劉傳和 賀涵 何秀古 陳鑫 劉開 邵雪花 賴多 秦健莊慶禮 匡石滋 肖維強

（1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶果樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室 廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點實驗室，廣州 510640；2. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，廣州 510640）

低溫是限制植物生產(chǎn)力和地域分布的主要因素。驟冷或持續(xù)低溫常造成植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能損傷，破壞植物正常的生長與生理生化代謝過程，顯著降低植物存活率［1］。低溫脅迫下，植物體中的活性氧含量顯著上升，并與質(zhì)膜上的不飽和脂肪酸反應(yīng)，產(chǎn)生丙二醛，引起膜脂發(fā)生相變，細(xì)胞膜透性增大，導(dǎo)致電解質(zhì)泄漏［2-3］；葉綠素合成受阻，光合速率下降［4］。植物體內(nèi)的可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸等滲透物質(zhì)，以及內(nèi)源激素、抗氧化酶因低溫脅迫而發(fā)生變化［5-6］。

能否安全越冬是南方果樹種植地選擇時應(yīng)著重考慮的問題。果樹受低溫危害后，輕則造成樹干枝葉枯萎、減產(chǎn)，嚴(yán)重時導(dǎo)致樹體死亡，給生產(chǎn)造成重大損失［7］。菠蘿［Ananas comosus（L.）Merr.］屬鳳梨科（Bromeliaceae）鳳梨屬（Ananas）多年生草本果樹，是著名的熱帶水果。冬季的平均溫度是限制菠蘿種植區(qū)域的決定性因素。當(dāng)溫度低至5℃時，菠蘿葉片表現(xiàn)出明顯的低溫傷害癥狀，脯氨酸和可溶性蛋白含量及細(xì)胞膜相對透性均增加［8］。在我國廣東、廣西、福建等菠蘿產(chǎn)區(qū)常因低溫寒害而造成果實生長發(fā)育不良甚至絕收［9］。培育并種植抗寒新品種可有效地減輕或避免寒害對菠蘿的不利影響，保障我國菠蘿產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。不同品種菠蘿的耐寒性存在明顯差異［9］，‘金菠蘿’和‘無刺卡因’耐寒性較強，‘巴厘’和‘黃金菠蘿’耐寒性相對較弱［10］。有關(guān)不同品種菠蘿對低溫脅迫響應(yīng)差異的機理主要從葉綠素含量、熒光特性，脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖等方面進行了研究［8,10］。通過轉(zhuǎn)錄組、代謝組學(xué)技術(shù)比較了不同品種菠蘿差異表達(dá)基因與差異代謝物［11］。

生產(chǎn)中，‘粵甜’菠蘿的耐寒性明顯好于‘巴厘’等主栽品種。為較好地了解‘粵甜’菠蘿的品種特性，擴大‘粵甜’菠蘿在生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用，本研究比較分析了常溫下及低溫處理后‘粵甜’‘巴厘’菠蘿生理、代謝及部分基因相對表達(dá)量等的變化差異，以期了解‘粵甜’菠蘿耐寒性狀形成的生理代謝機制，為菠蘿抗寒新品種的選育及耐寒基因、代謝物挖掘相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用材料為‘粵甜’和‘巴厘’菠蘿品種的盆栽植株，每盆種植一棵菠蘿苗，盆栽所用土壤取自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所內(nèi)未耕作土壤。2021年，盆栽植株長至約40 cm高時，選擇長勢一致的2個品種植株各18盆（共36盆）進行試驗處理。試驗設(shè)2個處理，即低溫（LT）和常溫（NT）。低溫和常溫處理分別指將盆栽菠蘿植株置于5℃和25℃的人工培養(yǎng)箱中（培養(yǎng)箱內(nèi)不開燈）進行處理，時長為48 h，保持相對濕度70%。每個品種、每個溫度處理各9盆（每3盆為1次重復(fù)，每個處理重復(fù)3次）。處理結(jié)束后，每棵選取3片中部葉片，摘取葉片中間部位5 cm長段作為取樣部位，同一重復(fù)內(nèi)的3盆植株上取的樣混合，用于試驗測定。本研究中，試驗測定均為3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 生理指標(biāo)測定 可溶性蛋白用考馬斯亮藍(lán)法檢測，可溶性糖采用蒽酮比色法檢測，丙二醛采用硫代巴比妥酸法檢測，脯氨酸采用茚三酮比色法檢測，POD（過氧化物酶）、SOD（超氧化物歧化酶）和CAT（過氧化氫酶）活性分別采用愈創(chuàng)木酚氧化法、氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原法和過氧化氫氧化法測定［12］。

1.2.2 基因相對表達(dá)量分析 POD、SOD、CAT、ProDH（脯氨酸脫氫酶）基因（單拷貝）相對表達(dá)量分析，用諾唯贊公司試劑盒提取RNA，反轉(zhuǎn)錄采用反轉(zhuǎn)錄試劑PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）（TaKaRa公司）；TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（Code No. RR820A）進行RT?PCR反應(yīng)，所用引物序列見表1（由上海生工生物工程有限公司合成）。采用2-△Ct方法計算相對表達(dá)量，△Ct目的基因=Ct目的基因-CtActin。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.2.3 內(nèi)源激素測定 基于LC?MS/MS平臺進行植物激素分析［13-15］，絕對定量測定生長素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、脫落酸、1?氨基環(huán)丙烷羧酸（ACC）、茉莉酸、水楊酸、獨角金內(nèi)酯含量。

1.2.4 代謝物提取與差異分析 樣品真空冷凍干燥后研磨至粉末并稱取100 mg，溶解于1.2 mL 70%甲醇提取液中，每30 min渦旋一次，每次持續(xù)30 s，共渦旋6次，4℃冰箱過夜；離心（轉(zhuǎn)速12 000 r/min，10 min）后，吸取上清，用微孔濾膜（0.22 μm pore size）過濾，保存于進樣瓶中，用于UPLC?MS/MS分析［16］?；赨PLC?MS/MS檢測平臺、武漢邁特維爾生物科技有限公司自建數(shù)據(jù)庫以及多元統(tǒng)計分析對代謝組進行分析。按差異倍數(shù)、t檢驗的P值和OPLS?DA模型變量投影重要度值（variable importance in the projection，VIP）相結(jié)合的方法篩選差異代謝物，篩選標(biāo)準(zhǔn)為Fold Change＞2或Fold Change＜0.5，P?value＜0.05和VIP＞1。進行KEGG代謝通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 不同品種低溫處理后生理指標(biāo)變化

表2所述為常溫及低溫處理后‘粵甜’與‘巴厘’菠蘿的生理指標(biāo)。與常溫相比，低溫處理后‘粵甜’的可溶性蛋白含量顯著升高，而‘巴厘’顯著降低，相比較‘粵甜’比‘巴厘’高39.47%，差異顯著?？扇苄蕴呛吭诘蜏靥幚砗缶档?，其中‘巴厘’顯著降低，相比較‘粵甜’比‘巴厘’高20.85%，差異顯著。低溫處理后‘粵甜’‘巴厘’的脯氨酸含量均顯著升高，‘粵甜’比‘巴厘’高83.93%，差異顯著。低溫處理后，‘粵甜’的丙二醛含量顯著降低，‘巴厘’顯著升高，相比較‘粵甜’比‘巴厘’低70.36%，差異顯著。

表2 不同品種低溫處理后菠蘿葉片生理指標(biāo)的變化Table 2 Changes in physiological indexes between two different pineapple cultivars after low temperature treatment

低溫處理后‘粵甜’的POD酶活性升高，‘巴厘’降低，相比較‘粵甜’比‘巴厘’高1.00倍，差異顯著。‘粵甜’‘巴厘’的SOD、CAT酶活性均在低溫處理后顯著升高，但‘粵甜’的SOD、CAT酶活性均顯著高于‘巴厘’。

2.2 不同品種低溫處理后基因相對表達(dá)量變化

圖1所示為常溫及低溫處理后‘粵甜’‘巴厘’菠蘿POD、SOD、CAT與ProDH基因相對表達(dá)量變化。與常溫相比，低溫處理后‘粵甜’的POD基因相對表達(dá)量提高了4.65倍，‘巴厘’略降低；‘粵甜’比‘巴厘’高1.55倍，差異顯著。

圖1 不同品種低溫處理后POD、SOD、CAT、ProDH基因相對表達(dá)量變化Fig. 1 Changes in the expressions of POD, SOD, CAT and ProDH genes in two different cultivars after low temperature treatment

低溫處理后，‘粵甜’‘巴厘’菠蘿的SOD、CAT基因相對表達(dá)量均升高，‘粵甜’的SOD基因表達(dá)比‘巴厘’略低，而CAT基因表達(dá)比‘巴厘’高77.73%（差異顯著）。低溫處理后‘粵甜’的ProDH基因相對表達(dá)量降低了69.00%，‘巴厘’提高了11.07倍，‘巴厘’比‘粵甜’高9.09倍，差異顯著。

2.3 不同品種低溫處理后內(nèi)源激素含量變化

表3所列為常溫及低溫處理后‘粵甜’‘巴厘’內(nèi)源激素含量。低溫處理后：‘粵甜’的色胺、L?色氨酸含量升高，其中色胺顯著升高，‘巴厘’的均略降低；‘粵甜’的色胺、L?色氨酸含量分別比‘巴厘’高7.14倍和83.22%，差異顯著；‘粵甜’的吲哚?3?乙酸甲酯、吲哚?3?甲醛、吲哚?3?甲酸及吲哚乙酸-纈氨酸甲酯含量升高，而‘巴厘’的降低；‘粵甜’的吲哚?3?乙酸甲酯、吲哚?3?甲酸含量均顯著高于‘巴厘’；‘粵甜’‘巴厘’的吲哚乙酸-天冬氨酸含量均高于常溫，且‘粵甜’顯著高于‘巴厘’；‘粵甜’‘巴厘’的GA19含量均降低，但‘粵甜’的GA19含量顯著低于‘巴厘’；‘粵甜’的2?甲硫基順式玉米素核苷、異戊烯腺嘌呤核苷、雙氫玉米素?7?糖苷、6?芐氨基嘌呤含量均升高，‘巴厘’的降低或無明顯變化；‘粵甜’的2?甲硫基順式玉米素核苷、異戊烯腺嘌呤核苷顯著高于‘巴厘’。

表3 不同品種低溫處理后內(nèi)源激素含量的變化Table 3 Changes of endogenous hormone contents between two different pineapple cultivars after low temperature treatment/(ng·g-1)

低溫處理后：‘粵甜’‘巴厘’的ACC含量均降低，相比較，‘粵甜’顯著高于‘巴厘’；‘粵甜’‘巴厘’的脫落酸含量均降低，其中‘巴厘’顯著降低，‘粵甜’顯著低于‘巴厘’；‘粵甜’‘巴厘’的脫落酸葡萄糖酯含量均與常溫差異不顯著，除順式?12?氧-植物-二烯酸含量顯著降低外，低溫對‘粵甜’‘巴厘’的茉莉酸類激素含量無顯著影響，且‘粵甜’‘巴厘’間無顯著差異；‘粵甜’‘巴厘’的水楊酸含量均降低，相比較‘粵甜’顯著高于‘巴厘’?！浱稹乃畻钏?2?O-β-葡萄糖苷含量升高而‘巴厘’的降低，但均不顯著，相比較‘粵甜’顯著高于‘巴厘’；‘粵甜’‘巴厘’的5?脫氧獨腳金醇含量均降低，但相比較‘粵甜’中的含量高于‘巴厘’。

2.4 不同品種低溫處理后的差異代謝物

2.4.1 樣品PCA判別分析 PCA結(jié)果如圖2所示，主成分1解釋度為41.5%，主成分2解釋度為17.68%，說明該模型可以較好的將樣品劃分為粵甜-常溫、粵甜-低溫、巴厘-常溫、巴厘-低溫共4個組。4個組間離散程度較高，代謝差異明顯，且品種間的差異大于溫度處理的差異。

圖2 ‘粵甜’‘巴厘’菠蘿品種常溫及低溫處理樣品 PCA分析Fig. 2 PCA analysis of the samples of the two cultivars‘Yuetian’ and ‘Comte de Paris’ under normal and low temperatures

2.4.2 ‘粵甜’與‘巴厘’菠蘿間差異代謝物組成 常溫下，‘粵甜’與‘巴厘’間共檢測出差異代謝物226個。包括黃酮122個、氨基酸及其衍生物9個、酚酸類38個、核苷酸及其衍生物7個、木脂素和香豆素8個、生物堿7個、有機酸8個、脂質(zhì)21個、萜類2個以及其他4個（圖3）。其中最多的是黃酮類代謝物。

圖3 常溫及低溫處理后‘粵甜’與‘巴厘’菠蘿間的差異代謝物組成Fig. 3 Differential metabolite profiling between Yuetian and Comte de Paris under normal and low temperature

低溫處理后，‘粵甜’與‘巴厘’菠蘿間共檢測出差異代謝物262個。包括黃酮115個、氨基酸及其衍生物21個、酚酸類39個、核苷酸及其衍生物18個、木脂素和香豆素7個、生物堿12個、有機酸5個、脂質(zhì)36個以及其他9個（圖3）。其中最多的是黃酮類代謝物。

2.4.3 ‘粵甜’與‘巴厘’菠蘿間差異代謝物通路富集 KEGG代謝通路富集分析顯示，常溫下‘粵甜’與‘巴厘’間差異代謝物顯著富集到46條代謝通路中，其中主要富集在次生代謝物生物合成，類黃酮生物合成，黃酮與黃酮醇生物合成，二苯乙烯類、二芳基庚烷類與姜辣素生物合成，以及苯丙烷類生物合成等5條通路中（圖4?A）。低溫處理后，‘粵甜’與‘巴厘’間差異代謝物顯著富集到56條代謝通路中，其中主要富集在次生代謝物生物合成，類黃酮生物合成，黃酮與黃酮醇生物合成，嘌呤代謝，以及嘧啶代謝等5條通路中（圖4?B）。

圖4 常溫（A）及低溫處理后（B）‘粵甜’與‘巴厘’間差異代謝物KEGG代謝通路富集Fig. 4 Differential metabolites KEGG pathways enrichment between ‘Yuetian’ and ‘Comte de Paris’ under normal temperature（A）and after low temperature treatment（B）

2.4.4 低溫處理后‘粵甜’與‘巴厘’間關(guān)鍵差異代謝物篩選 圖5所示為篩選出的110個低溫處理誘導(dǎo)的‘粵甜’與‘巴厘’間關(guān)鍵差異代謝物，包括黃酮27個、氨基酸及其衍生物13個、酚酸15個、核苷酸及其衍生物16個、香豆素2個、生物堿7個、有機酸2個及脂質(zhì)28個。在110個代謝物中，41個在常溫下‘粵甜’‘巴厘’間存在顯著差異，經(jīng)低溫處理后差異倍數(shù)增大；另外69個在常溫下差異不顯著，經(jīng)低溫處理后差異達(dá)到顯著水平（相差2倍以上）。而且這些代謝物在‘粵甜’中的含量積累高于‘巴厘’。

圖5 低溫處理誘導(dǎo)的‘粵甜’與‘巴厘’菠蘿間關(guān)鍵差異代謝物Fig. 5 Key DAMs between ‘Yuetian’ and ‘Comte de Paris’ after being induced by low temperature treatment

其中，黃酮類代謝物中的苜蓿素?7?O?蕓香糖苷、苜蓿素?7?O?新橙皮糖苷、香葉木苷和3,5,7,3′4′?五甲氧基黃酮，氨基酸及其衍生物類中的N?乙酰?L?酪氨酸，酚酸類代謝物中的芥子酰葡萄糖醛酸，核苷酸及其衍生物中的2′?脫氧胞苷?5′?單磷酸、黃嘌呤，木脂素和香豆素類代謝物中的傘形酮，生物堿類代謝物中的咖啡酰膽堿，有機酸類代謝物中的3?脲基丙酸，以及脂質(zhì)類代謝物中的油酸酰胺（9?十八碳烯酰胺）、1?亞油酰甘油酯?3?O?葡萄糖苷，在‘粵甜’與‘巴厘’中的積累差異倍數(shù)相對較大。

3 討論

3.1 低溫與植物抗氧化活性

植物的抗逆性是受多種因素影響的復(fù)雜的數(shù)量性狀，不僅表現(xiàn)在形態(tài)上，也表現(xiàn)在生理生化過程中。低溫脅迫下，植物通過逐漸積累可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸等物質(zhì)調(diào)節(jié)對逆境的適應(yīng)能力以降低膜脂的過氧化［2-3］；丙二醛作為過氧化作用的最終產(chǎn)物，其含量出現(xiàn)上升趨勢越早、上升幅度越大，抗寒性越差［6,17］。在本研究中，低溫處理后‘粵甜’的可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸含量均顯著高于‘巴厘’，而丙二醛含量顯著低于‘巴厘’?！浱稹憩F(xiàn)出更強的滲透調(diào)節(jié)能力，在低溫脅迫后質(zhì)膜受損傷程度低，這是其耐寒能力強的生理表現(xiàn)之一。這與在其他菠蘿品種上研究認(rèn)為耐寒性強的品種脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量高于不耐寒品種的結(jié)果一致［8,18］。高活性的抗氧化酶系統(tǒng)，高表達(dá)的抗氧化酶基因及低表達(dá)的ProDH基因，增強了‘粵甜’的抗氧化活性及滲透調(diào)節(jié)能力，維持了自由基產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡，降低了丙二醛積累，從而加快激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與物質(zhì)代謝，增強耐寒性［19-20］。

3.2 低溫與植物內(nèi)源激素轉(zhuǎn)導(dǎo)

植物內(nèi)源激素是抗寒基因的啟動因子，誘發(fā)抗寒生理反應(yīng)［21］。內(nèi)源IAA含量增加、GA信號受抑制均有利于增強抗寒性［4,22-23］；ABA作為脅迫激素可誘導(dǎo)植物增強抗寒性，具有較高ABA含量且能較大幅度增加ABA含量是耐低溫品種的重要生理特征［21,24］。本研究中與‘巴厘’相比，‘粵甜’的生長素類激素含量較高，赤霉素類激素含量較低且變化幅度較小，脫落酸/赤霉素比值高，可能是其耐寒性強于‘巴厘’的另一原因［25］。

低溫降低細(xì)胞分裂素的合成，而耐寒品種的ZR含量明顯高于不耐寒品種［26］；也有研究認(rèn)為低溫對細(xì)胞分裂素并無顯著影響［27］。在本研究中，除‘粵甜’的異戊烯腺嘌呤核苷顯著升高外，低溫處理對細(xì)胞分裂素類激素?zé)o顯著影響，但‘粵甜’中的含量高于‘巴厘’。另外，低溫處理后，‘粵甜’的茉莉酸類、水楊酸類及獨角金內(nèi)酯激素含量也均高于‘巴厘’。低溫脅迫下高含量的茉莉酸、水楊酸及獨角金內(nèi)酯激素能降低過氧化物的積累，增強植物耐寒性。類似的研究結(jié)果在蔬菜及糧油作物等上也有報道［6, 28-30］

乙烯能改善逆境對植物的不利影響，番茄抗冷/抗凍能力的增強伴隨著乙烯含量增加［31］。低溫脅迫下，外源乙烯能提高田間香蕉植株脯氨酸和可溶性蛋白含量及抗氧化酶活性，降低MDA 積累，增強耐寒能力。本研究中，低溫處理后，‘粵甜’中ACC含量略微升高，而‘巴厘’中則顯著降低，相比較，‘粵甜’中的ACC含量高于‘巴厘’。

3.3 低溫與植物生理代謝

本研究通過廣靶代謝組分析，篩選出‘粵甜’‘巴厘’間大量差異代謝物，而且低溫處理后的差異代謝物更多，表明‘粵甜’‘巴厘’2個品種對低溫脅迫的響應(yīng)存在明顯差異，這與在油菜上的研究結(jié)果相似［32］?？鼓嫫贩N在非脅迫條件下即有較高的相關(guān)物質(zhì)積累［33］，本研究中多數(shù)差異代謝物在‘粵甜’中的積累高于‘巴厘’，為其后期代謝活動和應(yīng)對低溫環(huán)境響應(yīng)提供了更好物質(zhì)基礎(chǔ)，這可能是‘粵甜’低溫適應(yīng)性強的潛在原因。無論是常溫下還是低溫處理后，‘粵甜’‘巴厘’間的差異代謝物均是黃酮類、酚酸類、脂質(zhì)類、氨基酸及其衍生物類代謝物居多，這與前期研究結(jié)果相似［11］。

逆境時植物通過合成大量黃酮類物質(zhì)提高自由基清除和抗氧化活力［34-35］，其含量與抗寒強弱相關(guān)［36］。在本研究中，低溫處理后大量黃酮類代謝物在‘粵甜’中的積累顯著高于‘巴厘’，能提高內(nèi)源性抗氧化物酶活性增強抗氧化活力，降低DNA損傷［37-39］。此外，酚酸類代謝物芥子酰葡萄糖醛酸，核苷酸及其衍生物類代謝物2′?脫氧胞苷?5′?單磷酸、黃嘌呤，木脂素和香豆素類代謝物傘形酮，生物堿類代謝物咖啡酰膽堿，脂質(zhì)類代謝物油酸酰胺（9?十八碳烯酰胺）、1?亞油酰甘油酯?3?O?葡萄糖苷，經(jīng)低溫處理后在‘粵甜’中的含量積累顯著高于‘巴厘’，且差異倍數(shù)相對較大。這些具有強抗氧化脅迫、清除氧自由基能力代謝物［40-45］，與黃酮類代謝物一起為‘粵甜’菠蘿的耐寒性狀形成發(fā)揮了重要作用。

4 結(jié)論

低溫脅迫下，‘粵甜’比‘巴厘’具有更高含量的可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸，及更高活性的抗氧化酶系統(tǒng)和高表達(dá)的抗氧化酶基因；‘粵甜’的內(nèi)源生長素、細(xì)胞分裂素、茉莉酸、水楊酸及獨角金內(nèi)酯含量高于‘巴厘’，赤霉素、脫落酸含量低于‘巴厘’；黃酮類、酚酸類、脂質(zhì)類、氨基酸及其衍生物類代謝物在‘粵甜’中的含量積累高于‘巴厘’，這些是‘粵甜’耐寒性比‘巴厘’強的生理代謝基礎(chǔ)。