王子焱,范金茹,范建民,周 婕,李 蘇

高血壓是指以體循環(huán)動脈壓升高為特征的循環(huán)系統(tǒng)疾病。一項對我國31個省、自治區(qū)、直轄市的179 873名年齡≥18歲常住居民的調(diào)查顯示,高血壓患病率為27.5%[1],且我國高血壓患病率呈上升趨勢,預(yù)估我國成人高血壓患病人數(shù)為2.45億人[2]。高血壓是心血管病的獨立危險因素[3],能夠?qū)е卵芎托呐K等靶器官損害,使得心血管疾病風(fēng)險增加[4],造成嚴重的社會經(jīng)濟負擔(dān)[5]。因此,控制過高血壓、減輕血壓靶器官損害以及改善心腦血管疾病預(yù)后成為當(dāng)前高血壓防控的重點。目前,高血壓的治療藥物主要有鈣通道阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、血管緊張素受體拮抗劑等6類藥物[6],在高血壓的防控中發(fā)揮了重要作用,然而,這些藥物也存在一些諸如藥物不良反應(yīng)、使用禁忌證、對特殊類型高血壓的血壓控制不佳等問題[7]。高血壓屬于中醫(yī)學(xué)“眩暈”“風(fēng)眩”范疇?，F(xiàn)代研究證實中醫(yī)藥對于治療高血壓具有一定療效,且能夠降低高血壓導(dǎo)致的不良心血管事件風(fēng)險[8-9]。因此,發(fā)揮中醫(yī)藥特色對于防控高血壓具有重要意義。

王行寬教授為首屆全國名中醫(yī),學(xué)驗俱豐,主張“雜病治肝、多臟調(diào)燮、綜合治理”和“善用經(jīng)方、不乏驗方、用藥平和、易于效仿”,臨床尤精診治心腦血管疾病。平肝煎為王行寬教授經(jīng)驗方,由天麻、鉤藤、白蒺藜、石決明組成,現(xiàn)代研究表明天麻能夠通過直接干預(yù)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)或通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)間接抑制RAAS,調(diào)節(jié)血管張力,抑制血管炎癥物質(zhì)的釋放等途徑降血壓[10-12];鉤藤能夠通過改善維生素和氨基酸代謝,擴張血管和組織外源鈣離子內(nèi)流等途徑降低血壓[13-15];白蒺藜通過抑制心室肌中心肌轉(zhuǎn)化生長因子和結(jié)締組織生長因子的表達及改善腸道菌群等[16-17]途徑降低血壓;石決明可能通過下調(diào)血漿血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、血清醛縮酶(ALD)含量,上調(diào)血漿一氧化氮(NO)水平以發(fā)揮降壓作用[18]。然而,平肝煎組方降壓的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以基于靶分子、生物功能和生物活性化合物生成復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò),并能從分子水平上系統(tǒng)地闡明中醫(yī)藥的作用機制,符合中醫(yī)藥整體論治策略[19],故本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接策略探討王行寬教授治療高血壓核心處方機制與通路,以期系統(tǒng)、全面闡釋其物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制。

1 資料與方法

1.1 化學(xué)成分與靶點的搜集

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP,http://lsp,nwu.edu.cn/tcmsp.php)、本草組鑒數(shù)據(jù)庫(HERB,http://herb.ac.cn/)搜尋藥物成分,設(shè)置口服利用度(oral availability,OB)≥30%、類藥性(drug likeness,DL)≥0.18,得到有效成分后通過其MOL.ID號搜尋單味藥成分作用靶點。同時,運用BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)、pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫獲得化合物,通過SMILES(Simplified Molecular Input Line Entry System)導(dǎo)入到結(jié)構(gòu)相似度預(yù)測靶點數(shù)據(jù)庫SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch)預(yù)測靶點。利用全球蛋白質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫(UniProt,http://www.uniprot.org/)下載化合物Excel數(shù)據(jù)表格,運用“TRIM”函數(shù)優(yōu)化數(shù)據(jù),使用“VLOOKU”函數(shù)匹配靶點基因名。并通過查閱文獻補充未匹配到的基因名稱。最后將通過以上方法得到的化學(xué)成分的相關(guān)靶點蛋白利用Uniprot(https://www.uniprot.org)數(shù)據(jù)庫進行注釋。

1.2 藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)分析

準備化合物基因“network”文件和type文件,運用Cytoscape 3.8.2軟件,導(dǎo)入相關(guān)文件,進行網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析,根據(jù)度值(Degree值)調(diào)整靶點圖形、顏色、透明度和大小,構(gòu)建“藥物-中藥成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 疾病靶點的預(yù)測

運用人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards,https://www.genecards.org/)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM,https://www.omim.org/)、藥物數(shù)據(jù)庫(DrugBank,https://go.drugbank.com/)平臺獲取疾病相關(guān)靶點,疾病名稱取“hypertension”為關(guān)鍵詞搜索高血壓疾病相關(guān)靶點。設(shè)置對象為“human”,使用“VLOOKUP”函數(shù)匹配靶點基因名,篩選藥物和疾病交集基因。

1.4 關(guān)鍵靶點的獲取

應(yīng)用Venny(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)軟件獲取中藥活性化合物作用靶點與高血壓相關(guān)靶點的交集靶點,作為中藥復(fù)方治療高血壓的潛在靶點。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)拓撲分析

通過生物分子功能注釋系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(STRING,https://string-db.org/)導(dǎo)入交集基因,設(shè)置對象為“homo sapiens”,取最高置信度0.900,隱藏游離基因節(jié)點,得到蛋白互作關(guān)系。結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件中,選擇“network analyzer”,得到網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)參數(shù)。介度中心值(betweenness centrality,BC)最短路徑穿過單個節(jié)點的次數(shù),緊密中心值(closeness centrality,CC)是節(jié)點間溝通的難易程度。把Degree值的二倍中位數(shù)以上,BC和CC的中位數(shù)上作為衡量標(biāo)準篩選中藥與疾病的核心成分靶點,并制作PPI網(wǎng)絡(luò)互作圖。

1.6 基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析

通過Metascape(http://metascape.org/)平臺進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,將所得交集靶點導(dǎo)入基因列表中,設(shè)置對象為“human”,選擇個性化分析,設(shè)置最小重疊(min overlap)為3、P值取0.05、最低濃縮度為1.5,得到結(jié)果后,制作GO氣泡圖和KEGG通路圖。運用R軟件對靶點進行GO、KEGG富集分析。將關(guān)鍵靶點導(dǎo)入R軟件,采用clusterProfiler進行富集分析。GO是注釋基因和分析這些基因的生物學(xué)過程的主要生物信息學(xué)工具。KEGG是用于從高通量實驗技術(shù)產(chǎn)生的大規(guī)模分子數(shù)據(jù),可集中了解高級功能和生物系統(tǒng)。為了分析藥材的功能,設(shè)置P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.7 分子對接

對平肝煎治療高血壓的排名靠前的主要候選化合物與核心靶點進行分子對接驗證。蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)由蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(RCSB PDB,https://www.rcsb.org/)獲取。對接小分子庫由TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)通過搜索中藥獲取并建立。首先,使用AutoDock Tools 1.5.6對蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)進行去水、加氫操作,并進行受體結(jié)構(gòu)準備工作。使用Open Babel及AutoDock程序?qū)π》肿訋爝M行拆分等準備工作。對接使用AutoDock程序進行,最終將結(jié)果導(dǎo)入Pymol進行對接結(jié)果的可視化分析。

2 結(jié) 果

2.1 中藥有效成分篩選及基因名的轉(zhuǎn)換

經(jīng)TCMSP數(shù)據(jù)庫,以O(shè)B≥30%及DL≥0.18為標(biāo)準得到中藥成分30個,刪除未匹配到靶點的成分后得到26個,查閱文獻發(fā)現(xiàn),低于標(biāo)準值的部分成分藥理作用強烈,也納入結(jié)果之中,最后得到鉤藤18個、白蒺藜4個,通過HERB數(shù)據(jù)庫得到天麻相關(guān)成分4個、石決明相關(guān)成分4個,最后共得到相關(guān)作用靶點751個,去除重復(fù)值后,得到387個藥物作用靶點。詳見表1。

表1 部分中藥成分-靶點

2.2 疾病靶點及其與藥物作用靶點交集基因的獲取

經(jīng)GeneCards、OMIM、DurgBank平臺獲取高血壓疾病靶點10 259個,其中最大評分為94.51分,最小評分為0.14分。對所得數(shù)據(jù)卡兩次中位數(shù),最后得到9 095個疾病靶點。中藥靶點和疾病靶點取交集,刪除重復(fù)值,得到交集基因279個。詳見圖1。

圖1 中藥-疾病靶點韋恩圖

2.3 構(gòu)建中藥成分-靶點網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵化合物篩選

將基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件,得到中藥成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖,共421個節(jié)點(nodes)、730條邊(edges),根據(jù)Degree值得到排名居前3位的化合物為大黃素、槲皮素、山柰酚。詳見表2。網(wǎng)絡(luò)圖見圖2。

圖2 中藥有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

表2 Degree值排名居前3位的化合物

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)制作與核心蛋白的獲取

經(jīng)STRING平臺分析隱藏游離節(jié)點后得到247個節(jié)點、1 110條邊,平均節(jié)度點為9.28。下載TSV文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2后經(jīng)網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析,把Degree值的二倍中位數(shù)以上,BC和CC的中位數(shù)上靶點作為中藥復(fù)方的核心作用靶點。居前5位的靶點基因分別為蛋白激酶B1(AKT1)、腫瘤蛋白P53(TP53)、腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素6(IL-6)、Jun原癌基因(JUN)。隨著Degree值和連接分數(shù)的增高,節(jié)點的形狀越大,顏色越鮮明、線條越粗,蛋白的地位也就越重要。詳見圖3。

圖3 平肝煎PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO與KEGG通路富集分析

經(jīng)Metascape平臺分析,GO分析結(jié)果獲得生物過程(biological processes,BP)4 615條,通過logP值和基因數(shù)的百分數(shù)比重新對數(shù)據(jù)進行排名,排名居前為對營養(yǎng)水平的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、對細菌來源分子的反應(yīng)、對藥物的反應(yīng)等。分子功能(molecular function,MF)643條,主要涉及核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、血紅素結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、受體配體活性、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等;細胞成分(cellular components,CC)共118條,主要由膜筏、突觸后膜、受體復(fù)合體、細胞質(zhì)核周區(qū)域、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體等構(gòu)成。提示中藥復(fù)方可能通過調(diào)控細胞核轉(zhuǎn)錄因子、參與脂多糖等反應(yīng)來干預(yù)治療高血壓。詳見圖4。

圖4 GO富集分析

KEGG通路富集分析共得到276條富集結(jié)果(見圖5),主要涉及通路有糖尿病并發(fā)癥中的高級糖基化終末產(chǎn)物-受體信號通路(AGE-RAGR)、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化信號通路、乙型肝炎信號通路、化學(xué)致癌-受體激活信號通路、前列腺癌信號通路等,提示中藥復(fù)方可能通過上述通路調(diào)節(jié)干預(yù)高血壓。

圖5 KEGG通路富集分析

2.6 化合物靶點-核心蛋白分子對接驗證

分子對接結(jié)合熱能<-4.18 kJ/mol表示具有結(jié)合活性,<-20.92 kJ/mol表示結(jié)合活性較好。因此,由AutoDock Tools 1.5.6軟件分子對接結(jié)果可知:拓撲學(xué)參數(shù)排名居第1位的中藥化合物小分子槲皮素與PPI核心蛋白拓撲學(xué)參數(shù)居前5位的大分子受體(AKT1、JUN、TP53、TNF、IL-6)均具有良好的結(jié)合活性,其中槲皮素與AKT1(-29.87 kJ/mol)、TNF(-29.33 kJ/mol)的結(jié)合熱能較低,結(jié)合活性較好。詳見圖6、圖7。

圖6 槲皮素與AKT1分子對接

圖7 槲皮素與TNF分子對接

3 討 論

王行寬教授結(jié)合歷代醫(yī)家的認識及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究進展,將高血壓對應(yīng)“風(fēng)眩”,認為其病在血脈,病機總署陰虛為本、陽亢為標(biāo)[20],治以平肝潛陽,臨證常用平肝煎加減化裁治療高血壓。平肝煎為王行寬教授經(jīng)驗方,由天麻、鉤藤、白蒺藜、石決明組成,本課題組前期研究結(jié)果顯示,王行寬教授診療高血壓病的核心藥物組合即為平肝煎,方中天麻味甘、性平,《本草從新·卷一草部》載天麻可“治諸風(fēng)眩掉”,可平抑肝陽、息風(fēng)止痙,是止眩暈之要藥;鉤藤味甘、性涼,《本草綱目·草部(三)》載主治“頭旋目眩”,既能平肝潛陽,又可兼清肝熱,以防肝陽上亢,郁而化火;白蒺藜性微溫,味辛、苦,可平抑肝陽,又可解郁活血,使肝得疏泄;石決明為質(zhì)重之介類,性味咸寒,可重鎮(zhèn)肝陽,又可涼肝熱、護肝陰。四藥同入肝經(jīng),共同發(fā)揮平肝潛陽之效[21]。

本研究從化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖分析,平肝煎通過大黃素、槲皮素、山柰酚等26個活性成分作用于高血壓相關(guān)的279個靶點,說明平肝煎通過多成分、多靶點協(xié)同發(fā)揮治療高血壓作用。現(xiàn)代研究認為大黃素通過提高超氧化物歧化酶(SOD)活性,降低丙二醛(MDA)含量以其抗氧化應(yīng)激,以發(fā)揮降血壓作用[22]。槲皮素及其代謝物能夠通過抑制血管平滑肌細胞(VSMC)中的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活性發(fā)揮抗氧化作用[23],減少血管超氧化物并改善內(nèi)皮功能以降低血壓,且一項納入7項隨機對照試驗的系統(tǒng)評價和薈萃分析顯示,補充槲皮素在降低血壓方面具有顯著效果[24]。同時山柰酚、槲皮素同屬于黃酮類化合物,山柰酚、槲皮素能夠通過NO/環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)通路和抑制氧化應(yīng)激相關(guān)炎癥生物標(biāo)志物如MDA、SOD改善高血壓[25]。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)的拓撲學(xué)性質(zhì)篩選出平肝煎防治高血壓的5個核心靶點基因,分別為AKT1、TP53、TNF、IL-6、JUN。AKT1是磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號通路下游的主要靶點,主要參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),激活 PI3K/AKT信號通路會導(dǎo)致肺血管內(nèi)壁增厚、肺動脈平滑肌細胞增殖和凋亡[26]。p53是TP53的蛋白產(chǎn)物,p53的表達與細胞凋亡增加有關(guān),miR-31a-5p通過加速動脈平滑肌細胞的增殖和通過靶向TP53抑制細胞凋亡參與高血壓的發(fā)生發(fā)展[27]。TNF、IL-6為人體內(nèi)重要的炎性因子,TNF-α是由多核巨細胞產(chǎn)生的一種細胞因子,具有廣泛的生物活性,不僅具有調(diào)節(jié)機體免疫功能的作用,還可以介導(dǎo)炎癥反應(yīng)過程[28],其中TNF-α可通過分泌內(nèi)皮素-1(ET-1)收縮血管,導(dǎo)致血壓升高;IL-6是一種炎性細胞因子,現(xiàn)有研究表明抑制IL-6使得蛋白酪氨酸激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與激活子3(Janus kinase signal transducers 2 and activator of transcription 3,JAK2/STAT3)信號通路的活性降低,從而減輕AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓[29];JUN是c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號通路的典型靶標(biāo)[30],能夠通過影響細胞的增殖與分化以及細胞凋亡引發(fā)高血壓[31]。GO 富集分析預(yù)測出平肝煎可能通過調(diào)控細胞核轉(zhuǎn)錄因子、參與脂多糖等反應(yīng)來干預(yù)治療高血壓,與以上核心靶點基因引發(fā)高血壓的機制相符合。

KEGG富集分析預(yù)測出平肝煎可能通過糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycosylation end products,AGEs)-糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor of AGEs,RAGE)信號通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化信號通路、乙型肝炎信號通路等調(diào)節(jié)干預(yù)高血壓。AGE-RAGR信號通路可通過TNF-α、NF-κB等炎癥和氧化應(yīng)激因子的上調(diào),從而導(dǎo)致炎癥、內(nèi)皮功能障礙和氧化應(yīng)激,引發(fā)血管硬化,最終導(dǎo)致血壓升高[32-33]。高血壓與動脈粥樣硬化關(guān)系密切,高血壓是動脈粥樣硬化性心血管疾病的主要獨立危險因素[2]。高血壓可能通過誘發(fā)內(nèi)皮功能障礙導(dǎo)致炎癥細胞浸潤,調(diào)節(jié)造血功能,激活交感神經(jīng)系統(tǒng),導(dǎo)致動脈粥樣硬化,使心血管疾病風(fēng)險增加[34],動脈粥樣硬化亦會導(dǎo)致高血壓情況加重[35]。

分子對接結(jié)果顯示,拓撲學(xué)參數(shù)排名居第1位的槲皮素與PPI核心蛋白拓撲學(xué)參數(shù)居前5位的大分子受體(AKT1、JUN、TP53、TNF、IL-6)均具有良好的結(jié)合活性,其中槲皮素與TNF(-29.33 kJ/mol)、AKT1(-29.87 kJ/mol)的結(jié)合熱能較低,結(jié)合活性較好。研究表明槲皮素能夠降低血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換酶(ACE)活性、AngⅡ和TNF-α以發(fā)揮降壓作用,而槲皮素調(diào)控AKT1信號通路以發(fā)揮降壓作用的機制目前尚少有相關(guān)文獻報道,有待于進一步實驗驗證。

綜上所述,平肝煎可能通過抗炎、抗氧化應(yīng)激、改善血管內(nèi)皮功能、調(diào)節(jié)機體免疫方面發(fā)揮平肝潛陽之效,以達到降壓效果。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù),探討了平肝煎通過多靶點、多通路協(xié)同作用于高血壓病的網(wǎng)絡(luò)機制,并通過分子對接技術(shù)對相關(guān)領(lǐng)域進行驗證,發(fā)現(xiàn)槲皮素是其發(fā)揮降壓作用的潛在分子基礎(chǔ),對于后期開展平肝煎治療高血壓病的機制研究以及為臨床用藥提供了理論基礎(chǔ)。