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        電針對支氣管哮喘小鼠肺功能及孤束核神經(jīng)元放電的影響

        2023-11-23 03:15:52吳昊晟蘇航朱超吳生兵崔帥周美啟
        上海針灸雜志 2023年11期
        關鍵詞:肺經(jīng)氟烷電針

        吳昊晟,蘇航,朱超,吳生兵,崔帥,周美啟,3

        (1.安徽中醫(yī)藥大學,合肥 230012;2.新安醫(yī)學教育部重點實驗室,合肥 230012;3.安徽省中醫(yī)藥科學院,合肥 236800)

        支氣管哮喘(bronchial asthma,BA)簡稱哮喘,是一種嗜酸性粒細胞炎性疾病[1],以反復發(fā)作的喘息、氣促、胸悶和(或)咳嗽為主要臨床表現(xiàn)[2]。根據(jù)2019年中國肺健康研究調(diào)查結(jié)果[3]顯示中國患者總數(shù)已有4 570 萬,超過20 歲人群哮喘患病率為4.2%,因此哮喘仍然是世界范圍內(nèi)亟待解決的社會公共衛(wèi)生問題。有研究[4-5]表明針刺能夠有效改善BA 的氣道高反應性、黏液分泌過多和炎癥水平。課題組前期研究[6]發(fā)現(xiàn),針刺肺經(jīng)五輸穴對于BA 有著良好的治療作用,特別是肺經(jīng)經(jīng)穴太淵能夠有效改善小鼠肺功能,緩解哮喘癥狀。

        目前,針灸普遍被認為是基于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用的,特別是從腦神經(jīng)科學入手研究針刺的作用機制是目前的主要方向[7]。特定的中樞核團在針刺過程中與調(diào)節(jié)大腦神經(jīng)功能網(wǎng)絡密切相關,課題組前期發(fā)現(xiàn),針刺可以通過調(diào)節(jié)孤束核的放電頻率改變迷走神經(jīng)活動,從而發(fā)揮治療作用[8]。孤束核(nucleus tractus solitarius,NTS)是內(nèi)臟初級傳入纖維的中繼核團,并且與腦組織許多特定區(qū)域有著密切的纖維投射,近年來研究[9-10]發(fā)現(xiàn),NTS 存在中樞呼吸化學感受器神經(jīng)元。但是目前針刺關于肺腦相關的研究較少,尚缺乏針刺通過中樞核團改善肺臟疾病的實驗依據(jù)?;谶@些研究,提出NTS 可能參與電針肺經(jīng)改善支氣管哮喘的科學假說。本研究通過復制小鼠支BA 模型,以探討NTS 在電針肺經(jīng)改善BA 中的作用,亦為肺經(jīng)-肺臟相關與腦聯(lián)系提供實驗依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物

        BALB/c 雌性小鼠45 只,體質(zhì)量(20±2)g,在安徽中醫(yī)藥大學科研中心動物飼養(yǎng)中心隔離籠具中適應性飼養(yǎng) 1 周,籠內(nèi)溫度控制在 18~22 ℃,濕度為(55±2)%,固定晝夜時間12 h 照明,自由獲得食物和水,保證充足的活動范圍。實驗小鼠均購自杭州子源實驗動物科技有限公司,生產(chǎn)許可證號為SCXK(浙)2019-0004,本實驗開展前通過安徽中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準(AHUCM-mouse-2022042),實驗中嚴格遵循中華人民共和國科技部2006年頒發(fā)的《關于善待實驗動物的指導性意見》相關規(guī)定對動物進行處理。

        1.2 主要試劑與儀器

        卵清蛋白(AP0028,Sigma);氫氧化鋁(MB0215,美倫生物);異氟烷(R510-22-16,瑞沃德);蘇木素(BA4097,貝索試劑);伊紅(BA4099,貝索試劑);三溴乙醇(T48402,Sigma);乙酰甲膽堿(C6694,APExBIO,美國);小鼠IL-1β試劑盒(MAN0017504,Thermo Fisher Scientific);超聲霧化吸入器(江蘇魚躍);華佗牌SDZ-Ⅳ型電子針灸儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);氣麻機(瑞沃德);肺功能分析系統(tǒng)(AniRes2005,北京貝蘭博);腦立體定位儀(瑞沃德);微絲電極(plexon);在體多通道信號記錄處理系統(tǒng)(plexon)。

        1.3 模型制備

        將45 只BALB/c 雌性小鼠按隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組和電針組,每組15 只。通過在第0 天和第7 天腹腔注射卵清蛋白(20 μg)和氫氧化鋁(2 mg)混合的致敏液0.2 mL,從第14 天開始連續(xù)7 d 以1%濃度卵清蛋白生理鹽水混合液霧化30 min建立支氣管哮喘小鼠模型[6],詳見圖1。以霧化激發(fā)時出現(xiàn)噴嚏咳嗽、呼吸急促和抓耳撈腮等表現(xiàn),肺組織和支氣管HE染色呈現(xiàn)支氣管攣縮,肺泡腔塌陷,肺泡隔增厚,上皮細胞部分脫落,肺泡間隙有紅細胞滲出和明顯炎性細胞浸潤為造模成功[6]。

        圖1 模型制備和干預方式流程圖

        1.4 干預方法

        空白組和模型組,每日正常抓取并以1%異氟烷維持麻醉20 min,不予其他干預,每日1 次,連續(xù)7 d。電針組,穴位取太淵和列缺,根據(jù)《實驗動物常用穴位名稱與定位第3 部分:小鼠》[11]定位,太淵位于腕橫紋之橈側(cè)凹陷中,列缺位于太淵穴近心端約2 mm 處,詳見圖2。小鼠以3%異氟烷誘導麻醉后,以1%異氟烷維持,局部皮膚消毒后進行針刺干預,以一次性針灸針于小鼠左右腕部各刺入2根毫針,間隔2 mm,直刺深度1 mm,將針柄與電針儀相連,同側(cè)兩根針連接在1 組電極,連續(xù)波,頻率2 Hz,電流強度1 mA,留針20 min,每日1 次,連續(xù)干預7 d。

        圖2 太淵和列缺穴定位及電針示例圖

        1.5 指標檢測

        3 組小鼠在干預結(jié)束后隨機選取進行指標檢測,15 只小鼠中6 只小鼠僅進行肺功能檢測,6 只進行電生理檢測,電生理信號采集后小鼠與其余存活小鼠5%異氟烷麻醉后處死,取肺組織左上葉進行病理形態(tài)檢查,取其余肺葉進行免疫因子含量測定。

        1.5.1 觀察肺組織和支氣管病理形態(tài)

        3 組小鼠5%異氟烷麻醉后處死,取肺組織左上葉保存在4%多聚甲醛溶液中固定,按照蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色步驟進行常規(guī)固定、脫水、透明、石蠟包埋、切片,行HE 染色,在400 倍光學顯微鏡下觀察各組小鼠支氣管、肺組織形態(tài)學變化,選取相同位置拍片。

        1.5.2 測定肺組織中IL-1β含量

        3 組小鼠5%異氟烷麻醉處死后取其余肺葉,冰水浴條件下,機械勻漿,制備成 10% 的勻漿液,2 500~3 000 r/min,離心10 min,取上清液,參照酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒指導說明加樣、抗體孵育,在酶標儀450 nm 處測量吸光度值(OD 值),繪制標準曲線,并計算各組小鼠肺組織中IL-1β含量。

        1.5.3 肺功能檢測

        3 組小鼠用1.25%三溴乙醇麻醉后鈍性分離氣管和頸外靜脈,進行氣管插管和頸外靜脈插管并連接呼吸機,待基線穩(wěn)定后按小鼠體質(zhì)量依次遞增給藥,0、10、20、40、80 μg/kg 乙酰甲膽堿(0.0016 g乙酰甲膽堿溶于100 mL 生理鹽水中配成16 μg/mL 的溶液,依次取一定量溶液加等量生理鹽水稀釋,分別配成8、4、2 μg/mL 的藥品),每只小鼠每次注射0.1 mL不同濃度激發(fā)間隔3 min,使用AniRes2005 動物肺功能分析系統(tǒng)記錄激發(fā)時的呼吸阻力(resistance of lung,RL)和肺順應性(dynamic compliance,Cdyn)。

        1.5.4 孤束核神經(jīng)元放電信號的采集與處理

        3 組小鼠以1%濃度異氟烷麻醉,小鼠呈俯臥位,調(diào)節(jié)耳桿將小鼠頭顱固定于腦立體定位儀上。頭部充分消毒備皮,沿正中頭皮剪開,暴露顱骨平面,根據(jù)十字縫與人字縫定位前后囟位置,前后調(diào)平,再進行左右調(diào)平。參照小鼠腦立體定位圖譜,詳見圖3,標記目標核團NTS 坐標,選用合適鉆頭開骨洞并安裝顱骨釘,再于目標核團位置開一個足以容納微絲電極的骨窗,挑硬腦膜。 安裝微絲電極緩慢移至目標區(qū)域(Bregam -6.83 mm,LR 1 mm,H 4.5 mm)上方,緩慢以0.02 mm/20 s 速度下電極,至NTS 位置時記錄神經(jīng)元放電情況,再通過Offline Sorter、Neuro Explor等軟件統(tǒng)計NTS 神經(jīng)元的單位時間放電頻率和頻譜能量。

        圖3 小鼠NTS 腦立體定位圖譜

        1.6 統(tǒng)計學方法

        所有數(shù)據(jù)采用SPSS26.0 軟件進行分析處理,通過Graphpad Prism8.0 軟件對分析結(jié)果進行統(tǒng)計圖表繪制。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示,比較采用one-way ANOVA 和Pearson 相關系數(shù)進行統(tǒng)計分析;不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)比較采用非參數(shù)檢驗。以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果

        2.1 3 組小鼠行為狀態(tài)比較

        空白組一般生長狀況持續(xù)保持良好,毛發(fā)質(zhì)感柔順、色澤明亮,呼吸順暢,未見喘息哮鳴等呼吸道異樣癥狀。模型組在霧化激發(fā)時,較空白組開始出現(xiàn)明顯的噴嚏、咳嗽、呼吸急促、抓耳撈腮等表現(xiàn)。電針組較模型組呼吸喘促、噴嚏咳嗽聲減輕,精神狀態(tài)也有顯著改善。

        2.2 3 組小鼠肺組織和支氣管結(jié)構比較

        通過HE 染色觀察顯示,空白組肺組織與支氣管細胞結(jié)構完整,排列整齊,無明顯異常表現(xiàn);模型組較空白組而言,可見支氣管攣縮,上皮細胞部分脫落,分泌物增加,肺泡腔塌陷,肺泡隔增厚,肺泡間隙有紅細胞滲出和明顯炎性細胞浸潤;電針組支氣管痙攣改善,上皮細胞脫落有所緩解,分泌物減少,肺泡腔塌陷程度較模型組減輕,肺泡隔稍有變薄,肺泡間隙炎性細胞浸潤緩解。詳見圖4。

        2.3 3 組小鼠肺組織內(nèi)IL-1β含量比較

        通過ELISA 檢測IL-1β含量顯示,模型組肺組織內(nèi)IL-1β表達水平較空白組明顯升高(P<0.05);電針組IL-1β表達水平較模型組明顯降低(P<0.05)。詳見圖5。

        2.4 3 組小鼠肺功能比較

        以濃度遞升的乙酰甲膽堿溶液激發(fā)時,與空白組比較,模型組各濃度RL 均呈現(xiàn)顯著增高(P<0.05),且模型組RL 呈現(xiàn)劑量依賴性增高的趨勢;與模型組比較,電針組RL 顯著降低(P<0.05)。詳見圖6。

        與空白組比較,模型組各濃度Cdyn 均呈現(xiàn)顯著降低(P<0.05),且模型組Cdyn 呈現(xiàn)劑量依賴性降低的趨勢;與模型組比較,電針組 Cdyn 均顯著改善(P<0.05)。詳見圖7。

        2.5 3 組小鼠NTS 電生理比較

        模型組NTS 內(nèi)神經(jīng)元平均每秒峰電位放電頻率與空白組相比較明顯密集(P<0.05);電針組NTS 神經(jīng)元平均每秒峰電位放電頻率與模型組相比較明顯降低(P<0.05)。通過頻譜能量圖顯示,與空白組比較,模型組頻譜能量圖顏色更鮮艷,強度有所增加;與模型組比較,電針組頻譜能量強度有所減弱。詳見圖8。

        2.6 NTS 放電頻率與IL-1β和RL 呈正相關

        將NTS 放電頻率與IL-1β水平和RL 進行Pearson相關性分析。結(jié)果表明,放電頻率與IL-1β水平呈正相關(R=0.5678,P=0.0140<0.05)。放電頻率與RL 呈正相關(R=0.7852,P=0.0001<0.05)。詳見圖9。

        圖9 NTS 放電頻率與IL-1β和RL 呈正相關(±s,n=6)

        3 討論

        支氣管哮喘(BA)作為一種氣道慢性炎癥,西醫(yī)通常使用糖皮質(zhì)激素、白三烯受體拮抗劑、β2 受體激動劑[12-14]等藥物治療,這些藥物長期使用,存在較大不良反應。該病屬于中醫(yī)學“哮證”“喘證”等范疇,中醫(yī)學認為肺主氣、司呼吸?!鹅`樞·經(jīng)脈》示“是動則病,肺脹滿,膨膨而咳喘”“是主肺所生病者,咳,上氣,喘喝”,表明肺經(jīng)主治喉、胸、肺有關疾病,電針肺經(jīng)改善支氣管哮喘有充足的理論依據(jù)。

        目前研究[15]表明支氣管哮喘的發(fā)病機制與炎性細胞浸潤、氣道高反應性以及神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡等關系密切。IL-1β作為支氣管哮喘未來惡化風險的預測因子[15],細胞炎癥水平和Th2 上游細胞因子均依賴于IL-1β信號的傳導[16],發(fā)病時會引起IL-1β等炎性因子水平迅速上升。支氣管哮喘氣道高反應性通常表現(xiàn)為起到對刺激產(chǎn)生較明顯的氣道收縮反應,導致氣道阻力顯著增加[17-18],使患者呼吸困難。本研究結(jié)果表明,電針肺經(jīng)太淵、列缺能夠有效降低炎性因子IL-1β水平,也可以改善肺功能狀況,有效降低呼吸阻力和提高肺順應性。

        經(jīng)脈臟腑與腦相關是目前針灸研究的熱門話題,心腦相關[19-20]已有了許多研究成果,但在肺經(jīng)-肺臟與腦相關方面研究相對較少。根據(jù)目前對于NTS 的研究,有學者[21-22]發(fā)現(xiàn)NTS 在咳嗽的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用,BASSI M 等[23]研究證實了NTS 是瘦素促進呼吸反應的作用部位,諸多研究表明NTS 對維持肺臟的結(jié)構及功能至關重要,可能與肺臟疾病存在一定的聯(lián)系。使用在體電生理記錄系統(tǒng)可以有效記錄指定核團內(nèi)的群體神經(jīng)元峰電位活動變化情況,本研究利用該技術記錄NTS 內(nèi)神經(jīng)元峰電位放電情況,為肺經(jīng)-肺臟與腦相關提供了一定的神經(jīng)電生理學的依據(jù)。NTS 可能是電針肺經(jīng)改善支氣管哮喘的一個新的關鍵中樞核團。本實驗中,小鼠支氣管哮喘后,NTS 神經(jīng)元平均每秒放電頻率上調(diào),相關學者[24]在靈長類動物的研究結(jié)果與本研究基本一致,他們發(fā)現(xiàn)靈長類動物哮喘模型中NTS 神經(jīng)元內(nèi)在興奮性增加。電針肺經(jīng)干預后,可降低支氣管哮喘所導致的NTS 神經(jīng)元平均每秒放電頻率,促進了肺功能的修復。另外,NTS 神經(jīng)元平均每秒放電頻率與炎癥因子IL-1β和呼吸阻力RL 密切相關,NTS 神經(jīng)元的激活與氣道炎癥和氣道高反應的相互作用,可能對支氣管哮喘的發(fā)病產(chǎn)生協(xié)同作用。因此,筆者推測電針可能通過調(diào)節(jié)NTS 神經(jīng)元峰電位放電水平促進支氣管哮喘的緩解。

        基于以上研究結(jié)果,筆者認為NTS 參與電針肺經(jīng)改善支氣管哮喘的過程是一個很重要的研究方向,其機制可能與電針肺經(jīng)后抑制NTS 神經(jīng)元活性,從而影響氣道炎癥和氣道高反應性,為肺腦相關提供了一定的實驗依據(jù)。然而,NTS 能調(diào)節(jié)自主神經(jīng)系統(tǒng)平衡[25],負責傳遞迷走神經(jīng)的傳入和傳出[26],迷走神經(jīng)興奮會導致支氣管痙攣,引起哮喘加重,電針肺經(jīng)調(diào)節(jié)孤束核是否能夠通過抑制迷走神經(jīng)興奮,改善哮喘患者支氣管痙攣。NTS 與自主神經(jīng)系統(tǒng)在電針肺經(jīng)改善支氣管哮喘肺功能方面的相互作用有待進一步的研究,這是目前研究的局限之處,針對這些疑問,將在后續(xù)研究中予以進一步證實,以便更好地闡釋電針肺經(jīng)改善支氣管哮喘的效應機制。

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