(yǎng)可以提高植物乳桿菌素EF 的產量。在阻斷種間信號分子AI-2 后，會降低枯草芽孢桿菌1.8715 對共培養(yǎng)植物乳桿菌素EF 的誘導效應，說明種內群體感應系統(tǒng)參與調控共培養(yǎng)中植物乳桿菌素EF 的合成[17]。本研究基于以上結果，敲除種內群體感應系統(tǒng)關鍵基因信號分子AIP 的編碼基因plnA，將突變菌株植物乳桿菌ΔRX-8、野生菌株植物乳桿菌RX-8 分別與枯草芽孢桿菌1.8715 共培養(yǎng)后，測定信號分子的分泌情況及相關基因的表達量，探究群體感應系統(tǒng)調控細菌素合成的作用機制。這對于在共培養(yǎng)體系中提高乳酸菌細菌素的產量，以及群體感應相關基因的研究提供理論依據，為乳酸菌細菌素的工業(yè)化生產提供技術支持。

1 試驗材料

1.1 菌株與質粒

本研究所用的菌株和質粒見表1。

表1 菌株和質粒Table 1 Bacterial strains and plasmids

1.2 試劑

Q5 高保真DNA 聚合酶，購于北京欣華綠源科技有限公司；E.Z.N.A 質粒小提試劑盒，購于上海索寶萊科技有限公司；ClonExpress II 克隆試劑盒，購于南京諾唯贊生物技術有限公司；紅霉素、氨芐青霉素、DNA marker、多功能DNA 純化回收試劑盒，購于北京半夏生物科技有限公司；限制性內切酶，購于Takara 公司。

1.3 儀器與設備

C1000 Touch PCR 儀，美國BIO-RAD2 公司；SPX-150B 生化培養(yǎng)箱，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；BSA224S 型數字電子天平，德國Sartorius 公司；渦旋振蕩器，德國IKA 公司；小型高速離心機，美國SIGMA 公司；BioSpectrum 凝膠成像儀，美國UVP 公司；UB-7 pH 計，美國DENVER 儀器公司；電穿孔儀，德國Eppendorf 公司。

1.4 引物設計

利用Primer Premier 5.0 進行引物設計，如表2 所示。

表2 引物列表Table 2 Primer design

2 試驗方法

2.1 基因缺失菌株及種內群體感應系統(tǒng)缺失共培養(yǎng)體系的構建

2.1.1 質粒pMG36e-red/cas 的構建 從含有pCas 的大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α 中提取質粒，操作步驟參考試劑盒說明書，以質粒pCas為模板，使用引物Cas9-F/R 和Red-F/R 擴增CRISPR/Cas9 基因編輯所需的敲除元件內切酶基因Cas9 和重組修復酶基因λ-Red。

利用TaKaRa Quickcut SacI、KpnI 限制性內切酶切質粒pMG36e，將環(huán)形pMG36e 質粒線化，所得酶切產物電泳驗證并回收。將切膠回收后的線性質粒pMG36e 和純化后的Cas9 和λ-Red 片段進行多片段一次性連接。將得到的產物與感受態(tài)細胞混勻冰上靜置，隨后熱激冰浴并加入LB 培養(yǎng)基。37 ℃充分復蘇后，取菌液涂布于氨芐青霉素抗性LB 平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h。

2.1.2 sgRNA 的設計 根據植物乳桿菌RX-8 種內信號分子編碼基因plnA 的序列和靶位點設計原則，選擇帶有PAM（NGG）位點的位置設計靶向sgRNA，命名為plnA-sgRNA，并以質粒pNZ8148來源的PNis 啟動子作為sgRNA 的啟動子，誘導表達sgRNA。

2.1.3 plnA 同源臂片段的擴增及與質粒的連接轉化 分別以plnA-L F/R 和plnA-R F/R 為引物，以植物乳桿菌RX-8 基因組為模板擴增plnA 基因兩側同源臂。將純化回收的同源臂片段和線化的質粒連接并轉化入大腸桿菌DH5α。

2.1.4 敲除質粒pMG36e-red/cas-sgRNA/plnALR 構建 將線化質粒pMG36e-red/cas、pNissgRNA 和同源臂片段plnA-LR 進行多片段一次性連接，連接后轉化入大腸桿菌DH5α 進行酶切并測序驗證。

2.1.5 敲除菌株乳桿菌RX-8ΔplnA 構建 將原始菌株RX-8 活化兩代后，接種至含2%甘氨酸的MRS 培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)至對數生長期，加入氨芐青霉素（終質量濃度為10 μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)至其OD600nm在0.4～0.5。離心收集菌體細胞。用預冷的電穿孔緩沖液清洗細胞2 次后，加入預冷的500 μL 30% PEG-1500 重懸菌體，得到感受態(tài)細胞。

將上述得到的質粒DNA 加入感受態(tài)細胞中，移液槍吹吸混勻后冰浴5 min，轉移至提前預冷的電轉杯，設置電擊參數為：電壓2.5 kV，電脈沖25 μF，電阻200 Ω。電擊后立即用含2 mmol/L CaCl2和20 mmol/L MgCl2的預冷的MRS 肉湯稀釋，并在30 ℃下孵育3 h。吸取200 μL 到紅霉素MRS固體平板上，涂布后培養(yǎng)24 h。挑取生長情況良好的單個菌落，分別接種于具有氨芐青霉素抗性和自誘導肽的LB 試管中，37 ℃，200 r/min 搖菌擴增12 h 后，提取植物乳桿菌RX-8 基因組DNA。用引物ΔplnA-F/R 擴增敲除片段，將PCR 產物測序與野生菌株序列進行對比。

2.2 共培養(yǎng)中突變菌株的產細菌素變化分析

2.2.1 突變菌株生長曲線的測定 將野生菌株RX-8 和敲除菌株ΔRX-8 接種到MRS 培養(yǎng)基中，并將枯草芽孢桿菌1.8715 的種子液等比例分別接入，形成共培養(yǎng)體系后連續(xù)培養(yǎng)32 h，每隔4 h取樣測OD600nm，繪制生長曲線。

2.2.2 突變菌株抑菌活性的測定 采用硫酸銨沉淀法制備[18]細菌素粗提液，采用瓊脂擴散法[19]進行測定抗菌活性。在培養(yǎng)的固體平板上觀察是否具有明顯的抑菌圈，并用游標卡尺測量抑菌圈的直徑抑菌圈直徑越大，抑菌效果越好。

2.3 共培養(yǎng)體系中種間信號分子AI-2 的分泌量檢測

從野生菌株RX-8 和敲除菌株ΔRX-8 種子培養(yǎng)液中取菌液按照1%接種量接種到MRS 培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)32 h，離心收集上清液。從BB170種子培養(yǎng)液中取菌液按照1%接種量接種到AB培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)至OD600nm在0.7～1.2，稀釋后得到BB170 稀釋液，并以BB170 熒光值為對照，計算野生菌株和突變菌株的相對發(fā)光值。

2.4 共培養(yǎng)中突變菌株相關基因的轉錄水平研究

2.4.1 突變菌株與野生菌株總RNA 提取及反轉錄cDNA 的制備 將野生菌株RX-8、突變菌株ΔRX-8 進行純培養(yǎng)并分別與枯草芽孢桿菌1.8715 共培養(yǎng)提取每隔4 h 的野生菌株與突變菌株的發(fā)酵液，離心收集菌體，采用RNA 提取試劑盒得到總RNA，并利用cDNA 合成試劑盒提取制備cDNA。

2.4.2 RT-qPCR 分析 對共培養(yǎng)中野生菌株RX-8 和突變菌株ΔRX-8 的ABC 系統(tǒng)轉運基因LuxS、甲硫腺苷核苷酶基因pfs、群體感應基因plnBCD、細菌素基因plnEF 的表達量進行測定。測定結果以純培養(yǎng)時的RX-8 基因表達量為基準（即為1）進行相對表達量的計算。

3 結果與分析

3.1 構建種內群體感應缺失的共培養(yǎng)體系

3.1.1 質粒pMG36e-red/cas 的構建 本研究以質粒pMG36e 為敲除骨架，插入CRISPR/Cas9 基因編輯所需的組件，初步構建了敲除工具。如圖1所示，在第1 泳道和第2 泳道分別擴增得到2 個位于3～5 kp 和2～3 kp 之間的DNA 片段，與預計擴增片段大?。? 107，2 210 bp）基本一致，并且測序結果顯示序列完全正確。將線化質粒pMG36e與敲除組件Cas 和λ-Red 連接轉化，對重組質粒進行酶切（XhoI、BglII 和BamHI、XhoI）驗證，第3泳道為重組質粒pMG36e-red/cas（大小約為8.8 kb），第4 泳道的cas9 片段和pMG36e-λ-Red 分別實際長度為5 820 bp 和4 107 bp，測序結果比對正確，表明成功構建質粒pMG36e-red/cas。

圖1 質粒pMG36e-red/cas 的構建電泳圖Fig.1 Construction of plasmid pMG36e-red/cas

3.1.2 sgRNA 的設計 根據https：//links.jianshu.com 網站在線設計plnA 基因的sgRNA。在網站中導入plnA 基因后可生成所有可能的靶點位置，選取得分最高的序列。本研究選擇距離啟動子ATG只有17 堿基的位置并且尾端帶有PAM 序列的sgRNA 序列，以pNZ8148 來源的pNis 啟動子作為sgRNA 的啟動子，誘導其表達。目的基因plnA 中sgRNA 所在位置及其堿基序列如圖2 所示。將設計好的plnA 基因的sgRNA 序列和pNis 啟動子序列構成的pNis-sgRNA 進行合成，電泳結果如圖3所示。

圖2 plnA 基因的sgRNA 位置及序列Fig.2 Insertion position of sgRNA and sequences of plnA

圖3 pNis-sgRNA 酶切電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis pattern of RCR amplification product of pNis-sgRNA

3.1.3 plnA 同源臂的設計 擴增plnA 基因左右兩端的同源臂plnA-L（493bp）和plnA-R（526 bp），圖4 中顯示分別擴增得到2 個位于500～750 bp 之間的DNA 片段，與預計擴增片段大?。?00 bp）條帶大小相符且測序結果顯示序列完全正確，表明擴增成功。接著將純化回收后的同源臂和質粒分別連接，酶切鑒定結果圖如4 所示。重組質粒經過XhoI 和SpeI 雙酶切后在1～2 kb 之間可見1 000 bp 左右的條帶，電泳結果與測序結果均表明與預期相符。

圖4 plnA 同源臂L/R 基因的PCR 產物和雙酶切電泳圖Fig.4 A garose electrophoresis of PCR products of plnA-L/R

3.1.4 敲除質粒pMG36e-red/cas-sgRNA/plnALR 的構建 將質粒pMG36e-red/Cas 與同源臂plnA-L/R、pNis-gRNA 連接轉化。如圖5 所示，經XhoI 和SpeI 雙酶切后可見在1～2 kb 和8 kb 出現兩條特異性條帶，均與預期大小一致。將重組的敲除質粒和酶切片段測序，結果與原序列一致，分別為同源臂片段1 019 bp 和pMG36e-red/cas-sgRNA 10 680 bp。

圖5 敲除質粒酶切PCR 產物電泳圖Fig.5 Electrophoretic pattern of knockout plasmid enzyme digestion PCR products

3.1.5 突變菌株ΔRX-8 的構建 將敲除質粒CRISPR/Cas-sgRNA-plnA-L/R 電擊轉化入植物乳桿菌RX-8 中，通過引物ΔplnA-F/R 擴增靶基因的同源臂，判定plnA 基因的敲除情況。由于敲除片段長度較短在電泳圖中不明顯，這里通過測序序列峰圖和序列對比圖展示敲除結果如圖6，從峰圖中可見敲除plnA 基因后進行了同源修復并引入設計的強終止子序列。

圖6 plnA 基因敲除前后的測序鑒定結果Fig.6 Sequencing results before and after plnA gene knockout

3.2 共培養(yǎng)中突變菌株的產細菌素變化

3.2.1 共培養(yǎng)中突變菌株生長情況 為研究在共培養(yǎng)中種內群體感應系統(tǒng)關鍵基因信號分子plnA基因敲除后植物乳桿菌RX-8 的生長代謝變化，本研究繪制了共培養(yǎng)32 h 的念珠菌的生長曲線圖。如圖7 所示，在敲除了plnA 基因之后，無論是純培養(yǎng)還是共培養(yǎng)過程中，突變菌株仍然保持著良好的生長活性，且共培養(yǎng)的菌體密度高于純培養(yǎng)。與野生菌株相比，突變菌株的菌體密度整體略低，但是并無明顯的差異，依舊保持平穩(wěn)的生長趨勢。

圖7 野生菌株RX-8 和突變菌株ΔRX-8 的生長曲線Fig.7 Growth curve of wild plant RX-8 and mutation plant ΔRX-8

3.2.2 共培養(yǎng)中突變菌株細菌素合成情況 野生菌株RX-8 和和突變菌株ΔRX-8 在純培養(yǎng)和共培養(yǎng)體系中細菌素合成量如圖8 所示。純培養(yǎng)體系中，由于敲除了ΔplnA，突變菌株不會產生細菌素，所以抑菌圈直徑為0。在共培養(yǎng)體系中，突變菌株植物乳桿菌ΔRX-8 的細菌素合成量雖較野生菌株植物乳桿菌RX-8 有所下降，但卻明顯高于純培養(yǎng)體系中野生菌株植物乳桿菌RX-8 細菌素的合成量，說明敲除plnA 后依然部分存在枯草芽孢桿菌1.8715 的誘導作用。從整體來看，細菌素在整個培養(yǎng)時期均表現出先上升后下降的趨勢，且純培養(yǎng)體系中細菌素的產量以及合成速度均高于純培養(yǎng)體系。

圖8 細菌素合成量變化Fig.8 The changes in bacteriocin synthesis

3.3 共培養(yǎng)中突變菌株群體感應系統(tǒng)信號分子分泌情況

敲除種內信號分子基因plnA 后，研究共培養(yǎng)過程中野生菌株RX-8 與突變菌株ΔRX-8 種間信號分子AI-2 分泌量，結果如圖9 所示。以上清液的相對發(fā)光量作為AI-2 分泌量的判斷依據，在4～20 h 的培養(yǎng)過程中，純培養(yǎng)體系AI-2 分泌量顯著低于共培養(yǎng)體系，但是在20 h 之后便無明顯差異。從菌株水平來看，在整個培養(yǎng)過程中，無論是共培養(yǎng)還是純培養(yǎng)，突變菌株與野生菌株AI-2的分泌量始終保持在同一水平。

圖9 種間信號分子AI-2 分泌情況Fig.9 Secretion of interspecies signaling molecule AI-2

3.4 共培養(yǎng)體系中突變菌株群體感應系統(tǒng)相關基因的表達情況

3.4.1 對種間信號分子合成基因LuxS、pfs 的影響 對種間信號分子合成相關基因LuxS、pfs 的相對表達量進行測定，結果如圖10 所示。在整個培養(yǎng)的過程中，共培養(yǎng)體系的突變菌株與野生菌株在LuxS、pfs 的表達量上均未有明顯差異，但是與純培養(yǎng)相比表達量均有所上升。由此可以看出敲除種內信號分子編碼基因plnA 對種間信號分子合成基因的轉錄無影響，這與AI-2 分泌量未發(fā)生變化的結果一致。

3.4.2 共培養(yǎng)中突變菌株群體感應系統(tǒng)雙組分系統(tǒng)基因表達情況 敲除種內信號分子基因plnA后，研究共培養(yǎng)過程中野生菌株RX-8 與突變菌株ΔRX-8 的群體感應系統(tǒng)中雙組分系統(tǒng)編碼基因plnBCD 的轉錄水平，結果如圖11 所示。相對表達量是以純培養(yǎng)過程中植物乳桿菌RX-8 的基因表達量為基準，因此相對表達量大于1 即為基因表達上調。由圖11 可知，在敲除了plnA 之后，基因plnBCD 的相對表達量均大于1，這意味著相關基因仍然表達且處于上調水平，由此推測在共培養(yǎng)的過程中可能存在某些物質刺激相關的受體蛋白，從而調控相應基因的表達。與野生菌株相比，突變菌株的組氨酸激酶編碼基因plnB 表達量有所下降，差異主要集中在菌株生長的對數期及穩(wěn)定期，即12～32 h；而作為下一級信號基因的plnCD，表達差異略有滯后且時間縮短，集中在16～28 h。從整體上看，3 個基因的相對表達量變化與細菌素的產量具有相同的變化趨勢，呈現出先上升后下降。

圖11 雙組分系統(tǒng)基因plnBCD 表達情況Fig.11 Changes in expression of two-component system gene plnBCD

圖12 細菌素結構基因plnEF 表達量變化Fig.12 Changes in expression of bacteriocin structural gene plnEF

3.4.3 對細菌素合成基因表達的影響 從基因的轉錄水平上可以看出，細菌素合成基因plnEF 的表達量有顯著差異，在敲除了plnA 基因之后，突變菌株的plnEF 表達量明顯低于野生菌株，但是相對表達量仍然大于1，與純培養(yǎng)相比基因表達上調。共培養(yǎng)體系中，0～4 h 由于在細菌處于遲滯期，細菌素并未開始合成，因此兩菌株的基因表達量并無顯著差異；從8 h 開始進入對數生長期，菌體密度開始增加，同時細菌素開始合成，相關的細菌素結構基因開始表達，導致二者的表達量開始具有顯著差異直至培養(yǎng)結束。

4 討論與結論

本研究對采用CRISPR/Cas9 基因敲除技術構建突變菌株植物乳桿菌ΔRX-8，將其與枯草芽孢桿菌1.8715 進行共培養(yǎng)，同時以野生菌株RX-8與枯草芽孢桿菌1.8715 的共培養(yǎng)體系為對照，研究種內群體感應系統(tǒng)在枯草芽孢桿菌1.8715誘導植物乳桿菌RX-8 細菌素產生增加過程中所起的作用以及相關基因的變化情況。

根據敲除菌株與野生菌株的生長曲線結果顯示，在敲除了plnA 基因之后，植物乳桿菌RX-8仍然可以正常生長。共培養(yǎng)體系和純培養(yǎng)體系中，兩者的菌體密度并無顯著差異，具有相同的生長趨勢，這表明plnA 基因是一種非致死性基因，敲除之后對植物乳桿菌RX-8 生長情況沒有明顯的影響，可以排除因為生長情況而導致細菌素產量下降的干擾因素，同時也說明種間信號分子缺失共培養(yǎng)體系的成功構建。

從細菌素的合成情況可以發(fā)現，相較于純培養(yǎng)體系中的野生菌株RX-8，共培養(yǎng)體系中突變菌株ΔRX-8 的細菌素產量顯著上升，但是仍然低于野生菌株的共培養(yǎng)體系，這說明細菌素的誘導合成途徑并不完全是由種內群體感應系統(tǒng)所調控的，種間群體感應系統(tǒng)在細菌素的合成過程中同樣發(fā)揮作用。而種間信號分子AI-2 分泌量的結果顯示，當細菌處于對數生長期時，共培養(yǎng)體系與純培養(yǎng)體系的分泌量具有顯著差異，待進入穩(wěn)定期后便無明顯區(qū)別。在共培養(yǎng)過程中，敲除菌株與野生菌株種間信號分子AI-2 的分泌量始終保持一致，且在純培養(yǎng)體系中亦是如此。上述結果均表明在種內群體感應系統(tǒng)的缺失的共培養(yǎng)體系中，種間群體感應系統(tǒng)信號分子的分泌不會受到影響。

從轉錄水平上看，在共培養(yǎng)體系中，敲除了plnA 基因之后，調控雙組分系統(tǒng)plnBCD 基因的表達量略低于野生菌株，但是依舊屬于正常水平。共培養(yǎng)體系中組氨酸蛋白激酶編碼基因plnB 的表達量略有降低，這是因為構建種內群體感應系統(tǒng)缺失共培養(yǎng)體系后，突變菌株ΔRX-8 不再分泌種內信號分子AIP，而組氨酸蛋白激酶恰好是AIP的受體蛋白，導致受體蛋白只能被部分激活[20-22]。在Zhang等[23-24]的研究中，敲除了plnB 基因之后的突變菌株植物乳桿菌ΔLXM-1 的細菌素產量明顯降低，在補充PlnA 之后仍然無法恢復，這是由于在缺乏受體蛋白的情況下，即使有信號分子PlnA 也無法激活種內群體感應系統(tǒng)來調控細菌素合成。而在本研究中，缺失了PlnA 之后，plnB 的表達量雖然有所下降，卻不會降低至純培養(yǎng)水平，說明了PlnB 可能被其它信號分子激活。另外，與純培養(yǎng)的野生菌株相比，共培養(yǎng)的野生菌株和突變菌株種間信號分子AI-2 的分泌量明顯增加，同時基因LuxS，pfs 的表達量均有上調。姜雪雍等[25]的研究結果顯示，在副干酪乳桿菌HD1.7 與枯草芽孢桿菌構成的共培養(yǎng)體系中，細菌素的合成量是純培養(yǎng)組的1.21 倍，群體感應相關基因LuxS上調2.31 倍。而在孫思睿等[26-28]的研究中，純培養(yǎng)體系下組氨酸蛋白激酶基因細菌素結構基因plNC8HK、雙組分調節(jié)基因plnD 以及細菌素結構基因plnEF 均因LuxS 基因的缺失，表達顯著下調，這與本研究結果一致。因此推測種間信號分子AI-2 可能與AIP 共用同一套雙組分系統(tǒng)。在共培養(yǎng)12 h 時，二者plnB 基因的表達量已經具有顯著差異，但是其下級傳導基因的表達量雖有差異卻并不顯著，直至16 h 時差異開始顯著，因此存在基因表達的滯后性[29-31]。同時，細菌素合成基因plnEF 的表達量有明顯差異，突變菌株ΔRX-8 的plnEF 基因的表達量比野生菌株略有降低，但細菌素的產量仍然高于純培養(yǎng)中的野生菌株，這與細菌素表達量的變化趨勢相符。

綜合以上結果，在種內信號分子缺失的共培養(yǎng)體系中，誘導效應并未因為缺失PlnA 而完全喪失，表明除PlnA 介導的種內群體感應系統(tǒng)之外，還有其它系統(tǒng)調控誘導效應。由于在種內群體感應系統(tǒng)缺失的共培養(yǎng)體系中不會影響種間信號分子AI-2 的合成，而結果顯示AI-2 的分泌量提高，推測可能是存在種間信號分子AI-2 與種間信號分子AIP 共用同一套雙組分系統(tǒng)的現象，兩種信號分子共同促進細菌素的高效合成。