何望安,王 茹,朱宏飛,蔡紹乾,魏 丹,余 成,單蘇紅

心肌缺血再灌注損傷是指冠狀動脈部分或完全急性梗阻后,恢復血流反而促使組織損傷加重,甚至出現(xiàn)不可逆損傷的現(xiàn)象。近年來,隨著冠狀動脈介入治療、冠脈搭橋治療以及冠狀動脈溶栓等治療手段的廣泛應用,心肌缺血再灌注損傷所帶來的二次損傷一定程度上影響了治療效果[1]。因此,抑制心肌缺血再灌注損傷已然成為當代臨床亟待解決的關鍵問題之一。目前對于心肌缺血再灌注損傷的防治主要包含缺血預處理和缺血后處理等手段[2],盡管具有一定療效,但仍存在有一定局限性以及副作用等問題,仍需探索新的高效低副作用的藥物。安五脂素源于華中五味子,是組成木脂素重要成分之一,已有研究報道安五脂素對衰老小鼠的心肌損傷具有保護作用[3]。然而安五脂素對心肌缺血再灌注損傷是否也發(fā)揮保護作用未知。針對心肌缺血再灌注損傷治療的關鍵在于救活尚存活的心肌細胞、抑制心肌細胞凋亡,而再灌注損傷補救激酶(RISK)信號通路是細胞存活的關鍵機制之一[4]。RISK信號通路是蛋白激酶B(AKT)和細胞外調節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)信號通路的組合,已有研究表明該通路在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用[5-7]。然而安五脂素能否通過調控RISK信號通路在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮作用未知。鑒于此本研究選取60只SD大鼠開展動物實驗,探究安五脂素通過調控RISK信號通路影響大鼠心肌缺血再灌注損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

60只7～9周齡Sgrague Dawley(SD)大鼠,清潔級,雌雄各半,體質量200～250 g,購自廣州銳格生物科技有限公司,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(粵)2021-0059,使用許可證號:SYXK(粵)2021-0259。

1.1.2 實驗藥物與試劑

安五脂素(購自上海信裕生物科技有限公司,生產(chǎn)批號:XY98539);烏拉坦(購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司,生產(chǎn)批號:U2500);大鼠血漿肌酸激酶(CK)酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)ELISA檢測試劑盒(購自上海研生實業(yè)有限公司,生產(chǎn)批號:YRX300332R、YS-H5426);2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液(購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司,生產(chǎn)批號:HB0268a);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、總核糖核酸(RNA)提取試劑盒[購自生工生物工程(上海)股份有限公司,生產(chǎn)批號:E607318-0200、B511311-0100];AKT、ERK1/2、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、β-肌動蛋白(β-actin)聚合酶鏈反應(PCR)引物(由合肥知恩生物技術有限公司合成);原位末端標記法(TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒(購自瑞士羅氏公司,生產(chǎn)批號:11684817910-POD);二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒(購自博士德生物工程有限公司,生產(chǎn)批號:AR0146);兔抗大鼠AKT、磷酸化(p)-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2、Bcl-2、Bax、β-actin單克隆抗體(一抗),羊抗兔AKT、p-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2、Bcl-2、Bax、β-actin辣根過氧化物酶標記多克隆抗體(二抗)(生產(chǎn)批號:4685S、ab38449、BS6426、ab17942、ab196495、ab53154、ab8227;A0208、QN2742、MBS851214、ALX-810-013-R100、A18415、GOY-D7372、CYB163034)。

1.1.3 實驗儀器

DW-3000型小動物人工呼吸機(購自安徽正華生物儀器設備有限公司);CP1200型床邊監(jiān)護儀(購自上海掌動醫(yī)療科技有限公司);H2100R型高速離心機(購自長沙高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機儀器有限公司);iD5型酶標儀[購自美谷分子儀器(上海)有限公司];LW400LJT型光學顯微鏡(購自上海測維光電技術有限公司);QTOWER2.2型PCR儀(購自德國耶拿)。

1.2 實驗方法

1.2.1 建模、分組及給藥方法

采用隨機數(shù)字表法將60只大鼠分為模型組、假手術組、尼可地爾組及安五脂素低、中、高劑量組,每組10只。根據(jù)既往研究[8]對除假手術組以外各組大鼠構建心肌缺血再灌注模型。腹腔注射烏拉坦(1 g/kg)麻醉各組大鼠,監(jiān)測肢體Ⅱ導聯(lián)心電圖;行人工呼吸機正壓通氣,于左側開胸,暴露心臟及表面血管,結扎冠狀動脈左前降支致其閉塞,結扎30 min后松解結扎線,再灌注120 min;缺血時,心電圖S-T段明顯抬高,松開結扎線后,抬高的S-T段回落,表明心肌再灌注模型構建成功。假手術組大鼠僅開胸、穿線但不結扎。于缺血前10 min向各組大鼠給藥,尼可地爾組予以含尼可地爾100 μmol/L的K-H液1 mL/100 g灌注心肌,安五脂素低、中、高劑量組分別予以含安五脂素1、2、4 mg/kg的K-H液1 mL/100 g灌注心肌,模型組和假手術組僅予以等量K-H液灌注心肌。

1.2.2 各組大鼠CK、LDH水平檢測

再灌注結束后,經(jīng)頸動脈插管取血2 mL,以4 000 r/min(有效離心半徑6.2 cm)離心10 min后取血漿,采用ELISA法檢測各組CK、LDH含量:酶標板包被相應抗體,向酶標板加待測樣品,加生物素標記抗體,孵育,加顯色底物,450 nm處檢測吸光度值。

1.2.3 各組大鼠心肌梗死面積測定方法

采用TTC染色[9]觀察心肌梗死情況。再灌注結束后,自心尖向心底平行于房室溝方向取1/2心臟左室,同樣方向將左室切成1 mm厚度切片,放入1%TTC溶液中孵育10 min,生理鹽水沖洗。因采取全心缺血,整個左室區(qū)域(LV)代表缺血危險區(qū)。掃描切片,采用Image J圖像分析軟件分析,計算梗死區(qū)面積與缺血危險區(qū)面積比值(AN/LV),取平均值。

1.2.4 各組大鼠心肌組織病理變化

HE染色觀察各組大鼠心肌組織病理變化。再灌注結束后,取各組大鼠心肌組織約1 mm×1 mm×1 mm體積組織塊,多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,脫蠟,切片(5 μm),HE染色:蘇木素染色10 min,洗滌,伊紅染色1 min,洗滌,中性樹膠封片,光學顯微鏡下觀察心肌組織病理變化。

1.2.5 各組大鼠心肌細胞凋亡檢測

采用TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡。再灌注結束后,取各組大鼠心肌組織約1 mm×1 mm×1 mm體積組織塊,多聚甲醛固定24 h,常規(guī)脫水、包埋、制成厚度為4 μm切片。切片脫蠟水化。滴加過氧化氫溶液37 ℃孵育30 min,洗滌;滴加蛋白酶K溶液37 ℃孵育10 min,洗滌;制備TUNEL反應混合液,5 μL TdT+45 μL熒光素標記脫氧尿三磷酸(dUTP)液,滴加TUNEL混合液,37 ℃孵育1 h,洗滌。滴加轉化劑-POD,7 ℃孵育30 min,洗滌。滴加DAB底物溶液,終止反應。蘇木素復染切片3 min,水洗,分化,返藍,脫水脫透明封片。陰性對照僅滴加熒光素標記dUTP液,其余步驟同上。光學顯微鏡觀察細胞凋亡情況,正常心肌細胞被染成藍色,凋亡心肌細胞被染成棕褐色。每組3張切片,每張切片隨機選取10個視野計算心肌細胞凋亡率,取平均值。心肌細胞凋亡率=染色陽性心肌細胞數(shù)/總心肌細胞數(shù)×100%。

1.2.6 各組大鼠心肌組織AKT、ERK1/2、Bcl-2、Bax mRNA表達檢測

實時-逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測大鼠心肌組織待測基因mRNA表達。取大鼠心肌組織100 mg,提取心肌組織中總RNA,核酸蛋白檢測儀檢測純度為1.8～2.0合格。逆轉錄合成互補脫氧核糖核酸,進行PCR反應,反應條件:95 ℃預變性5 min,94 ℃變性30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,循環(huán)30次,72 ℃終末延伸7 min。所需引物序列見表1。本研究選取β-actin作為內(nèi)參,以2-ΔΔCt表示待基因相對表達量[10]。

表1 PCR所需引物序列

1.2.7 各組大鼠心肌組織AKT、ERK1/2、Bcl-2、Bax蛋白表達及p-AKT、p-ERK1/2水平檢測

采用蛋白質免疫印跡法(Western Blot)檢測大鼠心肌組織AKT、ERK1/2、Bcl-2、Bax蛋白表達及p-AKT、p-ERK1/2水平。取心肌組織100 mg,加組織裂解液,剪碎組織,勻漿,14 000 r/min(有效離心半徑6.2 cm)離心20 min,取上清液,二喹啉甲酸法(BCA)檢測蛋白濃度,調整蛋白終濃度為10 μg/μL,每組上樣3 μL,電泳,轉膜,一抗(稀釋倍數(shù)1∶500)孵育過夜,辣根過氧化物酶標記二抗(稀釋倍數(shù)1∶1 000)標記孵育1 h,顯色,Image-ProPlus圖像分析關鍵分析蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 建模情況

與假手術組比較,模型組大鼠結扎冠狀動脈左前降支30 min后,心電圖S-T段明顯抬高,松開結扎線再灌注120 min后抬高的S-T段回落。

2.2 各組大鼠血漿心肌酶和心肌梗死區(qū)面積/缺血危險區(qū)面積比較

與假手術組比較,模型組CK和LDH含量、AN/LV顯著升高(P<0.01);與模型組比較,尼可地爾組和安五脂素低、中、高劑量組CK和LDH含量、AN/LV降低差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01);且以上指標在尼可地爾組與安五脂素低劑量組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),在安五脂素低、中、高劑量組間呈劑量依賴性(P<0.05)。詳見表2、圖1。

圖1 各組大鼠心肌AN/LV比較

表2 各組大鼠CK、LDH含量比較 單位:U/mL

2.3 各組大鼠心肌組織病理改變和心肌細胞凋亡率比較

假手術組心肌細胞正常;與假手術組比較,模型組心肌細胞邊緣基本消失,紋理變亂,明顯存在紅細胞進入現(xiàn)象,心肌細胞凋亡率上升(P<0.01);與模型組比較,尼可地爾組和安五脂素低劑量組心肌細胞損傷減輕、細胞略變完整、細胞邊界變清晰、紅細胞減少、心肌細胞凋亡率下降(P<0.01),安五脂素中劑量組心肌細胞損傷進一步減輕、細胞更完整、細胞邊界更清晰、紅細胞進一步減少、心肌細胞凋亡率下降(P<0.01),安五脂素高劑量組心肌細胞損傷程度最小、細胞完整性邊界清晰度趨于正常、心肌細胞凋亡率下降(P<0.01);尼可地爾組和安五脂素低劑量組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);安五脂素3個劑量組呈劑量依賴性。詳見圖2～圖4。

圖4 各組大鼠心肌細胞凋亡率比較

2.4 各組大鼠心肌組織AKT、ERK1/2、Bcl-2、Bax的mRNA表達比較

與假手術組比較,模型組AKT、ERK1/2、Bcl-2 mRNA表達降低(P<0.01),Bax mRNA表達上升(P<0.01);與模型組比較,尼可地爾組和安五脂素3個劑量組AKT、ERK1/2、Bcl-2 mRNA表達升高,Bax mRNA表達降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01);上述指標尼可地爾組和安五脂素低劑量組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);上述指標安五脂素3劑量組呈劑量依賴性。詳見表3。

表3 各組大鼠心肌組織AKT、ERK1/2、Bcl-2、Bax mRNA相對表達量

2.5 各組大鼠心肌組織AKT、ERK1/2、Bcl-2、Bax蛋白表達及p-AKT、p-ERK1/2水平比較

與假手術組比較,模型組p-AKT、p-AKT/AKT、p-ERK1/2和p-ERK1/2/ERK1/2水平、Bcl-2蛋白表達降低,Bax蛋白表達升高(P<0.01);與模型組比較,尼可地爾組和安五脂素3個劑量組p-AKT、p-AKT/AKT、p-ERK1/2和p-ERK1/2/ERK1/2水平、Bcl-2蛋白表達升高,Bax蛋白表達降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01);AKT和ERK1/2在所有組內(nèi)差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05);上述指標尼可地爾組和安五脂素低劑量組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);p-AKT、p-AKT/AKT、p-ERK1/2和p-ERK1/2/ERK1/2水平、Bcl-2安五脂素3個劑量組呈劑量依賴性。詳見圖5、表4。

表4 各組大鼠心肌組織AKT、ERK1/2、Bcl-2、Bax蛋白表達及p-AKT、p-ERK1/2水平

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷的病理機制主要包含自由基損傷、細胞凋亡、鈣超載和血管內(nèi)皮損傷等[11]。目前,臨床治療主要包含缺血前治療和缺血后治療[12],雖然具有顯著療效,然而因無法預知急性或意外心肌梗死,所以使得當前治療具有局限性,故尋找更加高效合理的治療方式對于心肌缺血再灌注損傷治療具有重要意義。

本研究結果顯示,與假手術組比較,模型組大鼠心肌缺血后心電圖S-T段明顯抬高,再灌注后抬高的S-T段回落,與既往研究[13]模型構建結果一致,證明本研究模型構建成功。有研究報道S-T段抬高型心肌梗死病人中早期應用尼可地爾可降低再灌注損傷的發(fā)生率[14],故本研究選取尼可地爾作為陽性藥物,確保研究的準確性和嚴謹性。本研究結果顯示,與假手術組比較,模型組CK和LDH含量、AN/LV、心肌細胞凋亡率升高,心肌細胞邊緣基本消失,紋理變亂,明顯存在紅細胞進入現(xiàn)象;與模型組比較,尼可地爾組和安五脂素3個劑量組CK和LDH含量、AN/LV均不同程度降低,心肌細胞損傷逐漸減輕,細胞逐漸變完整,細胞邊界逐漸變清晰,存在的紅細胞逐漸減少,心肌細胞凋亡率減少,證明安五脂素可有效下調CK和LDH含量,減少心肌梗死面積,抑制心肌細胞凋亡,改善心肌組織損傷病理情況。有報道指出安五脂素可促進細胞抗凋亡蛋白Bcl-2表達,抑制促凋亡蛋白Bax表達,抑制肝組織損傷[15],據(jù)此推測安五脂素可能通過調控Bcl-2和Bax表達,抑制心肌缺血再灌注損傷。

本研究結果顯示,與假手術組比較,模型組AKT和ERK1/2 mRNA、Bcl-2mRNA和蛋白表達、p-AKT、p-AKT/AKT、p-ERK1/2和p-ERK1/2/ERK1/2水平降低,Bax mRNA和蛋白表達上升;與模型組比較,尼可地爾組和安五脂素3個劑量組AKT和ERK1/2 mRNA、Bcl-2 mRNA和蛋白表達、p-AKT、p-AKT/AKT、p-ERK1/2和p-ERK1/2/ERK1/2水平上升,Bax mRNA和蛋白表達下降。分析結果表明安五脂素可促進AKT和ERK1/2 mRNA、Bcl-2表達,上調p-AKT、p-AKT/AKT、p-ERK1/2和p-ERK1/2/ERK1/2水平,抑制Bax表達發(fā)揮保護作用。RISK通路主要由磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT和ERK1/2組合而成,兩條通路的激活可減小心肌梗死面積。已有研究證明缺血前適應以及缺血后適應均可激活RISK通路,在保護心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用[16-17]。AKT磷酸化后被激活,向下游傳遞信號,調節(jié)生命過程;ERK有兩個亞型,ERK1和ERK2,有研究表明當機體受到心肌缺血再灌注損傷刺激時p-AKT和p-ERK在該過程發(fā)揮重要作用[18]。心肌缺血再灌注損傷引發(fā)心肌細胞死亡,抑制心肌細胞凋亡可減輕心肌缺血再灌注損傷[19]。Bcl-2和Bax分別為抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白,兩者均為AKT和ERK1/2信號通路的下游分子,在線粒體介導的細胞凋亡過程中發(fā)揮重要的調控作用[20]。Yi等[21]指出下調p-AKT水平可促進心肌缺血再灌注損傷,而促進Bcl-2表達、抑制Bax表達可抑制細胞凋亡發(fā)揮對心肌缺血再灌注損傷的保護作用;李雯娜等[22]指出上調p-AKT和p-ERK1/2水平可減輕心肌缺血再灌注損傷;孔嫦娥等[23]研究顯示上調p-AKT和p-ERK1/2水平可減輕心肌缺血再灌注損傷。本研究與前述研究結果一致,提示安五脂素可能通過促進AKT、ERK1/2表達,上調p-AKT、p-ERK1/2水平,促進Bcl-2表達,抑制Bax表達發(fā)揮保護作用。

綜上所述,安五脂素可抑制心肌缺血再灌注損傷,可能通過調節(jié)RISK信號通路,促進AKT和ERK1/2表達,上調p-AKT和p-ERK1/2水平,促進Bcl-2表達,抑制Bax表達發(fā)揮保護作用,安五脂素可通過調控RISK信號通路抑制心肌缺血再灌注損傷。