蔣晶晶 周昭旭 杜蕙 呂昭龍 王春明 郭建國張新瑞 李繼平1，，3

（1. 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，蘭州 730070；2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，蘭州 730070；3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部天水作物有害生物科學(xué)觀測試驗站，天水 741299）

蘋果在我國北方廣泛種植，甘肅的蘋果種植面積達(dá)44.13萬hm2，是全國蘋果的主產(chǎn)省份之一［1］。病蟲害導(dǎo)致的檢疫問題是我國蘋果國際市場準(zhǔn)入的重要挑戰(zhàn)［2］。蘋果褐腐病是美國、加拿大、澳大利亞等國的檢疫對象，是嚴(yán)重危害蘋果生產(chǎn)的一種世界性病害，該病不僅在果樹生長期進(jìn)行危害，造成花腐、果腐、枝條潰瘍等，還能引起儲藏期爛果，對蘋果產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重威脅［3］。

蘋果褐腐病病原菌主要有6種，其中有性態(tài)3個種［4］：實生鏈核盤菌（M. fructicola）、核果鏈核盤菌（M. laxa）和果生鏈核盤菌（M. fructigena）；未發(fā)現(xiàn)有性態(tài)的3個叢梗孢屬種［5-7］：梅生鏈核盤菌（M.mumecola）、云南鏈核盤菌（M. yunnanensis）和多子座鏈核盤菌（M. polystroma）。雖然不同的褐腐病菌種群都能侵染果樹引起褐腐病，但其分布及寄主偏好有一定差異。目前，世界上報道的能侵染蘋果并引起褐腐病的病原菌種類主要有：M. fructicola［8］、M. laxa、M. fructigena［9］、M. polystroma［10］和M.yunnanensis［11］，其中陜西、河北、北京、云南、新疆等蘋果產(chǎn)區(qū)的優(yōu)勢致病菌為（M. yunnanensis），甘肅地區(qū)蘋果褐腐病的致病菌種類報道較少。因此，明確蘋果褐腐病致病菌種類對甘肅地區(qū)蘋果病害防治具有重要指導(dǎo)意義。

對蘋果褐腐病的防治，生產(chǎn)上主要采用化學(xué)殺菌劑，如波爾多液、甲基托布津等［12］。化學(xué)殺菌劑的長期大量使用，導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，同時農(nóng)藥殘留會污染生態(tài)環(huán)境，影響蘋果的品質(zhì)與安全。生物防治是一種高效、無毒、無污染的防治策略，且不易使病原菌產(chǎn)生抗藥性。近年來，越來越多的生物農(nóng)藥被開發(fā)應(yīng)用，毛殼菌是一種極具生防潛力的真菌，能夠產(chǎn)生大量的纖維素酶［13］，可以抑制病原菌生長，如球毛殼菌（Chaetomium globosum）可用于防治蘋果褐腐病并開發(fā)為防治蘋果采后病害的生防制劑［14］；芽孢桿菌屬的菌株因其營養(yǎng)需求簡單、繁殖生長快、代謝產(chǎn)物豐富、可產(chǎn)抗逆性芽孢等特點而具有顯著的生防潛力，成為研發(fā)生防菌劑的理想菌株［15］。目前報道的對褐腐病菌有顯著抑制作用的芽孢桿菌有死谷芽孢桿菌（Bacillus vallismortis）、高地芽孢桿菌（B. altitudinis）和特基拉芽孢桿菌（B.tequilensis）［16-17］，但國內(nèi)外對于拮抗M. yunnanensis的生防芽孢桿菌篩選研究較少。

本研究從甘肅蘋果主產(chǎn)區(qū)（靜寧及榆中縣）采集褐腐病病果，分離并鑒定病原菌。以其為供試靶標(biāo)菌，從本實驗室已保存的內(nèi)生拮抗菌庫中篩選優(yōu)良拮抗菌，測定其對褐腐病防病效果，明確拮抗菌種類與特性，旨在探明引起甘肅靜寧縣及榆中縣蘋果褐腐病的病原菌種類，以期獲得對蘋果褐腐病有較強(qiáng)生防作用的拮抗菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 供試病原真菌：蘋果褐腐病病果采集于甘肅省靜寧縣和榆中縣，品種為‘秦冠’和‘紅富士’，并于同地區(qū)采集‘秦冠’和‘紅富士’健康果實若干作為離體接種試驗用材料。

供試拮抗細(xì)菌：健康葡萄植株的根、莖、葉中分離篩選得到的5株具有廣譜性的內(nèi)生拮抗菌，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所經(jīng)濟(jì)作物病害研究室保存。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然；牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（NA）：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NB）：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化 采用常規(guī)組織分離法［18］，在超凈工作臺內(nèi)選取發(fā)病中期的褐腐病病果，在病健交界處用手術(shù)刀切取約為5 mm×5 mm的組織，用75%的酒精浸泡30 s，再用1%次氯酸鈉溶液處理3 min，滅菌水沖洗3次后，在滅菌干燥濾紙上自然風(fēng)干，然后置于PDA培養(yǎng)基中，25℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)3-4 d，待長出菌落后挑取菌絲尖端進(jìn)行純化，轉(zhuǎn)接至PDA斜面4℃保存。對分離所得的菌株依據(jù)病害縮寫（HF）+字母原則對其進(jìn)行命名。

1.2.2 病原菌回接（柯赫氏法則） 采用室內(nèi)離體果實打孔接種菌餅和孢子懸浮液的方法進(jìn)行致病性測定。選擇大小均勻、成熟度一致無病蟲斑和機(jī)械損傷的‘秦冠’和‘紅富士’蘋果作為接種材料。試驗前將果實用75%酒精擦洗，隨后用滅菌水沖洗3次，待果實表皮自然風(fēng)干后備用。

打孔接種菌餅法：先用滅菌打孔器（直徑5 mm）在果實赤道部位打孔，深度為3 mm，用滅菌打孔器（直徑5 mm）在事先活化5 d的新鮮菌落邊緣打取菌餅，菌絲面緊貼于孔內(nèi)，以空白PDA菌餅為對照。

打孔接種孢子懸浮液法：用移液器吸取濃度約為1×105個/mL的孢子懸浮液15 μL注于孔內(nèi)，以接種滅菌水為對照。以上每處理3個果實，每個果實設(shè)3個接種點，共9個重復(fù)。將處理后的果實置于鋪有保濕紗布的密封15 L塑料盒中，25℃ 12 h光暗交替培養(yǎng)，第5天觀察并統(tǒng)計果實發(fā)病情況，對發(fā)病果實進(jìn)行病原菌再分離。

1.2.3 病原菌形態(tài)鑒定 將分離純化的病原菌轉(zhuǎn)接于PDA平板上，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。6 d后進(jìn)行菌落形態(tài)、生長速率、孢子大小等觀察和測定。參照Lane［19］形態(tài)學(xué)鑒定方法和《真菌鑒定手冊》［20］進(jìn)行供試菌株的形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定 將菌株接種在鋪有滅菌玻璃紙的PDA平板上進(jìn)行培養(yǎng)，25℃恒溫黑暗培養(yǎng)5 d后收集菌絲，采用CTAB法［21］提取菌株基因組DNA。選取真菌通用引物ITS1（5′?TCCGTAG?GTGAACCTGCGC?3′）和ITS4（5′?TCCTCCGCTTATT?GATATGC?3′）進(jìn)行擴(kuò)增。25 μL PCR反應(yīng)體系為2×PCR Master Mix 12.5 μL、正反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL、DNA模板1.0 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。PCR擴(kuò)增程序為94℃ 2 min；94℃ 45 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將陽性條帶的樣送生工生物工程（上海）有限公司測序，所測序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST同源性比對分析比對。下載GenBank中的相似性較高的序列用MEGA 5.0程序中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，共循環(huán)1 000次。

1.2.5 拮抗細(xì)菌的篩選與鑒定

1.2.5.1 拮抗細(xì)菌的篩選 以蘋果褐腐病病原菌為靶標(biāo)菌，采用平板對峙法［22］篩選拮抗細(xì)菌。將病原菌置于PDA培養(yǎng)基25℃活化培養(yǎng)7 d后打成直徑0.5 cm的菌餅，接種在PDA培養(yǎng)基中央，5株拮抗菌經(jīng)NA培養(yǎng)基28℃，48 h活化后點接在距菌餅2.5 cm處，每平板4點，以不接生防菌為對照，重復(fù)3次。置于25℃培養(yǎng)，待對照病菌長滿培養(yǎng)皿時，測量菌落直徑，計算抑制率。

1.2.5.2 離體果實防效測定 參考Sadeghian等［23］方法，用紅富士蘋果測定拮抗菌對褐腐病菌的抑制活性。拮抗菌菌懸液的制備：將拮抗菌接種于150 mL的NB培養(yǎng)基，在28℃，轉(zhuǎn)速150 r/min搖培48 h，到達(dá)穩(wěn)定期得到菌懸液。選取大小均一的紅富士蘋果果實，用75%酒精擦洗，滅菌水沖洗后晾干，用滅菌打孔器（直徑5 mm）在果實赤道部位打5 mm（寬）×3 mm（深）的傷口，用于接種。設(shè)置3個處理：（1）預(yù)防組，接種M. yunnansis菌餅前24 h往孔口內(nèi)接種15 μL菌懸液。（2）治療組，接種M. yunnansis菌餅時接種菌懸液及接種M. yunnansis菌餅24 h后接種菌懸液。（3）對照組，僅接種M.yunnansis菌餅。以上每處理3個果實，每個果實設(shè)3個接種點，共9個重復(fù)。將處理后的果實置于鋪有保濕紗布的密封15 L保鮮盒中，25℃ 12 h光暗交替培養(yǎng)，接種生防菌液5 d后測量病斑大小。

1.2.5.3 拮抗菌形態(tài)學(xué)及生理生化指標(biāo)測定 將拮抗菌株于NB和PDA平板上劃單菌落，37℃培養(yǎng)24 h，參照東秀珠《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［24］進(jìn)行菌落形態(tài)觀察和生理生化特性鑒定，并對菌株進(jìn)行革蘭氏染色，在油鏡下觀察形態(tài)特征。

1.2.5.4 拮抗菌分子生物學(xué)鑒定 采用天根細(xì)菌基因組提取試劑盒，按照說明方法提取菌株基因組DNA。根據(jù)16S rRNA兩端的保守序列，采用細(xì)菌鑒定通用引物27F（5′?AGAGTTTGATCCTGGCTCAG?3′）和1492R（5′?GGTTACCTTGTTACGACTT?3′）及gyrA基因引物gyrA?F（5′?CAGTCAGGAAATGCG?TACGTCCTT?3′）和gyrA?R（5′?CAAGGTAATGCTC?CAGGCATTGCT?3′）進(jìn)行擴(kuò)增。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。50 μL PCR反應(yīng)體系為10×buffer（含2.5 mmol/L Mg2+）5.0 μL、Taq聚合酶（5 U/μL）1.0 μL、dNTP（10 mmol/L）1.0 μL、正反向引物各0.5 μL、基因組DNA 1.0 μL和ddH2O 41.0 μL。16S rRNA擴(kuò)增程序為94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃45 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 10 min。gyrA擴(kuò)增程序為94℃ 5 min；94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃1 min，30個循環(huán)；72℃ 10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認(rèn)PCR擴(kuò)增片段，并送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。用NCBI網(wǎng)站將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對分析，用MEGA 5.0程序中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)用Excel 2007處理后，采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 17.0對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間采用t檢驗法多重比較其差異顯著性，以P＜0.05作為判斷其顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 蘋果褐腐病病原菌分離鑒定及致病性測定

2.1.1 蘋果褐腐病病原菌的分離 蘋果褐腐癥狀主要表現(xiàn)為果實黃褐色軟腐并在表面形成褐色圓形斑點，后期病斑蔓延至全果，褐色圓形斑點變?yōu)樗{(lán)黑色并凹陷致使果實皺縮，提前黃化形成畸形僵果（圖1?A），部分病果上出現(xiàn)點狀灰色霉層（圖1?B）。從自然發(fā)病的蘋果果實上分離純化得到5個形態(tài)一致的培養(yǎng)物，命名為HF?A-HF?E。

圖1 蘋果褐腐病果實自然發(fā)病癥狀及病原菌接種癥狀Fig. 1 Disease characteristics of brown rot of apple and symptoms of pathogenic inoculation

2.1.2 病原菌致病性測定 將分離的真菌回接于健康蘋果上進(jìn)行致病性測定。接種2 d后接種部位附近出現(xiàn)褐色病斑，5 d后接種部位褐色軟腐狀嚴(yán)重，已經(jīng)完全覆蓋果實的一側(cè)，果實表面陸續(xù)出現(xiàn)藍(lán)黑色菌絲斑塊，有少量白色菌絲及分生孢子產(chǎn)生，且菌餅接種后病斑擴(kuò)展速率為7.3 mm/d，快于孢子懸浮液接種的病斑擴(kuò)展速率6.9 mm/d；菌餅接種的腐爛病斑上更容易長出菌絲和分生孢子；病原菌在‘紅富士’品種上的致病力明顯強(qiáng)于‘秦冠’（圖1?CF）；發(fā)病癥狀與自然條件下發(fā)病癥狀一致且對照均未發(fā)病。

2.1.3 病原菌的形態(tài)特征 分離得到的5株病原菌在PDA平板上生長良好［（8.5±0.59）mm/d］，菌落最初為灰白色，后逐漸加深，最后變?yōu)榛液稚＞渲虚g顏色較深，邊緣整齊，氣生菌絲貼近培養(yǎng)皿生長，呈灰褐色纖維絮狀或絨氈狀，背面可見黑色的基質(zhì)或黑環(huán)。分生孢子梗不分枝，或二叉狀分枝，分枝多呈銳角，產(chǎn)孢梗長短不一。分生孢子無色，單孢［（10-21）μm×（7-12）μm］，鏈狀排列，卵圓形、長橢圓形和檸檬形，產(chǎn)孢量較少（圖2）。結(jié)合Lane［19］的褐腐病菌形態(tài)鑒定方法和魏景超《真菌鑒定手冊》［20］，5個分離株形態(tài)特征均與（M.yunnanensis）模式菌相似。

圖2 蘋果褐腐病菌的菌落形態(tài)及分生孢子形態(tài)Fig. 2 Colony and conidial morphology of apple brown rot bacteria

2.1.4 ITS序列擴(kuò)增與系統(tǒng)發(fā)育分析 5個分離菌株的ITS片段大小均為482 bp，且比對后只有1個堿基存在差異，因此，將5個分離物視為同一種菌，序列上傳至GenBank，獲得登錄號為OL440404。在NCBI中進(jìn)行BLAST分析，分離株ITS序列與M.yunnanensis相似度在99%以上。從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載相似性最高的同種和近似種褐腐病菌菌株的若干序列，以核盤菌科蠟盤菌屬（Rutstroemia paludosa）為外群，用MEGA 5.0軟件，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。結(jié)果（圖3）表明，代表菌株HF?A與M. yunnanensis聚在同一分支，與M.fructigena歸在同一個大分支，表明甘肅靜寧縣及榆中縣蘋果褐腐病的病原菌為M. yunnanensis，與M.fructigena親緣關(guān)系較為接近。

圖3 基于rDNA-ITS序列采用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree constructed using the neighbourjoining based on rDNA-ITS sequences

2.2 拮抗菌的抑菌效果與鑒定

2.2.1 拮抗菌對蘋果褐腐病菌的抑制作用 從5株廣譜性較好的拮抗菌中篩選得到3株對M.yunnanensis具有較好抑制效果的菌株。其中，拮抗菌X2?2和Zyx?3對褐腐病菌的抑制效果最好，抑菌率分別為（81.29±0.57）%和（80.08±0.66）%，抑菌帶寬度分別達(dá)（7.42±0.17）mm和（5.42±0.51）mm，各處理間差異均達(dá)顯著水平（P＜0.05）（表1）。因X2?2菌株對褐腐病菌的抑制效果最好，后續(xù)對其進(jìn)行離體果實上抑菌效果測定（圖4）。

圖4 拮抗菌X2-2對蘋果褐腐病菌的拮抗效果Fig. 4 Effect of antagonistic bacteria X2-2 against M. yun?nanensis

2.2.2 拮抗菌在果實上的抑菌效果 在25℃光暗交替條件下，第5天時處理A（治療組）全部發(fā)病，果實上病斑面積達(dá)24.3 cm2，對照病斑遍及果實的一側(cè)（面積達(dá)50.5 cm2），整體防治效果達(dá)52.0%；處理B（治療組）和處理C（預(yù)防組）病斑面積分別為0.5和0.4 cm2，防效分別為98.4%和98.8%，且差異不顯著，防治效果優(yōu)于處理組A（圖5和圖6）。表明菌懸液和病原菌同時接種或提前接種菌懸液均能發(fā)揮較好的防治效果。

圖5 接種時間對病斑面積和防治效果的影響Fig. 5 Effect of inoculation time on lesion area and control effect

圖6 X2-2菌懸液對蘋果褐腐病病斑擴(kuò)展的抑制效果Fig. 6 Inhibition effect of X2-2 bacterial suspension on the lesion expansion of M. yunnanensis

2.2.3 X2?2菌株的形態(tài)學(xué)鑒定 將菌株接種至PDA平板上，28℃培養(yǎng)5 d后，拮抗菌X2?2菌落似火山堆，呈乳白色不透明，表面粗糙有褶皺，邊緣不規(guī)則。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，菌體呈桿狀，革蘭氏染色陽性（圖7）。

圖7 拮抗菌X2-2的單菌落（A）和革蘭氏染色（B）Fig. 7 Colony（A）and Gram stain（B）of antagonistic bacterium X2-2

2.2.4 X2?2菌株的生理生化特性 根據(jù)常見微生物鑒定手冊可知，該拮抗細(xì)菌與解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens的生理生化特性一致（表2）。

表2 拮抗菌X2-2的生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical identification results of antagonistic bacterium X2-2

2.2.5 X2?2菌株的分子鑒定 在NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST比對分析發(fā)現(xiàn)，菌株X2?2的16S rRNA序列與解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（B.methylotrophicus）和貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）同屬近緣種，序列同源性達(dá)100%，從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出與其處在同一分支上，無法明確菌株X2?2種的分類地位。菌株X2?2的gyrA基因序列與已知解淀粉芽孢桿菌KU904810、KU847915和LC096068的gyrA基因序列同源性分別為99%，菌株X2?2與以上解淀粉芽孢桿菌屬同一分支，可將菌株X2?2鑒定為解淀粉芽孢桿菌（圖8）。根據(jù)gyrA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，可將更接近的解淀粉芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌清晰區(qū)分為2個分支。

圖8 基于16S rRNA（A）和gyrA（B）基因序列構(gòu)建的拮抗菌X2-2的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 8 Phylogenetic tree of antagonistic bacterium X2-2 based on 16S rRNA (A) and gyrA (B) sequences

3 討論

本試驗對采自甘肅省靜寧縣和榆中縣蘋果產(chǎn)區(qū)的褐腐病果上分離的菌株，采用ITS序列結(jié)合形態(tài)學(xué)將其鑒定為云南鏈核盤菌（M. yunnanensis），這與報道的中國梨和蘋果的褐腐病菌優(yōu)勢種為M.yunnanensis的研究結(jié)果一致［11］，而與周芳［25］和牛程旺等［26］報道的山西省和新疆蘋果、梨褐腐病主要病原菌種群為M. fructigena［25］研究結(jié)果不一致，這可能與不同地區(qū)的生態(tài)環(huán)境、氣候類型等因素有關(guān)。M. yunnanensis是2011年發(fā)現(xiàn)于我國云南省的新種，分布于云南的大部分地區(qū)［6］，同時也在北京、河北、陜西、甘肅、新疆及遼寧等省（市）采集到，可以危害桃、杏、山楂、蘋果及梨等［27-28］。據(jù)報道，不同地區(qū)蘋果褐腐病菌種群之間存在差異，本試驗僅對甘肅靜寧縣和榆中縣蘋果主產(chǎn)區(qū)的蘋果褐腐病進(jìn)行了研究，但有關(guān)全省和全國不同地區(qū)的褐腐病菌種群的遺傳多樣性需進(jìn)一步探索，為該病原菌的種群分化及不同地區(qū)核果類及仁果類果實褐腐病的有效防治提供理論依據(jù)。

芽孢桿菌屬由于其具有較好的抑制植物病原菌的能力，并且其產(chǎn)生的芽孢具有很強(qiáng)的抗逆性，有利于生防菌劑的生產(chǎn)、劑型加工及在環(huán)境中存活、定殖與繁殖，目前被廣泛用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域［29］。近幾年，已有學(xué)者篩選出了一些拮抗M. fructigena的貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）［30］、拮抗M. fructicola的解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）和特基拉芽孢桿菌（B. tequilensis）［17］、地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）［31］，但國內(nèi)外對于拮抗M. yunnanensis的生防菌篩選研究較少，本研究通過平板對峙篩選出抑菌效果最好的解淀粉芽孢桿菌X2?2，對M.yunnanensis的菌絲抑制率達(dá)（81.29±0.57）%，在離體果實上打孔接種拮抗菌菌懸液24 h后再接種病原菌菌餅，拮抗菌的防治效果高達(dá)98.8%，說明該拮抗菌具有很強(qiáng)的附著能力，能在受傷果實表面迅速定殖，有效降低果實病斑擴(kuò)展速度。現(xiàn)在普遍認(rèn)為，與病原物進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)與空間位點競爭是拮抗微生物防治病害最主要的作用機(jī)制之一［32］。本研究中接種M. yunnansis菌餅同時接種菌懸液的處理與接種M.yunnansis菌餅24 h后接種菌懸液的處理，培養(yǎng)5 d后防治效果分別為98.4%和52.0%，說明病原菌與拮抗菌同時接種時拮抗菌能夠更快地利用果實機(jī)械傷口處的營養(yǎng)，阻止病原菌的侵入和擴(kuò)展，這也很好解釋了為什么越早接種拮抗菌生防效果越好。但關(guān)于該菌株在實際儲藏果實上的防治效果還需進(jìn)一步試驗驗證。

4 結(jié)論

甘肅靜寧縣及榆中縣的蘋果褐腐病的病原菌為云南鏈核盤菌（M. yunnanensis）。以該病原菌為靶標(biāo)，以分離自葡萄的5株優(yōu)良拮抗內(nèi)生菌為研究對象，篩選得到抑制效果最好的拮抗細(xì)菌X2?2，將其鑒定為解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）。該菌株具有較好的生防潛力，病原菌與菌懸液同時接種至離體果實，培養(yǎng)5 d后防效仍達(dá)98.4%，可用于開發(fā)蘋果采后病害防治的生防制劑。