王兵 趙會(huì)納 余婧 陳杰 駱梅 雷波

（1. 貴州省煙草科學(xué)研究院 煙草行業(yè)分子遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550081；2. 貴州醫(yī)科大學(xué)生物與工程學(xué)院（健康醫(yī)藥現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)學(xué)院），貴陽(yáng) 550025）

植物葉芽由莖尖分生組織及側(cè)生分生組織、葉原基等組成，是直接影響作物結(jié)實(shí)和產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀之一，生產(chǎn)實(shí)踐中，人們通常通過(guò)調(diào)控葉芽生長(zhǎng)發(fā)育以達(dá)到增產(chǎn)增效的目的［1-2］。栽培煙草（Nicotiana tabacum）作為特種葉用經(jīng)濟(jì)作物之一，生產(chǎn)過(guò)程中因“打頂”后腋芽數(shù)量激增嚴(yán)重影響煙葉品質(zhì)和產(chǎn)量。傳統(tǒng)消除腋芽主要通過(guò)“抹杈”及化學(xué)抑芽劑處理，不僅成本高，而且易導(dǎo)致煙草病蟲(chóng)害滋生，嚴(yán)重制約煙葉生產(chǎn)高質(zhì)量發(fā)展。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、油菜（Brassica napus）等植物株型改良中的廣泛應(yīng)用，利用該技術(shù)調(diào)控?zé)煵萑~芽發(fā)育將會(huì)逐步實(shí)現(xiàn)［3-6］。當(dāng)前關(guān)于煙草葉芽分子調(diào)控研究還較少，挖掘調(diào)控葉芽發(fā)育的相關(guān)基因，對(duì)于在煙草生產(chǎn)中減工降本和減少農(nóng)藥使用具有重要的意義。

HD?Zip III（homeodomain?leucine zipper protein III）作為植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，廣泛參與調(diào)控植物多種細(xì)胞分化，如分生組織形成、胚胎形態(tài)建成、維管組織發(fā)育、側(cè)生器官發(fā)生及極性建立等［5,7-10］。擬南芥HD?Zip III基因家族包括5個(gè)成員（PHV/PHB/ATHB8/REV/CNA），它們存在高度保守結(jié)構(gòu)域，功能呈現(xiàn)冗余性，除AtHB8外，其余HD?Zip III家族基因在葉原基、側(cè)根原基、頂端分生組織均有不同程度的表達(dá)，而只有rev突變體表現(xiàn)出分枝數(shù)量顯著減少，同時(shí)葉片發(fā)育異常［11-13］。此外，rev隱性純合突變體ifl1還觀(guān)察到纖維細(xì)胞的細(xì)胞壁增厚過(guò)程受阻［14］。相較于擬南芥顯性突變體rev?10d，phv/phb/rev三重基因突變體表現(xiàn)出相對(duì)較少的側(cè)根數(shù)量，說(shuō)明在根發(fā)育過(guò)程中PHV、PHB、REV存在協(xié)同作用［15］。擬南芥athb8/cna/rev三重基因突變體表現(xiàn)出比rev單突變體更多的側(cè)枝數(shù)量, 說(shuō)明在側(cè)枝形成過(guò)程中AtHB8、CNA、REV存在拮抗作用［7］。Shi等［16］通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)擬南芥HD?Zip III 轉(zhuǎn)錄因子家族的REV能直接結(jié)合 STM基因，使STM表達(dá)量上調(diào)，從而促使AM（axillary meristem）起始。此外，研究還發(fā)現(xiàn) STM位點(diǎn)在不同組織中的組蛋白甲基化修飾差異會(huì)影響 REV 對(duì) STM的表達(dá)調(diào)控。研究表明DRN/DRNL?REV和ZPR?REV蛋白互作調(diào)控模型影響AM起始，ZPR（LITTLE ZIPPER3）在葉腋中表達(dá)并干擾 DRN/DRNL?REV相互作用以負(fù)調(diào)節(jié)STM表達(dá)控制AM 啟動(dòng)［17］。在A(yíng)M起始的早期階段ARGONAUTE10（AGO10）可能通過(guò)結(jié)合miR165/166并導(dǎo)致miRNA的降解，而miR165/166靶基因REV活性激活，從而實(shí)現(xiàn)REV表達(dá)對(duì) AM 啟動(dòng)的時(shí)間和空間精確調(diào)控［18］。綜上可知，HD?Zip III轉(zhuǎn)錄因子成員間以拮抗或者協(xié)同方式參與調(diào)控植株的形態(tài)發(fā)育過(guò)程。

陳浣等［19］對(duì)煙草NtHD?Zip III基因家族進(jìn)行鑒定及表達(dá)數(shù)據(jù)聚類(lèi)分析，結(jié)果表明相較于擬南芥HD?Zip III基因家族數(shù)量，NtHD?Zip III基因家族數(shù)量顯著增加，共鑒定到19個(gè)，其中REV基因?qū)τ谌~芽的發(fā)育是必需的。REV基因參與調(diào)節(jié)分生組織形成，但因煙草缺少rev 突變體，對(duì)REV基因在葉芽發(fā)育過(guò)程中的分子機(jī)制仍有待研究。本研究將通過(guò)CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)定向突變NtREV基因的不同單靶點(diǎn)，通過(guò)PCR測(cè)序鑒定NtREV基因編輯形式，以期獲得煙草rev純合突變體，探究NtREV基因不同靶點(diǎn)在調(diào)控?zé)煵萑~芽發(fā)育中功能，為闡述NtREV在調(diào)控?zé)煵萑~芽發(fā)育的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為烤煙品種 K326（Nicotiana tabacum CV. K326）、農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞菌株LB4404（Agrobacterium tumefaciens）、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Top10（Escherichia coli），均由實(shí)驗(yàn)室提供。質(zhì)粒小提取試劑盒、DNA純化試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA Taq酶、DNA Marker等試劑均從天根生化科技（北京）有限公司購(gòu)置。限制性?xún)?nèi)切酶Bsa I?HF、Nhe I、Spe I和T4 DNA連接酶（T4 DNA ligase）購(gòu)自NEB（北京）有限公司?？股兀喊逼S青霉素（ampicillin, Amp）、卡那霉素（kanamycin,Kan）、潮霉素（hygromycin, Hyg）和利福平（rifampicin,Rif）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。引物合成和基因測(cè)序由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。pYAO?based CRISPR/Cas9植物編輯載體系統(tǒng)由中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所焦雨鈴教授饋贈(zèng)，該系統(tǒng)由sgRNA（single guide RNA）表達(dá)盒中間載體AtU6?26?sgRNA?SK和轉(zhuǎn)化植物用的終載體pCAMBIA1300?pYAO?Cas9兩部分構(gòu)成。

1.2 方法

1.2.1 靶點(diǎn)區(qū)域選擇和pYAO?based CRISPR/Cas9載體構(gòu)建 通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)（Nitab v4.5: https://solgenom?ics.net/organic/Nicotiana_tabacum/genome）檢索煙草REV基因并預(yù)測(cè)REV基因外顯子和內(nèi)含子數(shù)量，利用（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/?term）分析REV氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域。利用CRISPR?P軟件（http://crispr.hzau.edu.cn）［20］在煙草REV基因目標(biāo)區(qū)域搜尋靶點(diǎn)，通過(guò)blast 檢索最佳靶點(diǎn)，由于編輯系統(tǒng)AtU6?26?sgRNA?SK載體的AtU6?26啟動(dòng)子與gRNA序列中間包括兩個(gè)Bsa I和一個(gè)EcoR I酶切位點(diǎn)，使用Bsa I酶切后，會(huì)分別留下與ATTG和AAAC匹配的黏性末端，因此要求在靶標(biāo)序列兩端分別添加5′?ATTG?3′和5′?AAAC?3′接頭引物，用黑色加粗字體表示接頭引物靶位點(diǎn)序列為5′?ATTGGCTCGATATTCGACAGAATAGGG?3′和 5′?AAACCCCTATTCTGTCGAATATCGAGC?3′（C15）/5′?ATTGACAGTAGTGGAAAGTATGTCCGG?3′和5′?AAACCCGGACATACTTTCCACTACTGT?3′（C16）。使用Bsa I酶切AtU6?26?sgRNA?SK質(zhì)粒，將目標(biāo)基因的靶點(diǎn)序列連入酶切后的AtU6?26?sgRNA?SK質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Top10，涂含有Amp抗性的LB平板，挑選單克隆利用AtU6?26?sgRNA?SK載體上正向引物SK?gR?NA?F：5′?CTCACTATAGGGCGAATTGG?3′和靶點(diǎn)序列反向引物C15NtREV?T1R：5′?AAACCCCTATTCT?GTCGAATATCGAGC?3′做菌落PCR鑒定并測(cè)序。將測(cè)序正確的重組子用Spe I和Nhe I進(jìn)行雙酶切，回收酶切片段即sgRNA cassette，同時(shí)用Spe I 酶切pCAMBIA1300?pYAO?Cas9質(zhì)粒，將含有靶點(diǎn)序列的sgRNA cassette片段連入pCAMBIA1300?pYAO?Cas9載體，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，涂含有Kan抗性的LB平板，挑選單克隆利用表1中位于Spe I上下游的引物做菌落PCR鑒定并測(cè)序。

表1 本研究引物序列及用途Table 1 Sequences and purpose of primers in this study

1.2.2 煙草REV基因轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性苗檢測(cè) 將構(gòu)建成功的pCAMBIA1300?pYAO?Cas9重組子轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞 LB4404，在含有抗性的LB固體培養(yǎng)基（50 μg/mL Kan, 25 μg/mL Rif）上進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，并通過(guò)載體引物和靶點(diǎn)序列引物檢測(cè)陽(yáng)性菌落（表1）。挑取陽(yáng)性菌落利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行煙草遺傳轉(zhuǎn)化，并收集T0代種子［21］。取上述收獲的T0代煙草種子，用0.1%次氯酸鈉和75%酒精進(jìn)行表面消毒后，利用無(wú)菌水清洗干凈置于超凈臺(tái)滅菌濾紙上，待風(fēng)干之后，將種子撒播在1/2 MS固體培養(yǎng)基（25 μg/mL Hyg）培養(yǎng)15 d主根長(zhǎng)于2-3 cm的幼苗，移栽到草炭土中放入人工氣候箱繼續(xù)培養(yǎng)（溫度25℃、濕度70%、16 h光照/8 h黑暗、4 000 lx）。同等條件下種植野生型煙草作為對(duì)照。等幼苗長(zhǎng)出5-7片葉后，取葉片，通過(guò)CTAB法分別提取待檢測(cè)陽(yáng)性苗和對(duì)照苗的基因組DNA，根據(jù)pCAMBIA1300?pYAO?Cas9質(zhì)粒的Hyg基因設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物（表1），鑒定煙草陽(yáng)性苗。

1.2.3 煙草REV突變體的檢測(cè) 依據(jù)靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)上下游檢測(cè)引物（表1），利用CTAB方法提取陽(yáng)性苗基因組DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增含有靶點(diǎn)序列的煙草REV基因DNA序列，同時(shí)將煙草野生型材料作為對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)回收直接送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。利用Chromas軟件和DNAMAN軟件對(duì)所有測(cè)序獲得的序列和煙草參考基因組REV基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，并統(tǒng)計(jì)編輯形式，選取純合突變體用于后續(xù)表型分析。

1.2.4 煙草REV突變體的頂芽、葉片、腋芽表型觀(guān)測(cè) 將上述檢測(cè)的發(fā)生REV基因純合編輯煙草幼苗，播種草炭土中放入人工氣候箱繼續(xù)培養(yǎng)，生長(zhǎng)10 d，用體式顯微鏡觀(guān)察觀(guān)測(cè)頂芽生長(zhǎng)情況，同時(shí)利用解剖鏡解剖REV基因編輯純合突變體的煙草頂端分生組織，參考王兵［22］掃描電鏡樣品制作方法，通過(guò)用2.5%的戊二醛固定煙草解剖組織，0.1 mol/L的磷酸緩沖液多次清洗，再用乙醇濃度梯度逐級(jí)進(jìn)行脫水，將脫水的材料置入乙酸異戊酯置換乙醇，然后將煙草樣品放入液態(tài)CO2臨界點(diǎn)干燥，最后把樣品黏在有雙面導(dǎo)電膠的金屬載臺(tái)上，放入離子濺射儀中噴金，置于掃描電子顯微鏡中觀(guān)察，工作電壓為10 kV，觀(guān)察記錄煙草頂端分生組織特點(diǎn)，并選擇具有代表性的視野拍照記錄，同時(shí)將煙草野生型材料作為對(duì)照。

2022 年在貴州省煙草科學(xué)研究院福泉基地種植正常生長(zhǎng)的栽培煙草純合突變體和對(duì)照 K326，采用小區(qū)試驗(yàn)，3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)種植 30 株，行距1.1 m，株距 0.55 m，移栽密度 16 500 株/hm2，施氮量105 kg/hm2。參照煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《 YCT142?2010煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查測(cè)量方法》，在盛花期測(cè)量每個(gè)重復(fù)生長(zhǎng)相對(duì)一致的代表性9株煙草的自然株高和著生葉數(shù)，中心花開(kāi)放50%時(shí)進(jìn)行打頂同時(shí)去除已長(zhǎng)出的腋芽，在打頂后 28 d，一次性采集煙株的腋芽（打頂后生長(zhǎng)的）并稱(chēng)重。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用比較均值（獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)）分析編輯基因的材料和對(duì)照組的自然株高、自然葉數(shù)、腋芽鮮重等農(nóng)藝性狀的差異。

2 結(jié)果

2.1 sgRNA克隆框的構(gòu)建

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得煙草REV基因序列，結(jié)果表明NtREV基因含有兩個(gè)拷貝數(shù)，即NtREV1（Nitab4.5_0004624g0050.1）和NtREV2（Nitab4.5_0003131g0030.1），全長(zhǎng)分別為6 111 bp和6 105 bp，NtREV含18個(gè)外顯子和17個(gè)內(nèi)含子，NtREV氨基酸序列分析表明從N端到C端含有4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別是HD結(jié)構(gòu)域、Zip結(jié)構(gòu)域、START結(jié)構(gòu)域和MEKHLA結(jié)構(gòu)域，通過(guò)比對(duì)煙草NtREV氨基酸序列，NtREV1和NtREV2氨基酸同源性高達(dá)98.93%（圖1）。為了有效編輯煙草中NtREV，在NtREV基因的第一個(gè)外顯子上選取“脫靶可能性”較低的2個(gè)靶位點(diǎn)，靶點(diǎn)引物列于表1，下劃線(xiàn)表示PAM序列（圖2?A）。分別將合成的煙草NtREV單靶點(diǎn)引物經(jīng)過(guò)引物變性退火、Bsa I酶切和T4 DNA連接酶成功構(gòu)建AtU6?26?sgRNA?SK載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌、挑單菌落、擴(kuò)菌、提取質(zhì)粒，用Nhe I和Spe I 對(duì)提取的AtU6?26?sgRNA?SK?NtREV重組子質(zhì)粒通過(guò)雙酶切進(jìn)行核酸電泳，結(jié)果顯示，泳道1-10為NtREV靶點(diǎn)sgRNA表達(dá)盒和NtREV靶點(diǎn)序列，其中sgRNA表達(dá)盒序列和NtREV靶標(biāo)序列大小分別為3 507 bp 和642 bp，泳道11為AtU6?26?sgRNA?SK?NtREV重組子質(zhì)粒，表明NtREV靶標(biāo)序列已成功連入AtU6?26?sgRNA?SK載體（圖2?B）。

圖1 NtREV1（Nitab4.5_0004624g0050.1）和NtREV2（Nitab4.5_0003131g0030.1）氨基酸序列的同源性比較Fig. 1 Homology comparison of NtREV1 and NtREV2 amino acid sequences

2.2 植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1300?pYAO?Cas9?NtREV的構(gòu)建

為了將AtU6?26?sgRNA?SK?NtREV重組子中sgRNA表達(dá)盒序列連入線(xiàn)性化的 pCAMBIA1300?pYAO?Cas9載體，使用Spe I酶切pCAMBIA1300?pYAO?Cas9載體，同時(shí)將上述獲得Nhe I和Spe I酶切回收的產(chǎn)物與Spe I酶切pCAMBIA1300?pYAO?Cas9載體通過(guò)T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取12個(gè)單克隆使用載體特異引物1300?gRNA?F和1300?gRNA?R進(jìn)行PCR擴(kuò)增初步鑒定sgRNA表達(dá)盒序列是否連入表達(dá)載體（表1），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，泳道1-11均擴(kuò)增出sgRNA表達(dá)盒條帶，泳道12未擴(kuò)增出sgRNA表達(dá)盒條帶（圖3?A），最后挑選攜帶重組子的單菌落擴(kuò)菌，提取質(zhì)粒，通過(guò)Xba I 和 Kpn I 進(jìn)行酶切驗(yàn)證pCAMBIA1300?Pyao?Cas9?NtREV最終載體是否構(gòu)建成功，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明通過(guò)雙酶切獲得大小750 bp的含有NtREV靶標(biāo)的表達(dá)盒序列（圖3?B）。

圖3 植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1300-pYAO-Cas9-NtREV的構(gòu)建Fig. 3 Construction of the plant binary expression vector pCAMBIA1300-pYAO-Cas9-NtREV

2.3 煙草轉(zhuǎn)基因及陽(yáng)性苗的篩選和檢測(cè)

分別將兩個(gè)單靶點(diǎn)的重組子pCAMBIA1300?pYAO?Cas9?NtREV質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法浸染煙草，將煙草葉片置于含有Hyg抗性的培養(yǎng)基，共獲得48株能在培養(yǎng)基中正常生根的幼苗，其中靶點(diǎn)C15植株為24株，靶點(diǎn)C16植株為24株（圖4）。為進(jìn)一步確認(rèn)抗性苗為轉(zhuǎn)基因植株，提取抗性苗葉片基因組DNA，以Hyg基因特異引物對(duì)Hyg?F和Hyg?R進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)（表1），結(jié)果（圖4）顯示，48株待檢測(cè)材料中有44株材料的DNA模板擴(kuò)增出約700 bp目的條帶，表明成功獲得44株REV轉(zhuǎn)基因編輯植株，總體轉(zhuǎn)化效率為90.90%，其中靶點(diǎn)C15植株為21株，C15植株轉(zhuǎn)化效率為87.50%（圖4?A），靶點(diǎn)C16植株為23株，C16植株轉(zhuǎn)化效率為95.83%（圖4?B）。

圖4 轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)的核酸電泳Fig. 4 Nucleic acid electrophoresis for the detection of transgenic plants

2.4 煙草NtREV突變體的編輯形式檢測(cè)

為了驗(yàn)證構(gòu)建的NtREV基因編輯載體的有效性，用NtREV?CRISPR test?F/R引物對(duì)上述NtREV基因C15和C16的單靶點(diǎn)編輯T0代植株和野生型基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并通過(guò)測(cè)序分析編輯形式（表1）。測(cè)序結(jié)果表明，靶點(diǎn)C16編輯Ko?C16Ntrev基因突變體4株，其中NtREV基因靶點(diǎn)C16編輯的雙基因純合突變體1株，Ko?C16Ntrev?2編輯形成為NtREV1靶點(diǎn)PAM區(qū)域上游4位置的A堿基被刪除和NtREV2靶點(diǎn)PAM區(qū)域上游3位置的A堿基被刪除，距離NtREV起始密碼子183 bp位置缺失T堿基，導(dǎo)致NtREV氨基酸第60位置之后的移碼突變（L61S62→C61R62）；雜合編輯突變體3株，Ko?C16Ntrev?1編輯形成為NtREV1并未發(fā)生編輯和NtREV2靶點(diǎn)PAM區(qū)域上游4位置的A堿基被刪除，距離NtREV起始密碼子181 bp位置A堿基被替換成T堿基，導(dǎo)致NtREV氨基酸第60位置異亮氨酸突變?yōu)楸奖彼幔↖60→F60）；Ko?C16Ntrev?3編輯形成為NtREV1靶點(diǎn)PAM區(qū)域上游1位置的A堿基被G替換，上游4位置的A堿基被刪除，上游6位置的A堿基被T替換和NtREV2靶點(diǎn)PAM區(qū)域上游4位置的A堿基被刪除，距離NtREV起始密碼子183 bp位置缺失T堿基，180 bp 位置T堿基被替換成C堿基，185 bp位置 T堿基被替換成A堿基，導(dǎo)致NtREV氨基酸第59位置和第62位置未發(fā)生突變，NtREV氨基酸第60位置之后的移碼突變（L61S62→C61R62）；Ko?C16Ntrev?4編輯形成為NtREV1并未發(fā)生編輯和NtREV2靶點(diǎn)PAM區(qū)域上游2位置處的A替換T，距離NtREV起始密碼子181 bp位置A堿基被替換成T堿基，導(dǎo)致NtREV氨基酸第60位置異亮氨酸突變?yōu)楸奖彼幔↖60→F60）。

靶點(diǎn)C15編輯Ko?C15Ntrev基因突變體4株，其中NtREV基因靶點(diǎn)C15編輯的雙基因純合突變體1株，Ko?C15Ntrev?2編輯形成為靶點(diǎn)PAM區(qū)域上游5位置插入A堿基和NtREV1靶點(diǎn)PAM區(qū)域上游5位置插入A堿基，插入A堿基距離NtREV起始密碼子78 bp位置，導(dǎo)致NtREV氨基酸第26位置之后的移碼突變（V26R27→C26P27）；雜合編輯突變體3株，Ko?C15Ntrev?1編輯形成為NtREV1靶點(diǎn)PAM區(qū)域上游5位置插入A堿基和上游14位置G堿基替換A堿基，19位置A堿基替換T堿基；插入A堿基距離NtREV起始密碼子78 bp位置，64 bp 位置A堿基被替換成T堿基，69 bp位置 T堿基被替換成C堿基，導(dǎo)致NtREV氨基酸第22位置絲氨酸被替換成半胱氨酸（S22→C22）、NtREV氨基酸第23位置氨基酸未發(fā)生變化，NtREV氨基酸第26位置之后的移碼突變（V26R27→C26P27）；Ko?C15Ntrev?3編輯形成為NtREV1靶點(diǎn)PAM區(qū)域上游5位置插入A堿基和上游13和14位置TG堿基替換CA堿基；插入A堿基距離NtREV起始密碼子78 bp位置，69-70 bp TG堿基被替換成AC堿基，導(dǎo)致NtREV氨基酸第23位置絲氨酸被替換成精氨酸和第24位置甘氨酸被替換成精氨酸（S23G24→R23R23）、NtREV氨基酸第26位置之后的移碼突變（V26R27→C26P27）；Ko?C15Ntrev?4編輯形成為NtREV1靶點(diǎn)PAM區(qū)域上游5位置處插入A堿基和上游14位置G堿基替換A堿基，插入A堿基距離NtREV起始密碼子78 bp位置，69 bp位置 T堿基被替換成C堿基，NtREV氨基酸第23位置氨基酸未發(fā)生變化，NtREV氨基酸第26位置之后的移碼突變（V26R27→C26P27）（圖5）。

2.5 煙草REV突變體的表型觀(guān)測(cè)

與正常發(fā)育的野生型（圖6?I）相比，煙草NtREV單靶點(diǎn)的突變體均發(fā)生了不同程度頂芽缺失和葉片畸形（圖6），其中雙拷貝同源突變株系Ko?C15Ntrev?2呈現(xiàn)葉片畸形表型，展示出漏斗形葉、荷葉形葉等形態(tài)，表明突變體中REV基因功能受到不同程度的影響（圖6?A?F），而單拷貝同源突變體Ko?C15Ntrev?1、Ko?C16Ntrev?3 展示植株正常生長(zhǎng)（圖6?G, H）。為了進(jìn)一步分析NtREV在煙草芽發(fā)育中的功能，選擇了Ko?C15Ntrev和Ko?C16Ntrev編輯形式的rev突變體觀(guān)測(cè)表型（圖7），通過(guò)光鏡觀(guān)察可知，與野生型頂芽發(fā)育相比較（圖8?A, D, G），Ko?C15Ntrev雙拷貝同源突變表現(xiàn)出頂芽缺失，無(wú)法正常生長(zhǎng)（圖8?C, F, I）；Ko?C16Ntrev單拷貝同源突變體頂芽發(fā)育正常，但是頂芽發(fā)育遲緩（圖8?B, E,H）。通過(guò)大田種植統(tǒng)計(jì)煙草自然株高、葉片數(shù)量和腋芽鮮重，如圖9所示，Ko?C16Ntrev突變體自然株高較野生型增加3.76%（圖9?A），Ko?C16Ntrev突變體著生葉片數(shù)減少21.47%，達(dá)到極顯著差異（圖9?B, C），相較于WT（圖9?D），Ko?C16Ntrev突變體腋芽生長(zhǎng)形態(tài)正常，但腋芽數(shù)量和鮮重減少（圖9?E），Ko?C16Ntrev突變體腋芽鮮重較野生型顯著減少23.41%。

圖6 突變體材料和野生型材料的葉形態(tài)表型Fig. 6 Leaf morphological phenotypes of mutant and wildtype materials

圖7 煙草Ko-C15Ntrev和Ko-C16Ntrev突變體編輯形式Fig. 7 Editing forms of Ko-C15Ntrev and Ko-C16Ntrev mutants in tobacco

圖8 突變體材料和野生型材料的頂芽觀(guān)測(cè)Fig. 8 Observations of apical buds of mutant and wild-type ones

圖9 Ko-C16Ntrev突變體的自然株高、葉數(shù)、腋芽鮮重表型Fig. 9 Phenotypes of plant height, leaf numbers and fresh weight of C16Ntrev mutants

3 討論

3.1 煙草NtREV參與調(diào)節(jié)側(cè)生分生組織的發(fā)育

植物側(cè)枝的發(fā)育存在精細(xì)而又復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，研究報(bào)道植物HD?Zip III轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控側(cè)生分生組織的起始，尤其是擬南芥HD?Zip III基因家族成員中REV（AT5G60690）基因?qū)M啟動(dòng)的時(shí)間和空間精確調(diào)控。栽培煙草為異源四倍體，陳浣等［19］研究表明，栽培煙草NtHD?Zip III基因家族數(shù)量是擬南芥的4倍，表明隨著染色體加倍，NtHD?Zip III基因家族成員間功能出現(xiàn)分化以及功能冗余。相比較于擬南芥REV，栽培煙草中REV（NtREV1和NtREV2）存在兩個(gè)拷貝，因此，研究栽培煙草的REV基因功能需要將兩個(gè)基因同源拷貝同時(shí)敲除才可能實(shí)現(xiàn)表型。隨著CRISPR/Cas9編輯技術(shù)日趨完善，為栽培煙草等多倍體作物的基因功能和突變體創(chuàng)建提供了技術(shù)支撐。本研究創(chuàng)制的Ntrev突變體表現(xiàn)出頂芽缺失、葉畸形、葉片數(shù)量和腋芽鮮重顯著減少，說(shuō)明NtREV參與調(diào)控頂端分生組織、側(cè)生分生組織發(fā)育。Shi等［16］證實(shí)擬南芥中REV直接調(diào)控STM表達(dá)量，從而促進(jìn)側(cè)生分生組織起始。擬南芥ago10突變體研究表明，ARGONAUTE10（AGO10）結(jié)合miR165/166，通過(guò)降解miRNA，激活REV基因，從而實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)AM起始［18］。煙草NtREV基因發(fā)揮的功能與擬南芥AtREV功能一致，它們均參與了調(diào)節(jié)側(cè)生分生組織的發(fā)育。

煙草NtREV基因存在兩個(gè)拷貝，不同位置的單靶點(diǎn)的sgRNA表達(dá)盒編輯NtREV基因，導(dǎo)致了編輯形式多樣化，煙草rev突變體產(chǎn)生了不同的表型，對(duì)NtREV基因C16靶點(diǎn)的編輯氨基酸形式進(jìn)行分析，Ko?C16Ntrev?1和Ko?C16Ntrev?4材料NtREV氨基酸第60位置異亮氨酸均突變?yōu)楸奖彼幔↖60→F60），植株表現(xiàn)出頂芽生長(zhǎng)延遲，植株生長(zhǎng)正常，而Ko?C16Ntrev?2和Ko?C16Ntrev?3編輯材料的氨基酸編碼的蛋白形式進(jìn)行分析，結(jié)果表明NtREV氨基酸第60位置之后的移碼突變（L61S62→C61R62），植株表現(xiàn)出頂芽畸形、葉畸形等性狀。以上結(jié)果表明REV蛋白HD結(jié)構(gòu)域可能參與調(diào)節(jié)株型發(fā)育相關(guān)的基因，尤其是REV蛋白HD結(jié)構(gòu)域第60位置異亮氨酸調(diào)節(jié)分生組織組織分化，最終影響植株形態(tài)建成。這一結(jié)果與水稻REV缺失突變體lf1表現(xiàn)出側(cè)生器官極性發(fā)育缺陷的表型一致［23］。此外，具有穩(wěn)定遺傳性狀的Ko?C15Ntrev和Ko?C16Ntrev突變體表型最明顯，Ko?C15Ntrev頂芽缺失，Ko?C16Ntrev葉片數(shù)量和腋芽生物量顯著下降，這些突變體還表現(xiàn)出葉畸形、葉漏斗形、葉荷葉形等性狀變異，這些表型的出現(xiàn)可能是由于脫靶效應(yīng)導(dǎo)致假表型，也可能是由于編輯NtREV不同結(jié)構(gòu)域?qū)е鹿δ懿町悾?,24］。上述突變體為后續(xù)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)建立煙草NtREV調(diào)控葉芽發(fā)育的分子網(wǎng)絡(luò)提供了重要研究材料。

3.2 煙草NtREV通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)素合成影響側(cè)芽發(fā)育

煙草NtREV結(jié)構(gòu)分析表明存在HD?Zip III蛋白4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，HD和Zip結(jié)構(gòu)域比較保守，參與調(diào)控靶基因的表達(dá)，而START和MEKHLA結(jié)構(gòu)域在動(dòng)物研究中較多，參與了外界信號(hào)接收與傳遞［25-27］。然而，植物中關(guān)于HD?Zip III蛋白START和MEKHLA結(jié)構(gòu)域發(fā)揮的作用報(bào)道較少。目前，在植物中僅知道PYR蛋白START結(jié)構(gòu)域充當(dāng)ABA的受體結(jié)合脫落酸，調(diào)控脫落酸的信號(hào)通路［28］。后續(xù)可利用CRISPR/Cas9編輯技術(shù)對(duì)NtREV的 START和MEKHLA結(jié)構(gòu)域進(jìn)行定點(diǎn)編輯，分析其功能。

植株通過(guò)IAA極性運(yùn)輸，建立生長(zhǎng)素濃度梯度調(diào)節(jié)植物頂端優(yōu)勢(shì)。擬南芥REV缺失突變體ifl1生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PIN1的定位發(fā)生異常，生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸能力急劇下降，表現(xiàn)出植物頂端優(yōu)勢(shì)喪失。Brandt等［29］發(fā)現(xiàn)REV通過(guò)直接結(jié)合生長(zhǎng)素合成途徑的2個(gè)關(guān)鍵酶TAA1和YUCCA5的啟動(dòng)子調(diào)控元件序列（ATG/CAT）參與了生長(zhǎng)素的合成。這些結(jié)果表明，REV在轉(zhuǎn)錄水平上與生長(zhǎng)素關(guān)系密切。本研究創(chuàng)制的煙草NtREV突變體表現(xiàn)出頂芽缺失、葉片畸形，這可能是由于煙草NtREV中MEKHLA結(jié)構(gòu)域作為受體結(jié)合生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的信號(hào)分子改變REV構(gòu)象，形成二聚體激活下游生長(zhǎng)素合成的關(guān)鍵基因引起的表型。本研究證明了REV參與頂端分生組織和腋芽的發(fā)育。然而，栽培煙草中REV與生長(zhǎng)素合成間的關(guān)系，有待下一步利用上述突變體材料開(kāi)展NtREV調(diào)控生長(zhǎng)素合成分子機(jī)制的研究。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)成功編輯了栽培煙草中的NtREV基因，獲得了該基因不同單靶點(diǎn)的突變體，靶點(diǎn)C15雙拷貝同源突變體Ko?C15Ntrev表現(xiàn)出頂芽缺失表型，而靶點(diǎn)C16單拷貝同源突變體Ko?C16Ntrev表現(xiàn)出煙草葉片數(shù)量和腋芽鮮重顯著減少，表明NtREV參與了煙草頂端分生組織和腋芽發(fā)育，同時(shí)也說(shuō)明基因編輯位點(diǎn)不同將導(dǎo)致植株表型出現(xiàn)差異。