尹國英 劉暢 常永春，3 羽王潔，4 王兵 張盼 郭玉雙

（1. 貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽 550081；2. 西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶 400715；3. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，晉中 030800；4. 黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150006）

植物半胱氨酸蛋白酶是一類水解蛋白質(zhì)和多肽的酶，廣泛影響著植物的生理過程和逆境脅迫響應(yīng)［1］。CPs基因家族包括6個亞家族，C1A、C2A、C12、C13、C14、C15。C1是木瓜類蛋白酶，是6個亞家族中最大的一類，具有廣泛的底物特異性，與葉片衰亡過程密切相關(guān)［2-3］，分為C1A和C1B兩個亞類。其中，C1A攜帶用于分泌的信號肽并含有二硫鍵［4］；C1B位于細(xì)胞質(zhì)中，不具有二硫鍵［5］。C2屬于鈣依賴半胱氨酸蛋白酶，是一種不含信號肽且主要為胞漿蛋白的多肽［6］，其中只包含C2A一個亞類。C12又稱泛素C?末端水解酶，對泛素C末端Gly形成的鍵的水解具有高度選擇性［7］。C13是液泡加工酶，參與許多生理生化過程中的蛋白質(zhì)加工［8］。C14屬于天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，可以調(diào)控細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)機(jī)制［9］，包括C14A和C14B兩個亞類。C15為焦谷氨酰肽酶I（PGP?1），在哺乳動物中可以介導(dǎo)焦谷氨酸的釋放［9］。

植物依賴半胱氨酸蛋白酶活性來應(yīng)對各種外部刺激，包括生物和非生物脅迫［10］。研究發(fā)現(xiàn)，半胱氨酸蛋白酶能增強植物對病原物的免疫力，通過識別病原物的特定結(jié)構(gòu)域來激發(fā)植物體產(chǎn)生多種免疫反應(yīng)，誘發(fā)植物產(chǎn)生程序性死亡［11］。例如，半胱氨酸蛋白酶AtRD19缺失引起擬南芥對青枯病（bacterial wilt）的抗病性明顯減弱［12］，煙草半胱氨酸蛋白酶NtC14沉默后對疫霉（Phylophthora capsici）的感病性顯著增強［13］。煙草半胱氨酸蛋白酶NtCP6，可以與控制胚胎基底細(xì)胞系中程序性死亡的半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因NtCYS互作［14］。馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）的病毒是植物中已知的種類最多的一類RNA病毒，在世界各地許多作物中造成較大的產(chǎn)量損失［15-16］。煙草是公認(rèn)的植物遺傳學(xué)和功能基因組學(xué)研究的模式植物，也是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，PVY可引起煙草葉脈壞死病，發(fā)病嚴(yán)重時減產(chǎn)可達(dá)80%以上。

近幾年來，miRNA在植物病毒侵染過程中的作用也成為了病毒研究熱點［17-18］，很多miRNA可以參與抗病毒調(diào)控［19］，這些miRNA可以通過調(diào)控植物病原物相關(guān)分子模式觸發(fā)的免疫反應(yīng)進(jìn)行抗病毒應(yīng)答［20-21］。煙草中nta?miR6019/6020等能夠切割煙草的N基因從而降低煙草對煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）的抗性［20］。盡管miRNA參與植物病毒調(diào)控的研究相繼出現(xiàn)，但與PVY互作調(diào)控的研究十分有限。2016年，Iqbal等［22］發(fā)現(xiàn)了86個靶向PVY基因組151個不同位點的miRNAs，PVY基因組的CI基因被32個miRNAs靶向，但尚未對調(diào)控PVY的miRNA進(jìn)行功能驗證。對煙草small RNA測序發(fā)現(xiàn)，攜帶PVY病毒的煙草體內(nèi)的大量miRNAs表達(dá)量發(fā)生了顯著變化［23-24］。本研究使用生物信息學(xué)方法，在全基因組水平上對煙草半胱氨酸蛋白酶家族以及靶向該基因家族的miRNAs進(jìn)行鑒定，分析其在PVY感染后的表達(dá)特性。旨在闡明半胱氨酸蛋白酶基因家族及其對應(yīng)的miRNAs互作調(diào)控?zé)煵軵VY的響應(yīng)過程。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 普通煙草（Nicotiana tabacum L.）栽培品種K326。

1.1.2 病原微生物 PVYN（potato virus Y?vein necro?sis strain，煙草葉脈壞死型）病毒，該病毒以機(jī)械摩擦的方式接種到健康的煙草活體植株以保存病毒毒源。

1.1.3 基因組及數(shù)據(jù)庫文件 Pfam_A 來源于 Pfam數(shù)據(jù)庫（http://ftp.ebi.ac.uk/ pub/data bases/Pfam/curre nt_release/）；煙草K326的基因組文件來源于茄科數(shù)據(jù)庫（ftp://ftp.solgenomics.net/）。

1.1.4 試劑 RNA提取試劑盒（ER601?01）和反轉(zhuǎn)錄試劑盒（AT311）均購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；定量PCR試劑盒（FP210422）購自天根生化科技（北京）有限公司，其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 半胱氨酸蛋白酶基因家族鑒定 從MEROPS數(shù)據(jù)庫（Release 12.0）（http://www.ebi. ac.uk/merops）獲得半胱氨酸蛋白酶氨基酸序列及Pfam登錄號。在Pfam數(shù)據(jù)庫中下載人工標(biāo)注的結(jié)構(gòu)域文件Pfam?A.hmm（http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/Pfam/current_release/），并在茄科基因組網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫（ftp://ftp.solgenomics.net/）中下載Nicotiana tobacum_K326的基因組文件，包括蛋白序列（prot）、基因序列（fa）、全基因組注釋信息（gff3），作為原始數(shù)據(jù)。根據(jù)MEROPS數(shù)據(jù)庫的Pfam信息，在Pfam上查找相關(guān)結(jié)構(gòu)域的登錄號，分別為：C1A（PF00112）、C2A（PF00648）、C12（PF01088、PF12252、PF13898）、C13（PF01650）、C14A（PF00656）、C15（PF06162、PF01470），并分別將6個結(jié)構(gòu)域及其登錄號放進(jìn)新建文本中。利用TBtoolsv1.0987的hmm search功能，將對應(yīng)的蛋白序列、Pfam?A.hmm文件、目標(biāo)結(jié)構(gòu)域列表放到對應(yīng)位置，輸出結(jié)果文件，所得結(jié)果中會包括兩部分，分別是序列得分和結(jié)構(gòu)域得分。對得到的結(jié)果進(jìn)行篩選，首先利用Excel將數(shù)據(jù)分列，取同時滿足e?value在e-10以下，Domain覆蓋度在90%以上和bits得分在60以上的基因，并與MEROPS數(shù)據(jù)庫下載的半胱氨酸蛋白酶氨基酸序列進(jìn)行BLAST，得到70個目標(biāo)序列；利用TBtoolsv1.0987的Fasta Extract工具，輸入蛋白文件和目標(biāo)基因的蛋白序列，提取蛋白序列和基因序列；將篩選得到的半胱氨酸蛋白酶基因家族成員的基因名稱、蛋白名稱、起始位點、亞家族分類整理到Excel表中，并對其重命名。

1.2.2 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹 按照重命名后的基因ID將K326的蛋白序列整理成一個fasta文件，用MEGA11打開該文件，通過Alignment?Align by MUSCLE進(jìn)行序列比對，選擇默認(rèn)參數(shù)，將結(jié)果輸出為meg文件。點擊Phylogenetic Analysis構(gòu)建進(jìn)化樹，選擇鄰接法（neighbor?joining），設(shè)置參數(shù)Test of Phylogeny為Bootstrap Method，重復(fù)數(shù)設(shè)為1 000。得到進(jìn)化樹，保存為Newick格式。將Newick格式的文件輸入到EvolView網(wǎng)站（https://www.evolgenius.info/）進(jìn)行美化，將美化后的進(jìn)化樹輸出為PDF。

1.2.3 結(jié)構(gòu)域分析 將篩選后的半胱氨酸蛋白酶基因家族蛋白序列文件輸入到MEME網(wǎng)站（https://meme?suite.org/meme/tools/meme）中，Motif數(shù)量設(shè)為20，其余參數(shù)默認(rèn)。下載Motif圖和結(jié)果文件中的Mast.xml文件。利用TBtoolsv1.0987的Visualize Domain Pattern功能將mast文件可視化，得到結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果利用PhotoshopCS6將系統(tǒng)進(jìn)化樹與結(jié)構(gòu)域一一對應(yīng)。

1.2.4 啟動子分析 利用TBtoolsv1.0987的GXF Sequence Extract功能處理從數(shù)據(jù)庫中得到的全基因組注釋文件和基因組文件，選擇上游的2 000 bp序列，輸出結(jié)果。利用TBtoolsv1.0987的Fasta Extract or Filter（Quick）功能，輸入上一步的結(jié)果文件和目標(biāo)基因序列。將上述結(jié)果文件放到Plantcare的Search for CARE中，等待網(wǎng)站分析結(jié)果，下載匯總文件（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）。用Excel打開結(jié)果文件，篩選保留最后一列中有一定查看目的的元件，將基因名稱、起止位點、Domain名稱單獨提取出來，并將目標(biāo)基因ID和長度（2 000 bp）創(chuàng)建到一個新的文件中。利用TBtoolsv1.0987的Basic Biosequence View功能得到啟動子元件展示圖。

1.2.5 基因表達(dá)模式分析 使用Guo等［25］2017年發(fā)表的K326的RNAseq數(shù)據(jù)，分析感染PVYN后半胱氨酸蛋白酶基因在煙草葉片中的表達(dá)情況。首先，提取鑒定的半胱氨酸蛋白酶基因的在PVYN感染前后的FPKM數(shù)據(jù)，然后利用TBtools的HeatMap進(jìn)行可視化。為了分析靶向煙草半胱氨酸蛋白酶家族基因的miRNAs，根據(jù)課題組前期在PVY感染后small RNA測序和轉(zhuǎn)錄組測序［25］，利用psRNATarget軟件預(yù)測miRNA的靶基因，篩選和鑒定靶向半胱氨酸蛋白酶家族基因的miRNAs。使用Cyctoscape軟件對miRNAs與煙草半胱氨酸蛋白酶基因之間的調(diào)控關(guān)系進(jìn)行可視化展示。

1.2.6 PVY接種 所有煙草植株均種植于溫室，確保植株處于無菌無毒的環(huán)境中，待4葉期取一半植株作為實驗組，另一半作為對照組。實驗組用實驗室保存的PVYN毒源通過摩擦接種法接種煙草從上往下數(shù)第二片和第三片葉，接種過的煙草在溫室中隔離種植。15 d后收取出現(xiàn)感染癥狀的煙葉，保存于?80℃冰箱備用，每個處理取3次生物學(xué)重復(fù)。對照組用磷酸緩沖液進(jìn)行模擬接種，15 d后用同樣的方法取接種葉片保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 RT?qPCR 利用全式金RNA提取試劑盒（ER601?01）的實驗步驟提取實驗室保存的K326無毒葉片和接有PVY病毒的葉片樣本的RNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（AT311）的實驗步驟合成cDNA的第一條鏈，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。根據(jù)附表1中候選基因RT?qPCR引物，用RT?qPCR試劑盒（FP210422）進(jìn)行RT?qPCR擴(kuò)增，以Actin（Accession: XM_009589609.3）作為內(nèi)參基因，然后將反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA稀釋后，應(yīng)用SYBR Green PCR反應(yīng)體系于熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。RT?qPCR反應(yīng)條件為：95℃，5 min；95℃，20 s，58℃，20 s，共40個循環(huán)；72℃，40 s。RT?qPCR反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，2×Talent qPCR PreMix（SYBR Green）10 μL，50×ROX Reference Dye 0.2 μL，上、下游引物各1 μL，RNase?free Water補充至20 μL。用2-ΔΔCT公式進(jìn)行計算表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 煙草半胱氨酸蛋白酶基因家族成員的鑒定

從MEROPS數(shù)據(jù)庫獲得煙草和擬南芥CPs氨基酸序列及6個結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的Pfam，對煙草蛋白序列進(jìn)行HMM分析和BLAST檢索，經(jīng)過篩選后在煙草K326中共得到70個目標(biāo)CPs基因。將這些基因按照順序重命名為Nta_CP_1-Nta_CP_70?；?qū)?yīng)的信息匯總在附表2中，包括蛋白ID、基因ID、分類和重命名信息，以及基因在染色體上的起止位點、Domain的起止位置。

2.2 煙草半胱氨酸蛋白酶系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析

根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)和MEROPS數(shù)據(jù)庫獲得擬南芥的半胱氨酸蛋白酶氨基酸序列，將煙草K326的半胱氨酸蛋白酶氨基酸序列進(jìn)行MUSCEL比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖1），結(jié)果表明煙草K326的半胱氨酸蛋白酶基因家族可以分為5個亞家族，分別是C1A、C2A、C12、C13、C14A，值得注意的是，根據(jù)文獻(xiàn)半胱氨酸蛋白酶基因家族可以被分為6個亞類，除了上述5個之外還有C15，而K326的原始數(shù)據(jù)中屬于C15結(jié)構(gòu)域的基因不符合篩選要求，所以被移除，因此最終的進(jìn)化樹中沒有C15結(jié)構(gòu)域。

圖1 煙草半胱氨酸蛋白酶家族的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of cysteine protease family in tobacco

在得到的目標(biāo)基因中，有39個基因?qū)儆贑1A結(jié)構(gòu)域（Nta_CP_1-Nta_CP_39），它的亞家族成員數(shù)量最多，符合C1A是半胱氨酸蛋白酶基因家族中最大的亞類，形成了最大的分支；2個屬于C2A結(jié)構(gòu)域（Nta_CP_40和Nta_CP_41），是最小的進(jìn)化枝；5個屬于C12（Nta_CP_42-Nta_CP_46）；8個屬于C13（Nta_CP_48-Nta_CP_54）；16個屬于C14A（Nta_CP_55-Nta_CP_70）（圖1）。

2.3 煙草半胱氨酸蛋白酶保守結(jié)構(gòu)域分析

利用MEME搜索并分析半胱氨酸蛋白酶基因家族的20個保守基序（圖2），其中Motif14（GDELBHGVLAVGYGT）出現(xiàn)了46次，是出現(xiàn)最多的結(jié)構(gòu)域；Motif20出現(xiàn)次數(shù)最少為7次；Motif1、Motif5、Motif11、Motif12、Motif13、Motif20最長；結(jié)構(gòu)域長度最小的是Motif14、Motif16、Motif17。從中可以看出，盡管Motif14出現(xiàn)次數(shù)最多，但結(jié)構(gòu)域?。欢谧畲蟮膸讉€結(jié)構(gòu)域當(dāng)中，除了Motif1外其他5個保守性相對較低，出現(xiàn)次數(shù)明顯少于其他Motif。

圖2 煙草半胱氨酸蛋白的保守結(jié)構(gòu)域模式圖Fig. 2 Conserved domain pattern of cysteine protein in tobacco

將結(jié)構(gòu)域可視化之后，與進(jìn)化樹按照基因ID一一對應(yīng)后，從圖2可知，Motif 8、Motif 4、Motif 3、Motif 18、Motif 9是C1A亞家族特有的結(jié)構(gòu)域，而Motif 1和Motif 2是C1A亞類的39個基因成員所共有的。C2A亞家族的成員的結(jié)構(gòu)域組成相同，并且均按照Motif 15、Motif 14、Motif 2、Motif 14、Motif 1、Motif 6的順序排列。C12亞家族成員只包含了Motif14。Motif 5、Motif 13、Motif 12、Motif 20為C13所特有，并且C13亞類成員都包含有相同的結(jié)構(gòu)域組成，只有Nta_CP_54缺少Motif 20。Motif 11、Motif 7、Motif 10、Motif 19只存在于C14A亞類中。

這些亞家族各自特有的保守結(jié)構(gòu)域很可能與他們各自發(fā)揮的功能有很大的聯(lián)系。如C12亞家族的Motif14可能與C12，即泛素C?末端水解酶，對泛素C?末端Gly形成鍵的特異性識別有關(guān)；C13亞家族的特有保守結(jié)構(gòu)域可能共同發(fā)揮作用，實現(xiàn)降解液泡中的蛋白質(zhì)；C14A的特有基序可能共同作用控制細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)。

總體來看，同一進(jìn)化樹分支上的基因結(jié)構(gòu)域的組成與位置相同或相似，且距離越近的基因相似度越高，如Nta_CP_1、Nta_CP_2、Nta_CP_4、Nta_CP_10、Nta_CP_11，進(jìn)一步驗證了類群分類的可靠性，而這些保守結(jié)構(gòu)域的功能還需要進(jìn)一步探究和發(fā)現(xiàn)。

2.4 煙草半胱氨酸蛋白酶啟動子順式作用元件分析

為研究煙草中的半胱氨酸蛋白酶是否參與逆境脅迫和植物抗病調(diào)控，利用半胱氨酸蛋白酶基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游2 000 bp的序列，在PlantCARE網(wǎng)站中查找順式作用元件，由圖3可知，K326的半胱氨酸蛋白酶家族基因含有42個不同的順式作用元件，大多數(shù)基因都含有光應(yīng)答元件。此外，半胱氨酸蛋白酶基因家族中還含有脅迫響應(yīng)元件，如MeJA響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件、水楊酸響應(yīng)元件等，同時也在其中發(fā)現(xiàn)了參與低溫、脫水、高溫、鹽脅迫響應(yīng)、防御和應(yīng)激反應(yīng)的順式作用元件、參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點、創(chuàng)傷反應(yīng)元件等。

圖3 煙草半胱氨酸蛋白酶順式作用元件模式圖Fig. 3 Cis-acting element mode diagram of cysteine protein in tobacco

其中，Nta_CP_21含有赤霉素響應(yīng)元件，Nta_CP_11、Nta_CP_7、Nta_CP_9等含有脫落酸響應(yīng)元件，這些基因可能與植物的生長進(jìn)程調(diào)控逆境脅有關(guān)。Nta_CP_6、Nta_CP_8等含有參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點，推測與抗旱脅迫有關(guān)。Nta_CP_27、Nta_CP_56等含有低溫調(diào)控響應(yīng)元件，可能與植物在低溫環(huán)境下的生理反應(yīng)有關(guān)。Nta_CP_9、Nta_CP_14等含有創(chuàng)傷反應(yīng)元件，可能會在植物體受到外部損傷后發(fā)揮作用。而Nta_CP_10和Nta_CP_11除了含有生長素、脫落酸等響應(yīng)元件外，還含有最大激發(fā)子介導(dǎo)的激活元件（maximal elicitor?mediated）和參與防御和應(yīng)激響應(yīng)的元件（圖3），說明它們可能參與煙草生長發(fā)育調(diào)控及多種逆境脅迫調(diào)控途徑。綜上，煙草中的半胱氨酸蛋白酶可能與煙草的生長發(fā)育、逆境響應(yīng)、脅迫調(diào)控等多種生理過程密切相關(guān)。

2.5 煙草靶向半胱氨酸蛋白酶家族基因的miRNAs

基于實驗室前期煙草PVY感染后small RNA測序數(shù)據(jù)，篩選煙草K326半胱氨酸蛋白酶基因家族中對應(yīng)的miRNAs，由圖4和附表3可以看出，共預(yù)測到28個半胱氨酸蛋白酶基因受51個miRNAs調(diào)控。miRNAs與半胱氨酸蛋白酶基因的靶向互作存在著多對一和一對多的關(guān)系。其中，Nta_CP_26和Nta_CP_14對應(yīng)的miRNAs數(shù)量最多，達(dá)15個，均為nta?miR169家族的成員。Nta_CP_41和Nta_CP_40對應(yīng)的miRNAs數(shù)量也為15個，分別為nta?miR166家族的8個成員，nta?miR395家族的3個成員，nta?miR614家族的2個成員，nta?miR172a和nta?miR6019a。Nta_CP_44和Nta_CP_46對應(yīng)8個miRNAs，均為nta?miR166家族成員。受煙草半胱氨酸蛋白酶調(diào)控最多的miRNA是nta?miR172a，共靶向8個基因，分別為Nta_CP_67、Nta_CP_66、Nta_CP_65、Nta_CP_64、Nta_CP_40、Nta_CP_41、Nta_CP_59和Nta_CP_17。Nta_CP_10和Nta_CP_11受nta?miR396a/b/c調(diào)控。

圖4 煙草半胱氨酸蛋白酶家族基因及其對應(yīng) miRNAs 調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 4 Networks of corresponding cysteine protease family genes and their relatived miRNAs in tobacco

2.6 煙草PVY感染后半胱氨酸蛋白酶基因及對應(yīng)miRNAs的表達(dá)譜分析

基于實驗室前期在煙草PVY感染過程的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)和smallRNA測序數(shù)據(jù)，對煙草PVY感染后半胱氨酸蛋白酶家族基因的表達(dá)譜進(jìn)行分析并利用R語言繪制表達(dá)熱圖和散點圖。結(jié)果表明，在PVY感染后，CPs基因大多數(shù)呈上調(diào)的趨勢，其中，Nta_CP_19、Nta_CP_27、Nta_CP_52、Nta_CP_28等38個CPs在PVY感染后上調(diào)表達(dá)，Nta_CP_19、Nta_CP_27、Nta_CP_28、Nta_CP_52等18個成員下調(diào)表達(dá)（圖5?A）。其中顯著上調(diào)的有14個，顯著下調(diào)的有7個（圖5?C）。對應(yīng)的miRNAs中，nta?miR172h、nta?miR169t、nta?miR156g、nta?miR6161a等38個在PVY感染后表達(dá)上調(diào)，nta?miR398、nta?miR172f、nta?miR6019a、nta?miR396b等13個miRNAs表達(dá)下調(diào)（圖5?B），其中顯著上調(diào)的有34個，顯著下調(diào)的有5個（圖5?D）。

圖5 煙草半胱氨酸蛋白酶家族基因及對應(yīng)miRNAs在PVY感染后的表達(dá)Fig. 5 Expressions of cysteine protease family genes and miRNAs infected PVY in tobacco

2.7 煙草PVY感染后半胱氨酸蛋白酶家族基因及對應(yīng)miRNAs的負(fù)調(diào)控關(guān)系分析

由上述分析可知，PVY感染后可以激活大多數(shù)煙草半胱氨酸蛋白酶及對應(yīng)miRNAs的表達(dá)，有6個miRNAs及對應(yīng)的7個半胱氨酸蛋白酶基因在PVY感染后表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，其中nta?miR172a、nta?miR396a、nta?miR6161a和nta?miR6161b在PVY感染后表達(dá)量上調(diào)，對應(yīng)的靶基因Nta_CP_66、Nta_CP_59、Nta_CP_7和Nta_CP_5下調(diào)；nta?miR390a和nta?miR396b/c在PVY感染后表達(dá)量下調(diào)，對應(yīng)的靶基因Nta_CP_38、Nta_CP_10和Nta_CP_11上調(diào)（圖6）。

圖6 煙草半胱氨酸蛋白酶家族基因及對應(yīng)miRNAs在PVY感染后表達(dá)量負(fù)相關(guān)調(diào)控圖Fig. 6 Negative correlation network of expressions of cysteine protease family genes and corresponding miRNAs after PVY infection in tobacco

2.8 煙草PVY感染后半胱氨酸蛋白酶家族基因的RT?qPCR分析

利用實驗室在煙草PVY感染過程的mRNA測序數(shù)據(jù)，挑選25個差異倍數(shù)在2以上的半胱氨酸蛋白酶基因進(jìn)行RT?qPCR分析，取PVY感染15 d后的葉片組織進(jìn)行檢測。結(jié)果（圖7）表明，PVY感染后，表達(dá)量上調(diào)的半胱氨酸蛋白酶基因有15個，顯著變化的有11個，其中Nta_CP_9、Nta_CP_14、Nta_CP_18、Nta_CP_24、Nta_CP_26、Nta_CP_31、Nta_CP_50上調(diào)明顯，差異極顯著。染病后Nta_CP_24、Nta_CP_26、Nta_CP_31表達(dá)量都上升了30-40倍；Nta_CP_14變化最大，接近150倍，其次是Nta_CP_18，接近60倍。PVY感染后表達(dá)量下調(diào)的半胱氨酸蛋白酶基因有10個，顯著變化的有8個，其中Nta_CP_4差異極顯著。

圖7 PVY感染后煙草半胱氨酸蛋白酶基因RT-qPCR分析Fig. 7 RT-qPCR analysis of the cysteine protease genes in PVY-infected tobacco

3 討論

3.1 利用新方法鑒定煙草半胱氨酸蛋白酶基因家族成員

關(guān)于半胱氨酸蛋白酶基因全家族的分析與鑒定，目前僅在水稻、小桐子等植物中正式報道，更多的集中于對C1A亞家族的鑒定［8,26-27］，且大多基于MEROPS數(shù)據(jù)庫中收錄的條目和BLAST進(jìn)行分類匯總，缺少半胱氨酸蛋白酶基因家族鑒定的完整流程。本研究對煙草半胱氨酸蛋白酶全基因家族進(jìn)行分析，在MEROPS數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上，利用半胱氨酸蛋白酶亞家族各個亞家族的Pfam信息在全基因組水平進(jìn)行HMM鑒定，通過Domain得分和覆蓋度篩選，再經(jīng)BLAST檢索在煙草中共獲得70個半胱氨酸蛋白酶基因家族成員，可分為C1A、C2A、C12、C13和C14A五個亞家族，包括39個C1A，16個C14A，8個C13，5個C12和2個C2A。經(jīng)比較，MEROPS數(shù)據(jù)庫共收錄45個煙草半胱氨酸蛋白酶基因家族包括26個C1A和19個C13亞家族成員［11］?？梢钥闯?，MEROPS數(shù)據(jù)庫收錄的煙草半胱氨酸蛋白酶數(shù)量有限，本研究方法可以更全面地鑒定煙草基因組中的半胱氨酸蛋白酶基因家族，為煙草及植物半胱氨酸蛋白酶基因家族的鑒定和研究提供保障。

3.2 煙草半胱氨酸蛋白酶基因家族參與抗病和抗逆響應(yīng)

半胱氨酸蛋白酶作為植物蛋白水解酶的主要組分，可以參與植物多種生物和非生物抗逆調(diào)控［10］。半胱氨酸蛋白酶能增強植物對病原物的免疫力，通過識別病原物的特定結(jié)構(gòu)域來激發(fā)植物體產(chǎn)生多種免疫反應(yīng)。煙草半胱氨酸蛋白酶編碼基因NtC14參與調(diào)控疫霉的抗病性［13］；NbCYP1和NbCYP2參與調(diào)控炭疽?。–olletotrichum destructivum）的抗病性［28］。擬南芥半胱氨酸蛋白酶編碼基因AtRD19缺失引起青枯病的抗病性明顯減弱［12］。玉米半胱氨酸蛋白酶編碼基因ZmCP1A、ZmCP1B和ZmCP2受黑穗病菌（Ustilago maydis）效應(yīng)蛋白Pit2抑制［29-30］。番茄半胱氨酸蛋白酶編碼基因SlCYP1受番茄黃曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV）的RNA沉默抑制子V2抑制［31］。此外，植物半胱氨酸蛋白酶還參與低溫、高溫、干旱、鹽脅迫等多種非生物脅迫［32］。例如，小麥半胱氨酸蛋白酶編碼基因TaCP在高溫、低溫、干旱和鹽脅迫下表達(dá)量明顯上升［33］，柑橘半胱氨酸蛋白酶編碼基因CsCysP在受干旱、低溫和鹽脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)［34］。

植物半胱氨酸蛋白酶編碼基因的啟動子序列大多含有脅迫響應(yīng)元件［35］，擬南芥AtRD19的啟動子含有干旱應(yīng)答元件DRE和ABRE，使得該基因通過ABA信號途徑參與脅迫調(diào)控［36］。本研究對70個煙草半胱氨酸蛋白酶基因家族成員構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，搜索并分析了半胱氨酸蛋白酶基因家族的20個保守基序發(fā)現(xiàn)，同一亞類中的半胱氨酸蛋白酶基因家族成員結(jié)構(gòu)域組成和排列分布高度相似，預(yù)測它們參與了相似的生物學(xué)功能。通過啟動子順式作用元件分析可以發(fā)現(xiàn)，在煙草半胱氨酸蛋白酶基因家族包含大量光刺激、低溫、干旱、鹽脅迫、外部損傷等響應(yīng)元件，同時還存在許多響應(yīng)水楊素、茉莉酸和脫落酸等與抗病和抗逆相關(guān)的激素元件。例如Nta_CP_10和Nta_CP_11等基因包含生長激素響應(yīng)元件，同時也包含了參與防御和應(yīng)激響應(yīng)的元件，說明煙草半胱氨酸蛋白酶可能在煙草多種逆境脅迫調(diào)控途徑中扮演了重要作用。

3.3 煙草半胱氨酸蛋白酶參與PVY調(diào)控

馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）的病毒是植物中已知的種類最多的一類RNA病毒，在世界各地的許多作物中造成毀滅性的流行病和重大的產(chǎn)量損失［37］。研究表明，本氏煙半胱氨酸蛋白酶編碼基因NbCP8作為正調(diào)控因子抑制植物RNA病毒的侵染，沉默NbCP8可以促進(jìn)TMV侵染，而過表達(dá)NbCP8可以抑制TMV侵染［38］。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，對感染PVY后的K326半胱氨酸蛋白酶基因家族進(jìn)行了表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，感染PVY后，栽培煙草中有38個半胱氨酸蛋白酶基因家族成員表達(dá)上調(diào)，18個下調(diào)，表明半胱氨酸蛋白酶基因家族的部分成員可能參與煙草對PVY的響應(yīng)。但半胱氨酸蛋白酶是一個大家族，由許多成員組成，其成員如何差異化地響應(yīng)植物不同階段的生長發(fā)育及生物與非生物脅迫尚不清楚，值得深入研究。本研究根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果挑選煙草半胱氨酸蛋白酶基因家族中對PVY強響應(yīng)的基因，利用RT?qPCR鑒定PVY感染后的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PVY感染后11個半胱氨酸蛋白酶基因明顯上調(diào)，8個明顯下調(diào)。其中Nta_CP_14、Nta_CP_18等5個基因上調(diào)倍數(shù)超過30倍，而下調(diào)的基因變化倍數(shù)均較小。這些研究證明，大部分半胱氨酸蛋白酶基因在PVY感染后被激活，從而響應(yīng)PVY調(diào)控。

3.4 煙草半胱氨酸蛋白酶與miRNA互作參與PVY調(diào)控

已有研究表明，miRNAs參與大量基因的調(diào)控，但miRNAs參與半胱氨酸蛋白酶家族基因調(diào)控的研究十分有限。本研究基于煙草small RNA測序和轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，28個半胱氨酸蛋白酶基因受51個miRNAs調(diào)控。比較PVY感染后miRNAs與其靶向的半胱氨酸蛋白酶基因的表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，對應(yīng)的miRNAs中上調(diào)的有38個，下調(diào)的有13個，其中有7個成員及其對應(yīng)miRNAs表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)。表明這些miRNAs參與煙草半胱氨酸蛋白酶基因的調(diào)控，且其調(diào)控作用與PVY應(yīng)答有關(guān)，但具體調(diào)控機(jī)理還有待深入研究。

4 結(jié)論

本研究在栽培煙草中共鑒定到70個CPs基因家族成員，并將其分為5個亞家族，同一亞家族CPs具有相似的motif分布，CPs家族基因含有多種響應(yīng)元件?；跍y序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，28個CPs基因受51個miRNAs調(diào)控，其中 7個在PVY感染后與miRNAs負(fù)相關(guān)。RT?qPCR結(jié)果證明PVY感染后，15個CPs基因表達(dá)量顯著上調(diào)。

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