吳昊晟,蘇航,朱超,吳生兵,崔帥,周美啟,3

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué),合肥 230012;2.新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,合肥 230012;3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院,合肥 236800)

支氣管哮喘(bronchial asthma,BA)簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘,是一種嗜酸性粒細(xì)胞炎性疾病[1],以反復(fù)發(fā)作的喘息、氣促、胸悶和(或)咳嗽為主要臨床表現(xiàn)[2]。根據(jù)2019年中國(guó)肺健康研究調(diào)查結(jié)果[3]顯示中國(guó)患者總數(shù)已有4 570 萬(wàn),超過(guò)20 歲人群哮喘患病率為4.2%,因此哮喘仍然是世界范圍內(nèi)亟待解決的社會(huì)公共衛(wèi)生問(wèn)題。有研究[4-5]表明針刺能夠有效改善BA 的氣道高反應(yīng)性、黏液分泌過(guò)多和炎癥水平。課題組前期研究[6]發(fā)現(xiàn),針刺肺經(jīng)五輸穴對(duì)于BA 有著良好的治療作用,特別是肺經(jīng)經(jīng)穴太淵能夠有效改善小鼠肺功能,緩解哮喘癥狀。

目前,針灸普遍被認(rèn)為是基于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用的,特別是從腦神經(jīng)科學(xué)入手研究針刺的作用機(jī)制是目前的主要方向[7]。特定的中樞核團(tuán)在針刺過(guò)程中與調(diào)節(jié)大腦神經(jīng)功能網(wǎng)絡(luò)密切相關(guān),課題組前期發(fā)現(xiàn),針刺可以通過(guò)調(diào)節(jié)孤束核的放電頻率改變迷走神經(jīng)活動(dòng),從而發(fā)揮治療作用[8]。孤束核(nucleus tractus solitarius,NTS)是內(nèi)臟初級(jí)傳入纖維的中繼核團(tuán),并且與腦組織許多特定區(qū)域有著密切的纖維投射,近年來(lái)研究[9-10]發(fā)現(xiàn),NTS 存在中樞呼吸化學(xué)感受器神經(jīng)元。但是目前針刺關(guān)于肺腦相關(guān)的研究較少,尚缺乏針刺通過(guò)中樞核團(tuán)改善肺臟疾病的實(shí)驗(yàn)依據(jù)?；谶@些研究,提出NTS 可能參與電針?lè)谓?jīng)改善支氣管哮喘的科學(xué)假說(shuō)。本研究通過(guò)復(fù)制小鼠支BA 模型,以探討NTS 在電針?lè)谓?jīng)改善BA 中的作用,亦為肺經(jīng)-肺臟相關(guān)與腦聯(lián)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c 雌性小鼠45 只,體質(zhì)量(20±2)g,在安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研中心動(dòng)物飼養(yǎng)中心隔離籠具中適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周,籠內(nèi)溫度控制在 18～22 ℃,濕度為(55±2)%,固定晝夜時(shí)間12 h 照明,自由獲得食物和水,保證充足的活動(dòng)范圍。實(shí)驗(yàn)小鼠均購(gòu)自杭州子源實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(浙)2019-0004,本實(shí)驗(yàn)開(kāi)展前通過(guò)安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(AHUCM-mouse-2022042),實(shí)驗(yàn)中嚴(yán)格遵循中華人民共和國(guó)科技部2006年頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》相關(guān)規(guī)定對(duì)動(dòng)物進(jìn)行處理。

1.2 主要試劑與儀器

卵清蛋白(AP0028,Sigma);氫氧化鋁(MB0215,美倫生物);異氟烷(R510-22-16,瑞沃德);蘇木素(BA4097,貝索試劑);伊紅(BA4099,貝索試劑);三溴乙醇(T48402,Sigma);乙酰甲膽堿(C6694,APExBIO,美國(guó));小鼠IL-1β試劑盒(MAN0017504,Thermo Fisher Scientific);超聲霧化吸入器(江蘇魚(yú)躍);華佗牌SDZ-Ⅳ型電子針灸儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);氣麻機(jī)(瑞沃德);肺功能分析系統(tǒng)(AniRes2005,北京貝蘭博);腦立體定位儀(瑞沃德);微絲電極(plexon);在體多通道信號(hào)記錄處理系統(tǒng)(plexon)。

1.3 模型制備

將45 只BALB/c 雌性小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組和電針組,每組15 只。通過(guò)在第0 天和第7 天腹腔注射卵清蛋白(20 μg)和氫氧化鋁(2 mg)混合的致敏液0.2 mL,從第14 天開(kāi)始連續(xù)7 d 以1%濃度卵清蛋白生理鹽水混合液霧化30 min建立支氣管哮喘小鼠模型[6],詳見(jiàn)圖1。以霧化激發(fā)時(shí)出現(xiàn)噴嚏咳嗽、呼吸急促和抓耳撈腮等表現(xiàn),肺組織和支氣管HE染色呈現(xiàn)支氣管攣縮,肺泡腔塌陷,肺泡隔增厚,上皮細(xì)胞部分脫落,肺泡間隙有紅細(xì)胞滲出和明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為造模成功[6]。

圖1 模型制備和干預(yù)方式流程圖

1.4 干預(yù)方法

空白組和模型組,每日正常抓取并以1%異氟烷維持麻醉20 min,不予其他干預(yù),每日1 次,連續(xù)7 d。電針組,穴位取太淵和列缺,根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常用穴位名稱(chēng)與定位第3 部分:小鼠》[11]定位,太淵位于腕橫紋之橈側(cè)凹陷中,列缺位于太淵穴近心端約2 mm 處,詳見(jiàn)圖2。小鼠以3%異氟烷誘導(dǎo)麻醉后,以1%異氟烷維持,局部皮膚消毒后進(jìn)行針刺干預(yù),以一次性針灸針于小鼠左右腕部各刺入2根毫針,間隔2 mm,直刺深度1 mm,將針柄與電針儀相連,同側(cè)兩根針連接在1 組電極,連續(xù)波,頻率2 Hz,電流強(qiáng)度1 mA,留針20 min,每日1 次,連續(xù)干預(yù)7 d。

圖2 太淵和列缺穴定位及電針示例圖

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

3 組小鼠在干預(yù)結(jié)束后隨機(jī)選取進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè),15 只小鼠中6 只小鼠僅進(jìn)行肺功能檢測(cè),6 只進(jìn)行電生理檢測(cè),電生理信號(hào)采集后小鼠與其余存活小鼠5%異氟烷麻醉后處死,取肺組織左上葉進(jìn)行病理形態(tài)檢查,取其余肺葉進(jìn)行免疫因子含量測(cè)定。

1.5.1 觀察肺組織和支氣管病理形態(tài)

3 組小鼠5%異氟烷麻醉后處死,取肺組織左上葉保存在4%多聚甲醛溶液中固定,按照蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色步驟進(jìn)行常規(guī)固定、脫水、透明、石蠟包埋、切片,行HE 染色,在400 倍光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠支氣管、肺組織形態(tài)學(xué)變化,選取相同位置拍片。

1.5.2 測(cè)定肺組織中IL-1β含量

3 組小鼠5%異氟烷麻醉處死后取其余肺葉,冰水浴條件下,機(jī)械勻漿,制備成 10% 的勻漿液,2 500～3 000 r/min,離心10 min,取上清液,參照酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒指導(dǎo)說(shuō)明加樣、抗體孵育,在酶標(biāo)儀450 nm 處測(cè)量吸光度值(OD 值),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計(jì)算各組小鼠肺組織中IL-1β含量。

1.5.3 肺功能檢測(cè)

3 組小鼠用1.25%三溴乙醇麻醉后鈍性分離氣管和頸外靜脈,進(jìn)行氣管插管和頸外靜脈插管并連接呼吸機(jī),待基線穩(wěn)定后按小鼠體質(zhì)量依次遞增給藥,0、10、20、40、80 μg/kg 乙酰甲膽堿(0.0016 g乙酰甲膽堿溶于100 mL 生理鹽水中配成16 μg/mL 的溶液,依次取一定量溶液加等量生理鹽水稀釋,分別配成8、4、2 μg/mL 的藥品),每只小鼠每次注射0.1 mL不同濃度激發(fā)間隔3 min,使用AniRes2005 動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)記錄激發(fā)時(shí)的呼吸阻力(resistance of lung,RL)和肺順應(yīng)性(dynamic compliance,Cdyn)。

1.5.4 孤束核神經(jīng)元放電信號(hào)的采集與處理

3 組小鼠以1%濃度異氟烷麻醉,小鼠呈俯臥位,調(diào)節(jié)耳桿將小鼠頭顱固定于腦立體定位儀上。頭部充分消毒備皮,沿正中頭皮剪開(kāi),暴露顱骨平面,根據(jù)十字縫與人字縫定位前后囟位置,前后調(diào)平,再進(jìn)行左右調(diào)平。參照小鼠腦立體定位圖譜,詳見(jiàn)圖3,標(biāo)記目標(biāo)核團(tuán)NTS 坐標(biāo),選用合適鉆頭開(kāi)骨洞并安裝顱骨釘,再于目標(biāo)核團(tuán)位置開(kāi)一個(gè)足以容納微絲電極的骨窗,挑硬腦膜。 安裝微絲電極緩慢移至目標(biāo)區(qū)域(Bregam -6.83 mm,LR 1 mm,H 4.5 mm)上方,緩慢以0.02 mm/20 s 速度下電極,至NTS 位置時(shí)記錄神經(jīng)元放電情況,再通過(guò)Offline Sorter、Neuro Explor等軟件統(tǒng)計(jì)NTS 神經(jīng)元的單位時(shí)間放電頻率和頻譜能量。

圖3 小鼠NTS 腦立體定位圖譜

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS26.0 軟件進(jìn)行分析處理,通過(guò)Graphpad Prism8.0 軟件對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)圖表繪制。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,比較采用one-way ANOVA 和Pearson 相關(guān)系數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組小鼠行為狀態(tài)比較

空白組一般生長(zhǎng)狀況持續(xù)保持良好,毛發(fā)質(zhì)感柔順、色澤明亮,呼吸順暢,未見(jiàn)喘息哮鳴等呼吸道異樣癥狀。模型組在霧化激發(fā)時(shí),較空白組開(kāi)始出現(xiàn)明顯的噴嚏、咳嗽、呼吸急促、抓耳撈腮等表現(xiàn)。電針組較模型組呼吸喘促、噴嚏咳嗽聲減輕,精神狀態(tài)也有顯著改善。

2.2 3 組小鼠肺組織和支氣管結(jié)構(gòu)比較

通過(guò)HE 染色觀察顯示,空白組肺組織與支氣管細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,排列整齊,無(wú)明顯異常表現(xiàn);模型組較空白組而言,可見(jiàn)支氣管攣縮,上皮細(xì)胞部分脫落,分泌物增加,肺泡腔塌陷,肺泡隔增厚,肺泡間隙有紅細(xì)胞滲出和明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn);電針組支氣管痙攣改善,上皮細(xì)胞脫落有所緩解,分泌物減少,肺泡腔塌陷程度較模型組減輕,肺泡隔稍有變薄,肺泡間隙炎性細(xì)胞浸潤(rùn)緩解。詳見(jiàn)圖4。

2.3 3 組小鼠肺組織內(nèi)IL-1β含量比較

通過(guò)ELISA 檢測(cè)IL-1β含量顯示,模型組肺組織內(nèi)IL-1β表達(dá)水平較空白組明顯升高(P＜0.05);電針組IL-1β表達(dá)水平較模型組明顯降低(P＜0.05)。詳見(jiàn)圖5。

2.4 3 組小鼠肺功能比較

以濃度遞升的乙酰甲膽堿溶液激發(fā)時(shí),與空白組比較,模型組各濃度RL 均呈現(xiàn)顯著增高(P＜0.05),且模型組RL 呈現(xiàn)劑量依賴性增高的趨勢(shì);與模型組比較,電針組RL 顯著降低(P＜0.05)。詳見(jiàn)圖6。

與空白組比較,模型組各濃度Cdyn 均呈現(xiàn)顯著降低(P＜0.05),且模型組Cdyn 呈現(xiàn)劑量依賴性降低的趨勢(shì);與模型組比較,電針組 Cdyn 均顯著改善(P＜0.05)。詳見(jiàn)圖7。

2.5 3 組小鼠NTS 電生理比較

模型組NTS 內(nèi)神經(jīng)元平均每秒峰電位放電頻率與空白組相比較明顯密集(P＜0.05);電針組NTS 神經(jīng)元平均每秒峰電位放電頻率與模型組相比較明顯降低(P＜0.05)。通過(guò)頻譜能量圖顯示,與空白組比較,模型組頻譜能量圖顏色更鮮艷,強(qiáng)度有所增加;與模型組比較,電針組頻譜能量強(qiáng)度有所減弱。詳見(jiàn)圖8。

2.6 NTS 放電頻率與IL-1β和RL 呈正相關(guān)

將NTS 放電頻率與IL-1β水平和RL 進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。結(jié)果表明,放電頻率與IL-1β水平呈正相關(guān)(R＝0.5678,P＝0.0140＜0.05)。放電頻率與RL 呈正相關(guān)(R＝0.7852,P＝0.0001＜0.05)。詳見(jiàn)圖9。

圖9 NTS 放電頻率與IL-1β和RL 呈正相關(guān)(±s,n＝6)

3 討論

支氣管哮喘(BA)作為一種氣道慢性炎癥,西醫(yī)通常使用糖皮質(zhì)激素、白三烯受體拮抗劑、β2 受體激動(dòng)劑[12-14]等藥物治療,這些藥物長(zhǎng)期使用,存在較大不良反應(yīng)。該病屬于中醫(yī)學(xué)“哮證”“喘證”等范疇,中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肺主氣、司呼吸?！鹅`樞·經(jīng)脈》示“是動(dòng)則病,肺脹滿,膨膨而咳喘”“是主肺所生病者,咳,上氣,喘喝”,表明肺經(jīng)主治喉、胸、肺有關(guān)疾病,電針?lè)谓?jīng)改善支氣管哮喘有充足的理論依據(jù)。

目前研究[15]表明支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、氣道高反應(yīng)性以及神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)等關(guān)系密切。IL-1β作為支氣管哮喘未來(lái)惡化風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)因子[15],細(xì)胞炎癥水平和Th2 上游細(xì)胞因子均依賴于IL-1β信號(hào)的傳導(dǎo)[16],發(fā)病時(shí)會(huì)引起IL-1β等炎性因子水平迅速上升。支氣管哮喘氣道高反應(yīng)性通常表現(xiàn)為起到對(duì)刺激產(chǎn)生較明顯的氣道收縮反應(yīng),導(dǎo)致氣道阻力顯著增加[17-18],使患者呼吸困難。本研究結(jié)果表明,電針?lè)谓?jīng)太淵、列缺能夠有效降低炎性因子IL-1β水平,也可以改善肺功能狀況,有效降低呼吸阻力和提高肺順應(yīng)性。

經(jīng)脈臟腑與腦相關(guān)是目前針灸研究的熱門(mén)話題,心腦相關(guān)[19-20]已有了許多研究成果,但在肺經(jīng)-肺臟與腦相關(guān)方面研究相對(duì)較少。根據(jù)目前對(duì)于NTS 的研究,有學(xué)者[21-22]發(fā)現(xiàn)NTS 在咳嗽的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用,BASSI M 等[23]研究證實(shí)了NTS 是瘦素促進(jìn)呼吸反應(yīng)的作用部位,諸多研究表明NTS 對(duì)維持肺臟的結(jié)構(gòu)及功能至關(guān)重要,可能與肺臟疾病存在一定的聯(lián)系。使用在體電生理記錄系統(tǒng)可以有效記錄指定核團(tuán)內(nèi)的群體神經(jīng)元峰電位活動(dòng)變化情況,本研究利用該技術(shù)記錄NTS 內(nèi)神經(jīng)元峰電位放電情況,為肺經(jīng)-肺臟與腦相關(guān)提供了一定的神經(jīng)電生理學(xué)的依據(jù)。NTS 可能是電針?lè)谓?jīng)改善支氣管哮喘的一個(gè)新的關(guān)鍵中樞核團(tuán)。本實(shí)驗(yàn)中,小鼠支氣管哮喘后,NTS 神經(jīng)元平均每秒放電頻率上調(diào),相關(guān)學(xué)者[24]在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的研究結(jié)果與本研究基本一致,他們發(fā)現(xiàn)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物哮喘模型中NTS 神經(jīng)元內(nèi)在興奮性增加。電針?lè)谓?jīng)干預(yù)后,可降低支氣管哮喘所導(dǎo)致的NTS 神經(jīng)元平均每秒放電頻率,促進(jìn)了肺功能的修復(fù)。另外,NTS 神經(jīng)元平均每秒放電頻率與炎癥因子IL-1β和呼吸阻力RL 密切相關(guān),NTS 神經(jīng)元的激活與氣道炎癥和氣道高反應(yīng)的相互作用,可能對(duì)支氣管哮喘的發(fā)病產(chǎn)生協(xié)同作用。因此,筆者推測(cè)電針可能通過(guò)調(diào)節(jié)NTS 神經(jīng)元峰電位放電水平促進(jìn)支氣管哮喘的緩解。

基于以上研究結(jié)果,筆者認(rèn)為NTS 參與電針?lè)谓?jīng)改善支氣管哮喘的過(guò)程是一個(gè)很重要的研究方向,其機(jī)制可能與電針?lè)谓?jīng)后抑制NTS 神經(jīng)元活性,從而影響氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性,為肺腦相關(guān)提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而,NTS 能調(diào)節(jié)自主神經(jīng)系統(tǒng)平衡[25],負(fù)責(zé)傳遞迷走神經(jīng)的傳入和傳出[26],迷走神經(jīng)興奮會(huì)導(dǎo)致支氣管痙攣,引起哮喘加重,電針?lè)谓?jīng)調(diào)節(jié)孤束核是否能夠通過(guò)抑制迷走神經(jīng)興奮,改善哮喘患者支氣管痙攣。NTS 與自主神經(jīng)系統(tǒng)在電針?lè)谓?jīng)改善支氣管哮喘肺功能方面的相互作用有待進(jìn)一步的研究,這是目前研究的局限之處,針對(duì)這些疑問(wèn),將在后續(xù)研究中予以進(jìn)一步證實(shí),以便更好地闡釋電針?lè)谓?jīng)改善支氣管哮喘的效應(yīng)機(jī)制。