陳浩婷 張玉靜 劉潔 代澤敏 劉偉 石玉 張毅 李天來，2

（1. 山西農業(yè)大學園藝學院，太谷 030801；2. 沈陽農業(yè)大學園藝學院，沈陽 110866）

磷是植物生長發(fā)育必需的大量元素之一，在遺傳信息的傳遞和細胞結構的維持中起重要作用。磷的供應減少，會使細胞分裂和增殖受到限制，植物新器官不能形成，代謝停滯，生長發(fā)育受阻［1］。研究表明，低磷脅迫能使大多數(shù)植物的根冠比增大、根直徑變細、側根和根毛密度增大，大多數(shù)植物根系還可改變生長角度，在表層土壤富集，形成“傘狀”根系構型，以便于吸收表層土壤中的磷［2］。低磷脅迫下，植物自身還能產生一系列適應性反應，通過增強根系酸性磷酸酶活性等，增加根系對外界磷的獲取和內部磷的循環(huán)再利用，通過根系釋放的低分子量有機酸活化土壤中的無機、有機磷，通過誘導響應磷饑餓基因表達量變化等提高植物對磷的吸收，進而維持植物體內的磷穩(wěn)態(tài)［3-5］。然而，設施番茄（Solanum lycopersicum L.）生產中普遍存在土壤磷總量高但磷肥利用率嚴重偏低的問題，每年仍需大量增施磷肥才能滿足番茄生產的養(yǎng)分需求（磷肥用量達需求量的28.7倍），阻礙產業(yè)發(fā)展［6］。因此，采用有效的生物技術手段，解析磷素營養(yǎng)調控的分子通路，挖掘提高番茄低磷耐受性和磷素利用率的種質資源，具有重要的理論價值和現(xiàn)實意義。

大量研究表明，WRKY轉錄因子家族成員廣泛參與應答各種生物和非生物脅迫反應［7］。WRKY轉錄因子作為應答逆境脅迫的主要成分，通過與啟動子區(qū)域中的順式作用元件W?box結合調控與抗逆有關靶標基因的表達，最終賦予植物抗逆性［8］。依據(jù)結構域數(shù)量和鋅指結構特征，WRKY主要分為3類：第I類含2個WRKY結構域，又可分為2個亞類（Ia和Ib，鋅指結構分別為C2H2型和C2HC型）；第II、III類含1個WRKY結構域，其中第II類鋅指結構為C2H2型（IIa-IIe，5個亞類），第III類鋅指結構為C2HC型［9］。近年來，WRKY通過結合靶基因啟動子調控磷脅迫信號通路中相關基因表達的作用引起了廣泛關注［10］。AtWRKY75是WRKY家族中首次被報道參與磷轉運、分配和信號轉導的轉錄因子，AtWRKY75 RNAi株系中磷轉運體基因的表達量顯著下降，表明該基因可正向調控磷轉運體應對低磷脅迫［11］。過表達WRKY42促進了擬南芥（Arabidopsis thaliana）對磷的吸收，導致根部磷含量的增加；而在WRKY42突變體中磷的吸收能力下降，導致根中磷含量降低，使植株對低磷脅迫敏感。AtWRKY6和AtWRKY42都可直接結合在PHO1的啟動子上抑制其表達，降低植株對低磷脅迫的耐受性［12］。過表達OsWRKY21或OsWRKY108通過增強PHT1;1基因的表達而促進磷的積累，而OsWRKY21和OsWRKY108雙突變體中PHT1;1基因表達水平和磷積累量均降低［13］。總之，WRKY對下游缺磷響應基因有正向或負向的調控，并對植物的磷素信號和磷素穩(wěn)態(tài)產生影響。

本研究前期轉錄組結果顯示，低磷脅迫下大量WRKY家族基因表達出現(xiàn)顯著變化，尤其是SlWRKY6基因表達量降低了67.14%［14］。為發(fā)掘番茄中應答低磷脅迫的WRKY轉錄因子，利用轉基因技術獲得SlWRKY6的干擾和超表達轉基因番茄材料，解析SlWRKY6的功能，為揭示設施番茄磷高效利用的分子調控網絡提供新觀點，同時為利用WRKY轉錄因子改良茄科作物的低磷耐受性和提高磷利用效率提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 試驗于2022年4-12月在山西農業(yè)大學園藝實驗中心人工氣候室進行，以實驗室自存的Ailsa Craig野生型番茄為試驗材料。

1.1.2 主要試劑 RNAiso Plus（Trizol）購自寶生物（TaKaRa）工程（大連）有限公司；反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒均購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；在上海生工生物工程股份有限公司（https://www.sangon. com/）進行引物合成。

1.2 方法

1.2.1 材料培養(yǎng)及試驗處理 將番茄種子清洗、浸種、催芽，播種；待“三葉一心”時選取長勢良好、大小一致的幼苗，將其根系表面洗凈，定植于1/2倍Hoagland營養(yǎng)液中進行不同磷水平處理。其中正常磷處理的KH2PO4濃度為0.66 mmol/L，低磷處理的KH2PO4濃度為0.066 mmol/L。待緩苗5 d后換1倍營養(yǎng)液開始處理，在脅迫處理0 d和18 d后取番茄幼苗根系和葉片組織，液氮速凍后置于?80℃保存，用于各生理生化指標的測定。

1.2.2 番茄SlWRKY6基因的克隆及農桿菌介導的番茄遺傳轉化 根據(jù)NCBI中SlWRKY6的Gene ID（101247683），從Sol Genomics Network網站下載CDS序列。利用Primer5設計特異性引物，參照周濤等［15］和王茹等［16］的方法構建SlWRKY6基因的過表達和干擾載體。將測序正確的菌液提取質粒，通過凍融法轉入根癌農桿菌中，篩選單克隆陽性菌株進行后續(xù)侵染。將成熟的番茄種子溫湯浸種消毒后，均勻地播在MS固體培養(yǎng)基上。待番茄子葉完全展開時，在超凈臺中將葉片兩端切去開始預培養(yǎng)3-4 d，獲得番茄野生型植株的外植體。將含有過表達和RNAi重組質粒的農桿菌菌液培養(yǎng)至OD600值為0.6，5 000 r/min離心10 min，將收集菌體用MS液體培養(yǎng)基重懸至OD600=0.4。將外植體置于重懸好的菌液中侵染，暗培養(yǎng)2 d后，進行正常光下培養(yǎng)，開始芽誘導分化、生根以及抗性植株篩選等步驟。

1.2.3 RNAi?SlWRKY6和OE?SlWRKY6陽性轉基因植株的鑒定 隨機稱取0.2 g已形成完整幼小植株的組織，進行DNA的提取；選取載體上一段序列和基因上一段序列設計引物進行PCR檢測，將最終獲得的陽性植株即T0代轉基因番茄移栽到田間留種。其中PCR反應體系為20 μL：DNA 4 μL，F(xiàn)orword Prim?er（10 μmol/L）1 μL，Reverse Primer（10 μmol/L）1 μL，2×Rapid Taq Mastermix 10 μL，ddH2O 4 μL。PCR反應程序為：預變性 95℃ 3 min；變性 95℃ 15 s，退火 55℃ 15 s，延伸 72℃ 30 s，35次循環(huán)；終止延伸 72℃ 5 min。檢測過表達轉基因植株引物為表1中JC?WRKY6?F和JC?WRKY6?R；檢測干擾轉基因植株引物為表1中JC?RNAiWRKY6?F和JC?RNAi?WRKY6?R。將收獲的T0代種子浸種催芽播于穴盤中，待三葉一心轉移至溫室中培養(yǎng)，獲得T1代轉基因植株。按照該步驟繼續(xù)傳代培養(yǎng)至T2代，對T2代轉基因番茄幼苗再次進行PCR檢測（PCR體系和擴增體系同上）和RT?qPCR檢測（RT?qPCR體系和擴增體系見1.2.4），挑選過表達株系中表達量較高的兩個株系OE?SlWRKY6?1、OE?SlWRKY6?2，以及干擾株系中表達量較低的兩個株系RNAi?SlWRKY6?1、RNAi?SlWRKY6?2，用于后續(xù)生理生化指標的測定。選取OE?SlWRKY6?1和RNAi?SlWRKY6?1兩個株系的地下部進行磷轉運體家族基因相對表達量的測定。

1.2.4 總RNA提取、cDNA合成及實時熒光定量檢測 利用RNAisoPlus（TaKaRa，大連，中國）提取樣品中的RNA，將所得RNA按照金沙生物反轉錄試劑盒的說明書進行反轉錄。使用諾唯贊公司試劑盒合成第一鏈cDNA，反應體系為：UnionScript First?strand cDNA Synthesis Mix 4 μL、總RNA 1 μL、dsDNase 1 μL、ddH2O 14 μL。混勻后42℃15 min，95℃ 3 min，在PCR儀上進行。采用RT?qPCR方法檢測不同基因的表達水平，番茄庫中Solyc03g078400被用作Actin內參基因，用3次技術重復進行RT?qPCR擴增。其中RT?qPCR反應體系為20 μL：cDNA 4 μL，F(xiàn)orword Primer（10 μmol/L）0.4 μL，Reverse Primer（10 μmol/L）0.4 μL，2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 5.2 μL。RT?qPCR反應程序為：預變性95℃ 30 s；95℃10 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)；溶解曲線95℃ 15 s；60℃ 60 s；95℃ 15 s。計算基因相對表達量的方法采用2-ΔΔCt，本研究中使用的所有熒光定量引物序列均見表1。

1.2.5 根系與葉片無機磷含量和酸性磷酸酶活性的測定 隨機稱取約0.2 g凍樣，加提取液2 mL（0.4 mL TCA+1.6 mL蒸餾水）充分研磨，離心提取上清液。將0.1 mL樣品上清液與1.5 mL試劑（6 mol/L硫酸∶蒸餾水∶2.5%鉬酸銨水溶液∶1%抗壞血酸=1∶4∶2∶2配置）混勻置于45℃水浴保溫30 min，室溫冷卻10 min后于660 nm測定吸光度。由于鉬藍與磷酸根生成660 nm有特征吸收峰的物質，即可計算無機磷含量。隨機稱取約0.3 g凍樣，加提取液8 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（pH 5.8）冰浴充分磨樣，高速冷凍離心提取上清液。將0.2 mL樣品上清液與5 mL 5 mmol/L對硝基苯磷酸二鈉，37℃水浴30 min后加入1 mL 1 mol/L的NaOH溶液結束反應。酸性磷酸酶（ACP）活性通過測量對硝基苯酚在405 nm下的吸光值來評估，一個單位的ACP活性即每克組織在405 nm處每分鐘吸光度單位的變化量［17］。

1.2.6 根系有機酸含量的測定 隨機選取同一處理下3株幼苗的根系用蒸餾水沖洗干凈，加適量液氮研磨成粉末，加入適量的超純水定容到5 mL，室溫水浴超聲提取30 min，離心提上清液，用0.45 μm微孔濾膜，每個處理重復3次，采用高效液相色譜（HPLC）測定根系中的有機酸含量。高效液相色譜條件：安捷倫C18柱（XDB?C18，5 μm，4.6 mm ×250 mm）；流動相為0.01 mol/L KH2PO4，pH為2.5（磷酸調節(jié)）；流速0.5 mL/min；柱溫40℃；進樣量10 μL；檢測波長215 nm［18］。

1.2.7 根系與葉片總磷含量的測定 隨機選取同一處理下4株幼苗的根系和葉片，用蒸餾水沖洗干凈稱其鮮重記錄，105℃殺青2 h，75℃烘干至恒重后先稱其干重記錄，再磨成粉末過0.25 mm篩。每個處理3個重復，每個重復稱取0.1-0.2 g樣品。參照梁穎等［19］的方法，采用H2SO4?H2O2消煮。首先將已稱取干樣用5 mL濃H2SO4過夜酸解，第2天將其在消煮爐上先120℃加熱30 min，再380℃加熱1 h后加4-5滴H2O2過氧化氫，重復此操作直至溶液清澈透明，最后380℃煮20 min以上消除多余H2O2，消解完成。參照梁穎等［19］的方法，采用鉬銻抗比色法測總磷含量。吸取消煮液0.2 mL定容至10 mL，加入兩滴2,4?二硝基苯酚指示劑，滴加4 mol/L NaOH溶液至液體變?yōu)辄S色，再加2 mol/L H2SO4溶液使黃色剛剛褪去，加鉬銻抗顯色劑2 mL后定容至50 mL，室溫搖勻30 min后于700 nm測定吸光度。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理分析 為了獲得可重復性的結果，每個處理進行3個生物重復。數(shù)據(jù)采用方差分析（ANOVA）進行統(tǒng)計學分析，均數(shù)比較采用Duncan’s在SPSS 20.0（SPSS Inc., Chicago, IL, USA）中P＜0.05水平下進行。圖表繪制采用GraphPad prism8.0繪制（GraphPad Software, San Diego,California USA, www. graphpad. Com）。

2 結果

2.1 農桿菌介導的番茄遺傳轉化以及陽性植株的鑒定

獲得T0代番茄的過程如圖1?A-C和 E-F所示，經傳代培養(yǎng)后獲得T2代轉基因植株，在三葉一心時對部分T2代番茄運用PCR和qPCR技術進行檢測，結果如圖1?D, H和圖2所示，共獲得T2代轉基因番茄過表達7株、干擾8株，最終選擇其中表達量最高的過表達株系和表達量最低的干擾株系用于后續(xù)研究。

圖1 番茄的遺傳轉化和T2代番茄的 PCR 驗證Fig. 1 Genetic transformation in tomato and PCR validation in the tomato with the T2 generation

圖2 RT-qPCR檢測T2代轉基因番茄植株RNAi-WRKY6和OE-WRKY6中WRKY6的表達量Fig. 2 Expressions of WRKY6 in RNAi-WRKY6 and OEWRKY6 in T2 generation transgenic tomato plants detected by RT-qPCR

2.2 在低磷脅迫下轉基因番茄的表型觀察和生理生化指標的測定

2.2.1 在低磷脅迫下轉基因番茄的表型變化 低磷處理18 d后，過表達株系莖稈粗壯、葉片伸展且色澤鮮艷、生長趨勢良好；而干擾株系莖稈細弱、葉片卷曲枯黃、生長勢較弱（圖3）。從表型觀察可得，SlWRKY6過表達顯著提高了番茄植株的耐低磷性。在低磷條件下，與WT相比，OE?WRKY6的各項生長指標都有顯著變化，其中莖粗、地上鮮重、地下鮮重、地上干重、地下干重、總鮮重、總干重均顯著增加，OE?WRKY6?1分別提高了35.29%、79.75%、104.47%、112.82%、66.82%、88.04%、100.12%；OE?WRKY6?2分別提高了80.58%、102.74%、110.27%、67.13%、88.01%、98.35%。與OE?WRKY6相比，RNAi?WRKY6的各項生長指標除株高顯著提高外，莖粗、地上鮮重、地下鮮重、地上干重、地下干重、總鮮重和總干重等均顯著降低（表2）。

圖3 低磷條件下轉基因番茄植株RNAi-WRKY6和OE-WRKY6的表型觀察Fig. 3 Phenotypes of transgenic tomato plant RNAi-WRKY6 and OE-WRKY6 under low phosphorus conditions

2.2.2 低磷脅迫下不同轉基因番茄植株無機磷含量和酸性磷酸酶活性的測定 在處理0 d時，WT和RNAi?WRKY6葉片的無機磷含量顯著低于OE?WRKY6；而WT和OE?WRKY6根系的無機磷含量顯著高于RNAi?WRKY6。低磷脅迫處理后，不同基因型番茄植株葉片和根系的無機磷含量均呈下降趨勢，其與處理時間呈負相關關系。在處理18 d時，OE?WRKY6葉片和根系的無機磷含量仍然顯著高于WT和RNAi?WRKY6，與WT相比，RNAi?WRKY6葉片的無機磷含量較少但未形成顯著差異，但根系無機磷顯著增高。低磷脅迫下，OE?WRKY6?1和OE?WRKY6?2葉片和根系的無機磷含量較WT分別顯著增加了13.25%、13.39%和46.65%、38.79%（圖4）。

圖4 低磷條件下轉基因番茄植株RNAi-WRKY6和OEWRKY6無機磷含量的測定Fig. 4 Determination of inorganic phosphorus content in transgenic tomato plants RNAi-WRKY6 and OEWRKY6 under low phosphorus condition

在未處理時，WT和RNAi?WRKY6葉片與根系的酸性磷酸酶活性顯著低于OE?WRKY6，其中RNAi?WRKY6?2根系的酸性磷酸酶活性顯著低于OE?WRKY6?1，且降低了28.75%。低磷脅迫后，不同基因型番茄幼苗葉片與根系的酸性磷酸酶活性均顯著提高，其與處理時間呈正相關關系。在低磷處理18 d時，WT和RNAi?WRKY6葉片的酸性磷酸酶活性顯著高于OE?WRKY6，而WT和RNAi?WRKY6根系的酸性磷酸酶活性顯著低于OE?WRKY6。其中與RNAi?WRKY6?2相比，OE?WRKY6?1葉片的酸性磷酸酶活性顯著降低了27.23%；與RNAi?WRKY6?1相比，OE?WRKY6?1根系的酸性磷酸酶活性顯著提高了17.53%（圖5）。

圖5 低磷條件下轉基因番茄植株RNAi-WRKY6和OEWRKY6酸性磷酸酶活性的測定Fig 5 Determination of acid phosphatase activity in transgenic tomato plant RNAi-WRKY6 and OEWRKY6 under low phosphorus condition

2.2.3 低磷脅迫下不同轉基因番茄植株全磷含量的測定 處理0 d時，WT、RNAi?WRKY6和OE?WRKY6的葉片全磷含量均無顯著差異；處理18 d后，3種基因型番茄植株葉片的全磷含量均呈下降趨勢。低磷脅迫下，與RNAi?WRKY6?2相比，OE?WRKY6?1葉片的全磷含量顯著提高了18.50%。處理0 d時，與OE?WRKY6相比，RNAi?WRKY6根系的全磷含量均顯著提高；在處理18 d后，3種基因型番茄植株的根系全磷含量均呈下降趨勢。與WT相比，OE?WRKY6根系的全磷含量顯著提高，OE?WRKY?1和OE?WRKY?2分別提高了21.23%、23.80%；而RNAi?WRKY6根系的全磷含量卻顯著下降，RNAi?WRKY6?1和RNAi?WRKY6?2分別下降了25.82%、26.71%。在處理18 d后，RNAi?WRKY6?2相較于OE?WRKY6?2的根系全磷含量降低更為顯著，降低了40.80%（圖6）。

圖6 低磷條件下轉基因番茄植株RNAi-WRKY6和OEWRKY6全磷含量的測定Fig. 6 Determination of total phosphorus content of RNAi-WRKY6 and OE-WRKY6 transgenic tomato plants under low phosphorus condition

2.2.4 低磷脅迫下不同轉基因番茄植株根系有機酸含量的測定 處理0 d時，與WT相比，OE?WRKY6根系中4種有機酸含量無顯著差異，而RNAi?WRKY6根系中檸檬酸和琥珀酸顯著降低，RNAi?WRKY6?1和RNAi?WRKY6?2分別降低了31.58%、25.34%和34.23%、27.46%。低磷脅迫后，不同基因型番茄幼苗根系中4種有機酸含量大部分都呈下降趨勢，只有OE?WRKY6根系中的琥珀酸含量處理后較未處理前顯著增加，其中OE?WRKY6?1和OE?WRKY6?2分別提高了27.95%和25.23%。在處理18 d時，草酸和琥珀酸的含量在WT和OE?WRKY6根系中有顯著差異。低磷條件下，與WT相比，OE?WRKY6?1和OE?WRKY6?2根系中草酸、琥珀酸的含量分別顯著提高了23.43%、81.77%和23.83%、81.04%。與低磷脅迫后的WT相比，RNAi?WRKY6?1中的草酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸含量分別顯著降低了57.56%、57.99%、30.96%、51.59%，RNAi?WRKY6?2中的含量分別顯著降低了58.90%、63.91%、37.62%、56.56%（表3）。

表3 低磷條件下轉基因番茄植株RNAi-WRKY6和OE-WRKY6根系有機酸含量的測定Table 3 Determination of organic acid content in the roots of transgenic tomato plant RNAi-WRKY6 and OE-WRKY6 under low phosphorus condition

2.2.5 低磷脅迫下不同轉基因番茄植株根系磷轉運體表達量的測定 在未處理時，LePT1、LePT2和LePT3在WT、RNAi?WRKY6和OE?WRKY6植株中的相對表達量均呈現(xiàn)：OE?WRKY6＞WT＞RNAi?WRKY6；在低磷處理18 d后，LePT2在WT、RNAi?WRKY6和OE?WRKY6植株中的表達量相較于0 d時均有大幅度的提高，而LePT3在3種基因型植株中的表達量卻均呈下降趨勢。與LePT2、LePT3不同，低磷處理18 d后，LePT1的表達量在WT和RNAi?WRKY6植株中顯著增加，呈上升趨勢，而在OE?WRKY6中卻顯著降低，呈下降趨勢（圖7）。

圖7 RNAi-WRKY6和OE-WRKY6轉基因番茄根系中磷轉運體表達量的測定Fig. 7 Determination of phosphorus transporter expressions in the roots of transgenic tomato plant RNAi-WRKY6 and OE-WRKY6

3 討論

3.1 低磷脅迫下SlWRKY6影響番茄幼苗表型變化和生物量分配

植株表型和生長特性的變化是植株主動適應逆境脅迫最顯著的表現(xiàn)。低磷脅迫下，植株會根據(jù)外界環(huán)境缺磷的程度調節(jié)地上部、地下部生物積累量，而根系是最先受到脅迫影響的器官［20］。研究表明，在適應低磷脅迫的過程中，小麥（Triticum aestivum L.）、玉米（Zea mays L.）等作物可通過增強根部能量物質代謝和促進地上部光合產物的轉移來維持地上部的生長發(fā)育［21］。本研究中，低磷脅迫下過表達植株長勢較為粗壯，干擾植株較為細弱；生物量方面更是差異顯著，過表達植株的地下部、地上部生物量均顯著高于野生型和干擾株系。這說明過表達WRKY6植株具有較強適應低磷環(huán)境的能力，可將較多能量物質優(yōu)先分配到根系，促使根系生長發(fā)育，改善根冠結構，從而吸收更多的磷素供地上部正常生長發(fā)育［20］。然而當植株體內磷積累較多時，會造成幼苗生長遲緩，部分出現(xiàn)矮化現(xiàn)象。例如，在敲除FvPHO2基因后草莓（Fragaria×ananassa Duch.）葉片中磷含量升高且株高降低，在擬南芥和水稻（Oryza sativa L.）等模式植物中也有此類現(xiàn)象發(fā)生。本研究中，低磷脅迫下OE?SlWRKY6植株葉片與根系的全磷含量顯著高于RNAi?SlWRKY6，導致OE?SlWRKY6植株矮小粗壯，具有較強適應低磷環(huán)境的能力［22］。

3.2 低磷脅迫下SlWRKY6增強番茄幼苗酸性磷酸酶活性和無機磷含量

低磷脅迫下植物為了提高對磷吸收利用的能力，不僅在根系形態(tài)結構上產生變化，而且在生理代謝中也會主動提高獲得介質中磷素的能力，以緩解低磷脅迫造成的損傷［23］。其中，酸性磷酸酶活性的增加被認為是植物適應低磷脅迫的普遍反應，酸性磷酸酶能將復雜的有機磷化合物水解為可被吸收利用的無機磷，促進有機磷源的再利用，進而提高磷素的利用率［24］。本研究結果顯示，番茄植株中酸性磷酸酶活性變化與其他植株類似，受低磷信號誘導而升高，低磷脅迫下野生型、過表達、干擾植株中根系與葉片酸性磷酸酶活性均逐漸增加，表明低磷環(huán)境下植物體內的酸性磷酸酶直接參與了植物體內各種磷化合物的再利用。由于基因型不同，低磷誘導的酸性磷酸酶活性也存在較大差異［25］。當磷正常培養(yǎng)時，不同基因型植株體內均積累了較多的無機磷，其中OE?SlWRKY6植株中無機磷含量最高且酸性磷酸酶活性最強，而在轉移至低磷處理18 d后，由于OE?SlWRKY6植株前期未脅迫時自身儲備較多無機磷且葉片有較強的磷儲存能力，因此過表達株系中葉片的酸性磷酸酶活性較低、變化幅度較小。但隨著植株體內積累無機磷的逐漸消耗和外界環(huán)境中較少的磷素供應，強烈的低磷信號觸發(fā)了根系適應低磷脅迫的機制，最終引起根系酸性磷酸酶活性的升高。其中，在低磷脅迫下OE?SlWRKY6植株根系的酸性磷酸酶活性最高，表明OE?SlWRKY6植株根系能有效促進有機磷化合物水解，將水解得到的無機磷轉運到地上部分，從而提高磷的吸收利用率。綜上可得，低磷脅迫下過表達株系酶活的增加幅度、活性以及無機磷含量遠遠高于野生型和干擾株系，表明SlWRKY6超量表達能提高體內酸性磷酸酶活性，有機磷庫中磷脂等有機物的磷素會被高活性的酸性磷酸酶高效水解活化，產生更多的無機磷應對低磷脅迫，有效提高植株磷的再利用效率，緩解植株缺磷的狀況，保證其正常生長發(fā)育。因此，過表達SlWRKY6在低磷脅迫下，對磷的循環(huán)利用具有明顯的優(yōu)勢，是其有效應對低磷脅迫中的一個重要機制。

3.3 低磷脅迫下SlWRKY6增強番茄幼苗根系的有機酸含量

外界不利的環(huán)境因素和植物體內養(yǎng)分的豐缺，都能一定程度上影響有機酸的合成和積累［26］。有機酸作為三羧酸循環(huán)的主要產物，也是植物體物質和能量代謝的重要中間產物，不僅可以反映植物的磷素吸收、運輸、積累等代謝過程，而且在應對營養(yǎng)脅迫中扮演著重要角色［27］。本研究中，低磷下番茄根系除琥珀酸外，其余3種有機酸含量均顯著下降，這是由于已適應低磷環(huán)境的番茄根系對有機酸的合成和積累表現(xiàn)出明顯的抑制作用［28］。OE?SlWRKY6植株根系的4種有機酸含量均顯著高于RNAi?WRKY6株系，說明低磷脅迫下，OE?SlWRKY6植株通過提高根系有機酸的合成能力以適應低磷脅迫。有研究表明，酸性磷酸酶活性與有機酸含量呈正相關關系［29］，本研究中低磷脅迫下OE?SlWRKY6植株根系的酸性磷酸酶活性和有機酸含量均最高，更加充分驗證SlWRKY6超表達后可提高植株對低磷脅迫的適應性。蘋果酸是過表達株系與干擾株系中含量差異較為懸殊的有機酸之一，其不僅能活化難溶性磷酸鹽釋放無機磷，還能作為滲透調節(jié)物質提高細胞液濃度，在增強植株抗逆性方面發(fā)揮作用；這也充分印證了OE?SlWRKY6植株在應對低磷脅迫時自身具有較高的適應性［30］。TCA循環(huán)中琥珀酸主要是由琥珀酰CoA受琥珀酰CoA合成酶催化生成的，這一過程中同時還生成了GTP或ATP，因此其也是TCA循環(huán)中唯一一次底物水平磷酸化［31］。OE?SlWRKY6植株根系在低磷脅迫后琥珀酸含量顯著增加，而野生型與RNAi?WRKY6的含量顯著降低，與此同時，OE?SlWRKY6植株細胞能量狀態(tài)指示劑ATP也會隨之增加。植物體代謝過程中的細胞高能狀態(tài)指示劑除ATP外還有NADH和檸檬酸等，他們能反映出植物體在應對不良外界環(huán)境時自身能量充足或匱乏的狀態(tài)［32］。低磷脅迫下，過表達SlWRKY6植株根系中檸檬酸的含量也是3種基因型中最高的，表明OE?SlWRKY6株系在外界磷供給不足時，自身具有強大的能量代謝循環(huán)系統(tǒng)和適應低磷脅迫機制，通過協(xié)同調控根系有機酸的合成來保證植物體正常的能量供給，進而適應低磷脅迫。

3.4 低磷脅迫下SlWRKY6影響番茄幼苗根系磷轉運體的表達

研究表明，外界磷素供應濃度可直接影響植株體內的磷素水平，進而誘導磷轉運蛋白的表達，而磷轉運蛋白的轉錄調控直接或間接地調控著磷的獲得，對植株在低磷條件下生理代謝平衡起著重要作用［33］。當外界磷素供應不足時，植株自身進化出一系列生理生化機制實現(xiàn)磷的活化、轉運以及再利用，例如大分子物質核酸、磷脂中的有機磷被酸性磷酸酶等水解活化、液泡中暫儲多余的無機磷被轉運以及營養(yǎng)器官中活化的無機磷被轉運到新生長中心再利用［34］。高親和磷轉運體在介導這些植株磷素吸收運輸過程中發(fā)揮著重要的作用，研究表明低磷下，番茄植株中負責體內磷素轉運分配的LePT1和負責根系吸收磷素的LePT2表達量均顯著增加［35］，與本研究結果一致，低磷脅迫后，野生型和RNAi?SlWRKY6根系的LePT1、LePT2表達量顯著升高進而提高磷的吸收利用率，但過表達植株根系中的LePT1、LePT3的表達量卻在低磷脅迫后顯著降低。這是由于過表達植株在正常條件下，根系磷轉運體表達量和酸性磷酸酶活性較高，能水解出較多的無機磷供利用，且自身有較充足的無機磷儲備。因此，OE?SlWRKY6植株在面臨低磷脅迫時體內的磷素水平所受影響較小，其根系與葉片的全磷含量顯著高于野生型和RNAi?WRKY6植株，同時也表明過表達植株內部具有高效調節(jié)利用磷素機制可有效應對低磷脅迫的發(fā)生。有研究證實，WRKY21和WRKY108可作為磷饑餓條件下植株自身的轉錄調節(jié)器，與OsPht1;1的W?box區(qū)域結合，正向調控植株耐低磷性［13］。這與本研究中WRKY6基因相對表達量較高的植株具有較強吸收、轉運和再利用磷酸鹽能力的表現(xiàn)一致，但WRKY6是否直接調控PHT家族基因的表達，進而對番茄植株磷素穩(wěn)態(tài)產生影響仍有待進一步試驗驗證。最終可得，低磷條件下過表達SlWRKY6基因能增強番茄植株的耐低磷性，提高磷的再活化、再轉運和再利用，緩解外界磷素供應不足造成的損傷。該研究也為進一步揭示番茄根系適應低磷脅迫的分子機制提供了重要理論依據(jù)。

4 結論

番茄中WRKY6基因在響應低磷脅迫過程中起著重要作用，其可通過增強酸性磷酸酶活性、提高有機酸合成量和改善根系與葉片磷素轉運分配等途徑，增強番茄植株對外界磷素的吸收和體內磷營養(yǎng)的重分配再利用，最終實現(xiàn)磷的高效吸收利用。