裴麗娟,馮晨晨,姚超,葉子,張衙楠,孫栩秋,王珂,周嘉

(1.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院,上海 200437;2.上海中醫(yī)藥大學,上海 201203)

針刺治療疾病具有整體調(diào)節(jié)作用,并具有雙向的特性[1]。針刺效應的產(chǎn)生被認為與“神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫”網(wǎng)絡途徑密切相關,具有多環(huán)節(jié)、多靶向的特征[2]。其中,針刺效應的產(chǎn)生與神經(jīng)系統(tǒng)密切相關,針刺通過刺激機體穴位引起神經(jīng)傳入纖維的沖動,針刺信號從外周上傳至中樞神經(jīng)系統(tǒng)后進行逐級整合和持續(xù)傳遞[3],反饋下行調(diào)節(jié)機制,同時促發(fā)內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng),協(xié)同發(fā)揮整體調(diào)控效應。在這個過程中針刺可引起不同層級神經(jīng)遞質活性和水平的變化[4]。由此可見,神經(jīng)系統(tǒng)是促發(fā)針刺效應產(chǎn)生的必要條件和始動因素[5]。

神經(jīng)遞質是神經(jīng)元之間或神經(jīng)元與效應器細胞之間傳遞信息的化學物質,也是針刺效應產(chǎn)生的物質基礎之一。單胺類神經(jīng)遞質既參與腧穴局部針刺信號的啟動以及針刺信息在中樞神經(jīng)系統(tǒng)各個層級的傳導和信息整合,又參與針刺對機體各個系統(tǒng)器官活動的調(diào)節(jié)[6]。針刺是中醫(yī)學治未病的重要手段之一,能發(fā)揮未病先防和已病防變的作用,如《素問·刺熱》:“肝熱病者,左頰先赤……病雖未發(fā),見赤色者刺之,名曰治未病?！弊闳锸轻樉呐R床防病治病和保健強身的要穴。足三里是足陽明胃經(jīng)的合穴,“四總穴”之一,也是《針灸聚英》中“回陽九針”的穴位之一。《古法新解會元針灸學》評價足三里為“此穴治病萬端,有白術之強,有桂附之熱,有參茸之功,有硝黃之力”。更有《千金要方》有“若要安,三里常不干”的論述。現(xiàn)代研究[7-8]表明,針灸刺激足三里可對機體“神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫”網(wǎng)絡產(chǎn)生影響,“足三里”在機體不同狀態(tài)下發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)效應,從而對機體的生理病理發(fā)揮廣泛的調(diào)節(jié)作用。本課題組前期研究[9-11]表明,單次電針足三里能對中樞神經(jīng)系統(tǒng)各級中樞發(fā)揮廣泛的調(diào)節(jié)作用。

單胺類神經(jīng)遞質在中樞和外周均發(fā)揮廣泛的生理學效應,也是針刺效應的介導者和發(fā)揮效應的物質基礎。因此,本文通過研究正常小鼠接受電針足三里處理后不同時間節(jié)段血清中單胺類神經(jīng)遞質含量的變化,探索電針對正常機體外周神經(jīng)遞質的調(diào)節(jié)效應規(guī)律,以期部分解析針刺治未病的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF 級健康雄性C57BL/6J 小鼠30 只,5 周齡,體質量20～22 g,購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司,合格證號SCXK(滬)2017-0005。動物飼養(yǎng)條件為室溫20～25 ℃,相對濕度50%～65%,每日12 h 光照。實驗小鼠自由飲水、普通飼料喂養(yǎng)。適應性飼養(yǎng)1 周后,隨機分為對照組和電針組,每組15 只。實驗過程中對待動物遵照國家科學技術部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 主要試劑與儀器

所有化學物質均為HPLC 級,采用超純水系統(tǒng)生產(chǎn)超純水(Milli-Pore,美國)。標準品鹽酸去甲腎上腺素(norepinephrine hydrochloride,NE)、鹽酸多巴胺(dopamine hydrochloride,DA)、3,4 二羥基苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylaceticacid,DOPAC)、鹽酸5-羥 色 胺(5-hydroxytryptamine hydrochloride,5-HT)、5-羥基吲哚乙酸(5-hydroxyindole acetic acid,5-HIAA)均購于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。安捷倫1200 系列神經(jīng)遞質分析儀(南京利爾實驗儀器設備有限公司),高速離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分工司),低溫冰箱(日本SANYO 公司),電化學探測器(Antec SDC ECD,荷蘭),LH 200 型韓氏電針儀(南京濟生醫(yī)療科技有限公司),中研太和不銹鋼針灸針(0.16 mm×7 mm,天津億朋醫(yī)療器械有限公司)。

1.3 電針

用特制的棉布束縛裝置對小鼠進行束縛,留小鼠雙下肢在布套外,在束縛的基礎上選用0.16 mm×7 mm不銹鋼針灸針,75%乙醇常規(guī)消毒后直刺雙側足三里。取穴方法參考《實驗針灸學》[12],通過體表解剖標志的確定以及骨度分寸法進行取穴,取雙側足三里穴,足三里定位為膝關節(jié)腓骨小頭向后0.5 cm,在脛骨和腓骨之間,針刺深度7 mm。前期預實驗進行電針“神經(jīng)-免疫”調(diào)控相關實驗時候,摸索過不同頻率、強度和刺激時間,發(fā)現(xiàn)電針頻率10 Hz,強度2 mA,留針時間30 min對神經(jīng)遞質和免疫均有較好的調(diào)節(jié)效應,因此采用上述電針參數(shù)。針刺刺入足三里后,接通電針儀,調(diào)節(jié)電針參數(shù)。對照組僅用特制的棉布束縛裝置束縛30 min,不予電針。

1.4 取材

實驗前3 d,對小鼠進行環(huán)境和人為操作適應性習慣訓練。采血時間點分別為電針干預前1 d 及電針干預后1 h、2 h、4 h、8 h、24 h,眼眶取血。每只小鼠取150～200 μL 血液,室溫靜置1 h,3 000 r/min離心15 min,將離心后的上清液轉移至新的0.5 mL EP管,再次3 000 r/min 離心15 min;從每個EP 管中各吸取上清液40 μL。每組小鼠每3 只小鼠血清混為一個樣本?；鞓雍蟮难?120 μL/管)加入8.6 μL 的高氯酸,室溫靜置5 min,3 000 r/min 離心15 min,用移液槍吸出上清(大約為60 μL/管血清),置于-80 ℃保存待測。

1.5 指標檢測

將所有試劑標準品分別用0.1 mol/L 的高氯酸配成質量濃度為1.0 mg/mL 的標準儲備液,貯存于4 ℃冰箱內(nèi)。分析時用0.1 mol/L 的高氯酸稀釋到所需濃度。采用高效液相色譜法測定NE、DA、DOPAC、5-HIAA以及5-HT 等神經(jīng)遞質在血清中的含量。流動相為水:甲醇為90:10(含0.74 mmol/L 辛烷磺酸鈉、80 mmol/L二水合磷酸二氫鈉、0.027 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉和2 mmol/L 氯化鉀),磷酸調(diào)pH＝3.0,將樣品的上清液注入到C18 柱(2.2 μm,2.1×100 mm;賽默飛世爾科技)中,溫度為38 ℃。用流動相磷酸鹽緩沖液磷酸氫二鈉 90 mmol/L,檸檬酸 50 mmol/L,原硅酸1.7 mmol/L,EDTA 0.05 μmo/L,以0.2 mL/min 的流量進行分離,檢測單元設置為700 mV,防護單元設置為750 mV,通過化學站(安捷倫科技)對數(shù)據(jù)進行收集和分析。通過與已知外部標準的比較,確定峰和相對濃度。NE、DA、DOPAC、5-HIAA 以及5-HT 各分子的高效液相色譜圖見圖1。

圖1 NE、DA、DOPAC、5-HIAA 以及5-HT 的高效液相色譜圖

1.6 統(tǒng)計學處理

運用SPSS22.0 軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示,多組不同時間點比較采用重復測量雙因素方差分析,若方差齊,則采用LSD 檢驗進行兩兩比較;若方差不齊,則采用Tamhane’s T2 檢驗進行兩兩比較。不符合正態(tài)分布的計量資料比較采用非參數(shù)檢驗檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清NE 含量比較

兩組干預前小鼠血清NE 含量比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。兩組干預后1 h、2 h、4 h 和8 h血清NE 含量較干預前降低(P＜0.05,P＜0.01);電針組干預后24 h 血清NE 含量顯著低于對照組和干預前(P＜0.01)。詳見圖2。

圖2 兩組血清NE 含量比較(±s,n＝5)

2.2 兩組血清DA、DOPAC 含量及DOPAC/DA 比值比較

兩組干預前血清DA、DOPAC 含量及DOPAC/DA 比值差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。兩組干預后血清DA 含量和DOPAC/DA 比值在各個時間點均降低(P＜0.05,P＜0.01),對照組干預后2 h 血清DOPAC 含量較干預前降低(P＜0.05),電針組干預后4 h 和8 h 血清DOPAC含量較干預前升高(P＜0.01);電針組干預后2 h、4 h、8 h 和24 h 血清DA 含量高于對照組(P＜0.05,P＜0.01),DOPAC/DA 比值低于對照組(P＜0.01)。詳見圖3。

圖3 兩組血清DA、DOPAC 含量及DOPAC/DA 比值比較(±s,n＝5)

2.3 兩組血清5-HT、5-HIAA 含量及5-HIAA/5-HT 比值比較

兩組干預前血清5-HT、5-HIAA 含量以及5-HIAA/5-HT 比值差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。兩組干預后各時間點血清5-HT 含量均降低(P＜0.01),電針組干預后2 h 和4 h 血清5-HT 含量低于對照組(P＜0.05);兩組血清5-HIAA 在各個時間點差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);對照組干預后8 h 和24 h 血清5-HIAA/5-HT 比值較干預前降低(P＜0.05),電針組干預后1 h、4 h 和24 h 血清5-HIAA/5-HT 比值較干預前升高(P＜0.01),電針組干預后1 h、4 h、8 h 和24 h 血清5-HIAA/5-HT 比值高于對照組(P＜0.01,P＜0.05)。詳見圖4。

圖4 兩組血清5-HT、5-HIAA 含量及5-HIAA/5-HT 比值比較(±s,n＝5)

3 討論

單胺類神經(jīng)遞質是一類由兩個碳鏈將氨基和芳香環(huán)鏈接在一起為特征的神經(jīng)遞質或調(diào)質。單胺類神經(jīng)遞質在神經(jīng)系統(tǒng)中參與了情緒、喚醒和記憶等重要生理過程的調(diào)節(jié)。同樣,單胺類神經(jīng)遞質在外周也發(fā)揮重要生理病理調(diào)節(jié)作用。外周血中NE、DA 和5-HT 均有擬交感神經(jīng)活性效應,對心血管系統(tǒng)進行調(diào)控。此外,這些單胺類神經(jīng)遞質在外周還有各自獨特而廣泛的作用和效應[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)生理狀態(tài)下單次電針足三里即可對外周血中單胺類神經(jīng)遞質發(fā)揮廣泛的影響。

NE 既是一種神經(jīng)遞質,也是一種激素。腎上腺髓質作為一種神經(jīng)內(nèi)分泌轉換器是外周血中NE 的主要來源,其次交感節(jié)后神經(jīng)元神經(jīng)末梢釋放的NE 也有部分進入血液循環(huán),循環(huán)系統(tǒng)中的NE 主要通過與α型腎上腺素能受體結合發(fā)揮效應,對心血管系統(tǒng)和整個機體的代謝產(chǎn)生影響,與應激反應密切相關[15]。有研究[16]顯示,電針麻醉誘導前30 min 預干預,可以有效抑制腰椎后路開放手術患者氣管插管即刻時外周血中的NE濃度,減少氣管插管所導致的應激反應。對于急性腦梗死患者,醒腦開竅針法聯(lián)合藥物治療可有效降低血清NE、5-HT 水平,改善患者神經(jīng)功能缺損狀態(tài)[17]。而動物實驗表明,常規(guī)電針刺激20 min 即可引起正常兔子外周血中NE 含量的下調(diào),從而抑制交感神經(jīng)活性,發(fā)揮針刺鎮(zhèn)痛效應[18]。研究還發(fā)現(xiàn),電針治療可以通過調(diào)節(jié)心肌梗死后交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)的重塑,顯著降低模型小鼠血清NE 水平,改善心臟功能和拮抗心肌損傷,發(fā)揮心肌保護效應[19]。本研究發(fā)現(xiàn),電針組和對照組小鼠在早期外周血中NE 均呈現(xiàn)下調(diào),但對照組小鼠在24 h 后恢復至干預前水平,而單次電針的效應可持續(xù)至針刺后24 h。

DA 主要在神經(jīng)元和腎上腺髓質中合成,循環(huán)血液中的DA 主要受交感神經(jīng)調(diào)控,但在各個組織器官也能局部合成和釋放[19]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)外主要通過局部旁分泌發(fā)揮作用,在心血管系統(tǒng)可以引起血管擴張,在腎臟中增加鈉排泄和尿量,在胰腺中減少胰島素的產(chǎn)生,在消化系統(tǒng)中減低胃腸蠕動并保護胃黏膜[20-21]。而且,近年來研究[22-23]表明外周DA 在免疫調(diào)節(jié)和抑制炎癥方面發(fā)揮重要作用,能夠調(diào)節(jié)T 淋巴細胞活性和細胞因子的釋放,抑制巨噬細胞內(nèi)NLRP3 炎癥小體依賴性的炎癥反應。一項研究[24]表明電針足三里預刺激15 min 可激活迷走神經(jīng),進而促進腎上腺髓質DA 的合成與釋放,從而抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的膿毒血癥模型小鼠的全身炎癥反應。DA 促發(fā)人體基本運動,含量降低時肢體會出現(xiàn)震顫等癥狀,研究[25]發(fā)現(xiàn)針刺聯(lián)合西藥治療帕金森可顯著提高患者血清中DA等水平,有助于DA神經(jīng)元修復,改善病情。本研究結果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,單次電針可有效提高針刺后2 h 至24 h 循環(huán)血液中DA 的含量,且DOPAC/DA 比值差異有統(tǒng)計學意義。但對照組和電針組之間DOPAC作為DA的代謝產(chǎn)物兩組之間差異無統(tǒng)計學意義。上述結果進一步提示單次電針可以促進循環(huán)血液中DA 的含量,其機制可能是電針促進了機體DA的合成和釋放,但可能對DA 的降解過程影響不大。

機體有1%～2%的5-HT 是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)合成和分泌。而絕大多數(shù)5-HT 是由胃腸道的腸嗜鉻細胞合成并分泌入血,由血小板吸收和儲存、并在激活后釋放。其中5-HIAA 是5-HT 主要代謝產(chǎn)物。外周5-HT 介導一系列的生理功能,包括參與調(diào)控心率、血管緊張度、腸蠕動,還能作為生長激素調(diào)控心臟、大腦和乳腺的發(fā)育以及肝、骨和肺動脈的細胞生長,也是溝通腦腸軸的關鍵物質基礎,對免疫系統(tǒng)呈現(xiàn)廣泛而復雜的調(diào)控作用[26-27]。有臨床研究[28-29]顯示無論是電針還是經(jīng)皮穴位電刺激均能有效抑制手術患者術后外周血中5-HT 的濃度,這可能是針刺治療可以抑制患者術后惡心、嘔吐和疼痛的潛在機制之一。本次實驗中,雖然電針組和對照組血清5-HT 和5-HIAA 含量差異幾乎沒有統(tǒng)計學意義,但是5-HIAA/5-HT 比值在兩組中差異有統(tǒng)計學意義,電針組高于對照組,說明電針足三里可能同時影響機體的5-HT 和5-HIAA 在外周血中的分布發(fā)揮整體調(diào)控作用。上述研究結果提示針刺可能調(diào)節(jié)NE、DA 和5-HT 含量,可廣泛應用于預防心血管系統(tǒng)相關疾病、降低機體應激和調(diào)節(jié)免疫抑制炎癥等方面的多個病種。例如,一項雙中心隨機對照試驗[30]發(fā)現(xiàn),電針可下調(diào)血清5-HT 和 NE 水平發(fā)揮緩解女排運動員賽前焦慮、減輕賽前壓力并改善賽前焦慮引起的睡眠障礙的作用。

研究[31-33]表明,晝夜節(jié)律變化對機體內(nèi)外周血中NE、DA 和5-HT 的含量有明顯的影響。同時,已有的研究[34-35]就顯示不同的應激刺激也可以對上述單胺類神經(jīng)遞質外周血中的含量產(chǎn)生不同的影響。且針刺作用具有顯著的時間依賴效應,針刺作用可對機體產(chǎn)生較長時間的影響[36]。因此,本研究觀察了電針對外周血24 h 各單胺類神經(jīng)遞質含量的改變。結果發(fā)現(xiàn)對照組小鼠外周血中相關單胺類神經(jīng)遞質含量隨時間的改變,這一變化可能與晝夜節(jié)律變化以及束縛刺激均有關系。由于本實驗的目的是觀察單次電針對外周血中單胺類神經(jīng)遞質含量的影響,因此未能設計相關的對照進行排除,是本次研究的不足之處。但是在不同時間點上電針組與對照組在一些相關單胺類神經(jīng)遞質及其代謝產(chǎn)物上仍然存在差異性,進一步說明電針刺激對外周血中單胺類神經(jīng)遞質含量具有明確的調(diào)節(jié)作用。上述研究也提示針刺作用具有明顯的后效應,甚至單一1 次電針刺激,其對機體的調(diào)節(jié)仍然在結束后持續(xù)較長的時間。

綜上所述,本研究探索性地研究了單次電針對生理狀態(tài)下小鼠外周血單胺類神經(jīng)遞質含量的影響,和針刺后24 h 外周血單胺類神經(jīng)遞質的動態(tài)變化特征。這些結果不但有助于反應和解析電針足三里對正常機體啟動整體調(diào)節(jié)作用的效應機制,還有助于理解針刺足三里發(fā)揮防病保健效應的原理,為中醫(yī)學治未病重要思想提供一定的科學理論依據(jù)。