李彥岑,龍志鵬,張 毅,馮剛華

急性腦梗死(ACI)是以局部腦組織出現缺血性壞死或軟化為主要特征的突發(fā)性疾病,目前臨床上主要采取急性期血管再通方案,通過盡快建立側支循環(huán)以挽救缺血半暗帶(ischemic penumbra,IP)區(qū)域大量處于休眠或半休眠狀態(tài)的腦細胞及神經元細胞,達到改善病人神經損傷的目的[1]。側支循環(huán)的形成機制較為復雜,與多種血管生成因子及相關信號軸有關[2]。其中血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)是目前已知的由內皮細胞分泌、維持正常血管內皮功能并參與血管重塑過程必不可少的一種調節(jié)因子[3],在缺血性腦卒中的發(fā)生、進展及預后過程中都扮演著重要角色[4]。但是血清Ang-1易受年齡、激素分泌、基礎性疾病等客觀因素的影響,作為急性腦梗死診斷和病情判斷指標尚存在一定的局限性。miRNAs是真核生物細胞中普遍存在的一類具有保守序列和穩(wěn)定性結構的非編碼單鏈RNA分子,參與細胞增殖、分化、凋亡、血管生成等過程。有研究發(fā)現,上調微小RNA(miR)-132表達可改善大鼠模型腦組織缺血性損傷,其機制可能與促進Ang-1/Tie2表達進而促進缺血腦組織血管再生有關[5]。本研究擬觀察血清miR-132和Ang-1在急性腦梗死病人中表達水平的變化,探討二者與急性腦梗死疾病發(fā)生風險及疾病進展的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月—2020年1月在我院進行治療的105例急性腦梗死病人作為急性腦梗死組,其中合并高血壓48例,糖尿病32例,血脂異常50例,缺血性心臟病23例。納入標準:1)符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南》[6],經過頭顱CT/磁共振成像(MRI)證實,按照TOAST法進行分型;2)發(fā)病時間<72 h;3)入組前未接受相關治療。排除標準:1)合并惡性腫瘤、心肌梗死、嚴重感染性疾病、肺源性心臟病者;2)既往有短暫腦缺血發(fā)作、腦梗死、腦外傷或神經功能缺損者。同時選取同期在本院進行體檢的健康志愿者90人作為對照組。急性腦梗死組中男72例,女33例;年齡37～75(53.18±12.21)歲。對照組中男56人,女34人;年齡40～68(50.75±11.03)歲。本研究經過本地醫(yī)學倫理委員會同意,并且獲得病人或家屬自愿簽署的知情同意書。

1.2 分組方案

1.2.1 根據梗死面積分組

105例急性腦梗死病人依據梗死面積分組,≤1.5 cm2為小面積梗死亞組(55例),>1.5～3.0 cm2且累及1個解剖部位的小血管供血區(qū)為中面積梗死亞組(31例),>3.0 cm2且累及≥2個解剖部位的大血管供血區(qū)為大面積梗死亞組(19例)。

1.2.2 根據神經功能缺損程度分組

依據美國國立衛(wèi)生研究院神經功能缺損評分(National Institute Health Stroke Scale,NIHSS)[7]評定,≤15分為輕度亞組(43例),>15～30分為中度亞組(47例),>30分為重度亞組(15例)。

1.3 血清樣本收集

采集急性腦梗死組及對照組受試者的空腹肘靜脈血5 mL,以轉速3 000 r/min離心15 min后,收集上層清液,置于-80 ℃冰箱中保存待測。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)檢測血清miR-132的表達水平

采用賽默飛世爾科技(中國)有限公司的miRNA Vana PA RIS試劑盒,按照說明書提取血清總RNA。采用賽默飛世爾科技(中國)有限公司的TaqMan miRNA試劑盒,對提取得到的總RNA進行逆轉錄反應,得到cDNA。通過實時熒光定量PCR技術(miScript SYBR?Green PCR kit,德國QIAGEN公司)檢測miR-132的表達水平,內參選擇小分子U6。通過2-△△Ct法測定miR-132的RNA相對表達量。

1.5 Ang-1表達水平檢測

采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清Ang-1的表達水平。人Ang-1試劑盒均購于美國R&D 公司,操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 兩組臨床資料比較

急性腦梗死組與對照組受試者年齡、性別、體質指數(BMI)、吸煙史、冠心病史比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),急性腦梗死組中飲酒史、高血壓和糖尿病均高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組觀察對象臨床資料比較

2.2 兩組血清miR-132和Ang-1表達水平比較

與對照組比較,急性腦梗死組病人血清miR-132[(0.77±0.39)與(1.00±0.38)]和Ang-1[(1.11±0.35)ng/mL與(1.41±0.40)ng/mL]表達水平降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 多因素Logistic回歸分析急性腦梗死發(fā)病的危險因素

以發(fā)生急性腦梗死作為因變量,將單因素分析存在統(tǒng)計學意義的變量納入回歸方程,經多因素Logistic回歸分析,高血壓病史和血清miR-132和Ang-1水平降低是急性腦梗死發(fā)病的危險因素(P<0.05)。詳見表2。

表2 多因素Logistic回歸分析急性腦梗死發(fā)病的危險因素

2.4 急性腦梗死病人血清miR-132和Ang-1表達水平的關系

經Pearson相關性分析,急性腦梗死組病人血清miR-132和Ang-1表達水平呈正相關性(r=0.488,P<0.001)。詳見圖1。

圖1 血清miR-132和Ang-1表達水平的相關性

2.5 急性腦梗死病人血清miR-132和Ang-1表達水平與疾病進展的關系

隨著腦組織梗死面積增加,急性腦梗死病人血清miR-132和Ang-1水平則逐漸降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨著神經功能缺損程度加重,急性腦梗死病人血清miR-132和Ang-1水平則逐漸降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見圖2。

圖2 血清miR-132和Ang-1表達水平與腦梗死面積和神經功能缺損程度的關系

2.6 血清miR-132和Ang-1表達水平對急性腦梗死的診斷價值

經ROC曲線分析顯示,miR-132和Ang-1對急性腦梗死病人與健康人群具有一定的區(qū)分能力。miR-132作為診斷急性腦梗死病人生物標志物的曲線下面積(AUC)為0.835[95%CI(0.762,0.910),P<0.05],敏感度為78.67%,特異度為73.64%;Ang-1作為診斷急性腦梗死病人生物標志物的AUC為0.716[95%CI(0.616,0.735),P<0.05],敏感度為68.50%,特異度為59.60%。詳見圖3。

3 討 論

急性腦梗死屬于局部腦組織缺血性疾病,發(fā)病率、致死率和致殘率均較高,尤其是對于合并高血壓、糖尿病等基礎性疾病病人,急性腦梗死發(fā)病風險均高于健康人群[8]。本研究對納入的105例急性腦梗死病人疾病危險因素進行初步評估,發(fā)現急性腦梗死組中飲酒史比例、高血壓病人比例和糖尿病病人比例均高于對照組,尤其是高血壓是急性腦梗死疾病發(fā)生的獨立危險因素。除此以外,血栓的形成、栓子脫落、血管壁斑塊形成、頸動脈狹窄等都與急性腦梗死的發(fā)生密切相關[9]。急性腦梗死發(fā)病機制復雜,深入闡述急性腦梗死發(fā)病機制對于早期診斷、臨床治療和預后評估都有重大意義。

Astrup等[10]提出了“缺血半暗帶”理論,為日后急性腦梗死的臨床治療提供了理論基礎。由于缺血半暗帶區(qū)域存在大量待激活狀態(tài)的神經元細胞,通過促進側支循環(huán),改善局部病灶組織血流灌注,進而達到改善病人預后的目的。近幾年,逐漸有學者提出了“神經血管單元”的概念,由神經元、膠質細胞、血管內皮細胞、腦細胞外基質等組成,通過信號轉導、偶聯機制等共同參與神經血管重塑[11]。同時多種細胞因子和miRNAs在其中也發(fā)揮著重要作用。血管生成素是一族分泌型的促血管生成因子,主要由血管平滑肌細胞、成纖維細胞、周細胞等血管內皮細胞周圍的支持細胞所分泌,可促使內皮細胞與細胞外基質、內皮細胞間連接,在維持新生血管正常功能與結構的同時,還可以重塑血管,增加分支,增大管徑,促使其成熟[12]。韋俊杰等[13]通過動物實驗證實,Ang-1在急性腦梗死發(fā)病早期呈降低趨勢,缺血后3 d開始升高,持續(xù)時間約2周,該結果表明Ang-1主要參與急性腦梗死的中晚期血管生成。閆薪如等[14]研究表明,Ang-1的表達水平與病情嚴重程度以及90 d預后密切相關。近年來,研究顯示Ang-1可以通過多種途徑改善腦血流灌注,拯救缺血半暗帶神經元,恢復腦缺血后神經功能[15]。在本研究中,急性腦梗死組病人血清Ang-1水平低于對照組,并且隨著腦梗死面積的增加和神經功能缺損程度的加重,急性腦梗死病人血清Ang-1表達水平逐漸降低。說明Ang-1在急性腦梗死發(fā)病初期以及疾病進展過程中都發(fā)揮著重要作用,可以作為急性腦梗死早期診斷的參考指標之一。miRNA表達水平失調與急性腦梗死的發(fā)生、發(fā)展也密切相關,由于多數miRNA位于信號轉導通路的上游,且具有穩(wěn)定的保守序列,組織表達特異性高,因此,有望成為多種疾病的早期診斷指標和治療靶點。其中miR-132位于人第17號染色體,屬于內皮細胞特異性miRNA,可誘導血管新生。陳澎等[5]研究表明,上調miR-132表達可以通過激活 Ang-1/Tie2信號軸促進血管新生,從而改善腦缺血大鼠腦組織缺血性損傷。在本研究中急性腦梗死組病人血清miR-132水平低于對照組,隨著腦梗死面積的增加和神經功能缺損程度的加重,急性腦梗死病人血清miR-132表達水平逐漸降低。推測可能是由于急性腦梗死病人出現急性局灶性腦組織缺血后,miR-132表達量降低可能是抑制Ang-1分泌或生物活性的重要原因。說明miR-132與急性腦梗死病情進展也密切相關。經ROC曲線分析,miR-132和Ang-1都有望成為急性腦梗死診斷的早期生物標志物。但是尚需要進一步擴大樣本量,并對其作用機制進行深入研究。

綜上所述,急性腦梗死病人血清miR-132和Ang-1表達水平均降低,且隨著腦梗死面積的增加和神經功能缺損程度的加重,兩者表達水平逐漸下降,本研究可為選取有望成為急性腦梗死早期輔助診斷指標提供依據,以期為靶向治療藥物的開發(fā)及臨床應用奠定基礎。