陳浩婷 張玉靜 劉潔 代澤敏 劉偉 石玉 張毅 李天來，2

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，太谷 030801；2. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，沈陽 110866）

磷是植物生長發(fā)育必需的大量元素之一，在遺傳信息的傳遞和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的維持中起重要作用。磷的供應(yīng)減少，會使細(xì)胞分裂和增殖受到限制，植物新器官不能形成，代謝停滯，生長發(fā)育受阻［1］。研究表明，低磷脅迫能使大多數(shù)植物的根冠比增大、根直徑變細(xì)、側(cè)根和根毛密度增大，大多數(shù)植物根系還可改變生長角度，在表層土壤富集，形成“傘狀”根系構(gòu)型，以便于吸收表層土壤中的磷［2］。低磷脅迫下，植物自身還能產(chǎn)生一系列適應(yīng)性反應(yīng)，通過增強(qiáng)根系酸性磷酸酶活性等，增加根系對外界磷的獲取和內(nèi)部磷的循環(huán)再利用，通過根系釋放的低分子量有機(jī)酸活化土壤中的無機(jī)、有機(jī)磷，通過誘導(dǎo)響應(yīng)磷饑餓基因表達(dá)量變化等提高植物對磷的吸收，進(jìn)而維持植物體內(nèi)的磷穩(wěn)態(tài)［3-5］。然而，設(shè)施番茄（Solanum lycopersicum L.）生產(chǎn)中普遍存在土壤磷總量高但磷肥利用率嚴(yán)重偏低的問題，每年仍需大量增施磷肥才能滿足番茄生產(chǎn)的養(yǎng)分需求（磷肥用量達(dá)需求量的28.7倍），阻礙產(chǎn)業(yè)發(fā)展［6］。因此，采用有效的生物技術(shù)手段，解析磷素營養(yǎng)調(diào)控的分子通路，挖掘提高番茄低磷耐受性和磷素利用率的種質(zhì)資源，具有重要的理論價值和現(xiàn)實意義。

大量研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員廣泛參與應(yīng)答各種生物和非生物脅迫反應(yīng)［7］。WRKY轉(zhuǎn)錄因子作為應(yīng)答逆境脅迫的主要成分，通過與啟動子區(qū)域中的順式作用元件W?box結(jié)合調(diào)控與抗逆有關(guān)靶標(biāo)基因的表達(dá)，最終賦予植物抗逆性［8］。依據(jù)結(jié)構(gòu)域數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)特征，WRKY主要分為3類：第I類含2個WRKY結(jié)構(gòu)域，又可分為2個亞類（Ia和Ib，鋅指結(jié)構(gòu)分別為C2H2型和C2HC型）；第II、III類含1個WRKY結(jié)構(gòu)域，其中第II類鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2型（IIa-IIe，5個亞類），第III類鋅指結(jié)構(gòu)為C2HC型［9］。近年來，WRKY通過結(jié)合靶基因啟動子調(diào)控磷脅迫信號通路中相關(guān)基因表達(dá)的作用引起了廣泛關(guān)注［10］。AtWRKY75是WRKY家族中首次被報道參與磷轉(zhuǎn)運(yùn)、分配和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，AtWRKY75 RNAi株系中磷轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的表達(dá)量顯著下降，表明該基因可正向調(diào)控磷轉(zhuǎn)運(yùn)體應(yīng)對低磷脅迫［11］。過表達(dá)WRKY42促進(jìn)了擬南芥（Arabidopsis thaliana）對磷的吸收，導(dǎo)致根部磷含量的增加；而在WRKY42突變體中磷的吸收能力下降，導(dǎo)致根中磷含量降低，使植株對低磷脅迫敏感。AtWRKY6和AtWRKY42都可直接結(jié)合在PHO1的啟動子上抑制其表達(dá)，降低植株對低磷脅迫的耐受性［12］。過表達(dá)OsWRKY21或OsWRKY108通過增強(qiáng)PHT1;1基因的表達(dá)而促進(jìn)磷的積累，而OsWRKY21和OsWRKY108雙突變體中PHT1;1基因表達(dá)水平和磷積累量均降低［13］?？傊?，WRKY對下游缺磷響應(yīng)基因有正向或負(fù)向的調(diào)控，并對植物的磷素信號和磷素穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生影響。

本研究前期轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示，低磷脅迫下大量WRKY家族基因表達(dá)出現(xiàn)顯著變化，尤其是SlWRKY6基因表達(dá)量降低了67.14%［14］。為發(fā)掘番茄中應(yīng)答低磷脅迫的WRKY轉(zhuǎn)錄因子，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得SlWRKY6的干擾和超表達(dá)轉(zhuǎn)基因番茄材料，解析SlWRKY6的功能，為揭示設(shè)施番茄磷高效利用的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供新觀點(diǎn)，同時為利用WRKY轉(zhuǎn)錄因子改良茄科作物的低磷耐受性和提高磷利用效率提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 試驗于2022年4-12月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實驗中心人工氣候室進(jìn)行，以實驗室自存的Ailsa Craig野生型番茄為試驗材料。

1.1.2 主要試劑 RNAiso Plus（Trizol）購自寶生物（TaKaRa）工程（大連）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒均購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；在上海生工生物工程股份有限公司（https://www.sangon. com/）進(jìn)行引物合成。

1.2 方法

1.2.1 材料培養(yǎng)及試驗處理 將番茄種子清洗、浸種、催芽，播種；待“三葉一心”時選取長勢良好、大小一致的幼苗，將其根系表面洗凈，定植于1/2倍Hoagland營養(yǎng)液中進(jìn)行不同磷水平處理。其中正常磷處理的KH2PO4濃度為0.66 mmol/L，低磷處理的KH2PO4濃度為0.066 mmol/L。待緩苗5 d后換1倍營養(yǎng)液開始處理，在脅迫處理0 d和18 d后取番茄幼苗根系和葉片組織，液氮速凍后置于?80℃保存，用于各生理生化指標(biāo)的測定。

1.2.2 番茄SlWRKY6基因的克隆及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄遺傳轉(zhuǎn)化 根據(jù)NCBI中SlWRKY6的Gene ID（101247683），從Sol Genomics Network網(wǎng)站下載CDS序列。利用Primer5設(shè)計特異性引物，參照周濤等［15］和王茹等［16］的方法構(gòu)建SlWRKY6基因的過表達(dá)和干擾載體。將測序正確的菌液提取質(zhì)粒，通過凍融法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌中，篩選單克隆陽性菌株進(jìn)行后續(xù)侵染。將成熟的番茄種子溫湯浸種消毒后，均勻地播在MS固體培養(yǎng)基上。待番茄子葉完全展開時，在超凈臺中將葉片兩端切去開始預(yù)培養(yǎng)3-4 d，獲得番茄野生型植株的外植體。將含有過表達(dá)和RNAi重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液培養(yǎng)至OD600值為0.6，5 000 r/min離心10 min，將收集菌體用MS液體培養(yǎng)基重懸至OD600=0.4。將外植體置于重懸好的菌液中侵染，暗培養(yǎng)2 d后，進(jìn)行正常光下培養(yǎng)，開始芽誘導(dǎo)分化、生根以及抗性植株篩選等步驟。

1.2.3 RNAi?SlWRKY6和OE?SlWRKY6陽性轉(zhuǎn)基因植株的鑒定 隨機(jī)稱取0.2 g已形成完整幼小植株的組織，進(jìn)行DNA的提??；選取載體上一段序列和基因上一段序列設(shè)計引物進(jìn)行PCR檢測，將最終獲得的陽性植株即T0代轉(zhuǎn)基因番茄移栽到田間留種。其中PCR反應(yīng)體系為20 μL：DNA 4 μL，F(xiàn)orword Prim?er（10 μmol/L）1 μL，Reverse Primer（10 μmol/L）1 μL，2×Rapid Taq Mastermix 10 μL，ddH2O 4 μL。PCR反應(yīng)程序為：預(yù)變性 95℃ 3 min；變性 95℃ 15 s，退火 55℃ 15 s，延伸 72℃ 30 s，35次循環(huán)；終止延伸 72℃ 5 min。檢測過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株引物為表1中JC?WRKY6?F和JC?WRKY6?R；檢測干擾轉(zhuǎn)基因植株引物為表1中JC?RNAiWRKY6?F和JC?RNAi?WRKY6?R。將收獲的T0代種子浸種催芽播于穴盤中，待三葉一心轉(zhuǎn)移至溫室中培養(yǎng)，獲得T1代轉(zhuǎn)基因植株。按照該步驟繼續(xù)傳代培養(yǎng)至T2代，對T2代轉(zhuǎn)基因番茄幼苗再次進(jìn)行PCR檢測（PCR體系和擴(kuò)增體系同上）和RT?qPCR檢測（RT?qPCR體系和擴(kuò)增體系見1.2.4），挑選過表達(dá)株系中表達(dá)量較高的兩個株系OE?SlWRKY6?1、OE?SlWRKY6?2，以及干擾株系中表達(dá)量較低的兩個株系RNAi?SlWRKY6?1、RNAi?SlWRKY6?2，用于后續(xù)生理生化指標(biāo)的測定。選取OE?SlWRKY6?1和RNAi?SlWRKY6?1兩個株系的地下部進(jìn)行磷轉(zhuǎn)運(yùn)體家族基因相對表達(dá)量的測定。

1.2.4 總RNA提取、cDNA合成及實時熒光定量檢測 利用RNAisoPlus（TaKaRa，大連，中國）提取樣品中的RNA，將所得RNA按照金沙生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用諾唯贊公司試劑盒合成第一鏈cDNA，反應(yīng)體系為：UnionScript First?strand cDNA Synthesis Mix 4 μL、總RNA 1 μL、dsDNase 1 μL、ddH2O 14 μL?；靹蚝?2℃15 min，95℃ 3 min，在PCR儀上進(jìn)行。采用RT?qPCR方法檢測不同基因的表達(dá)水平，番茄庫中Solyc03g078400被用作Actin內(nèi)參基因，用3次技術(shù)重復(fù)進(jìn)行RT?qPCR擴(kuò)增。其中RT?qPCR反應(yīng)體系為20 μL：cDNA 4 μL，F(xiàn)orword Primer（10 μmol/L）0.4 μL，Reverse Primer（10 μmol/L）0.4 μL，2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 5.2 μL。RT?qPCR反應(yīng)程序為：預(yù)變性95℃ 30 s；95℃10 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)；溶解曲線95℃ 15 s；60℃ 60 s；95℃ 15 s。計算基因相對表達(dá)量的方法采用2-ΔΔCt，本研究中使用的所有熒光定量引物序列均見表1。

1.2.5 根系與葉片無機(jī)磷含量和酸性磷酸酶活性的測定 隨機(jī)稱取約0.2 g凍樣，加提取液2 mL（0.4 mL TCA+1.6 mL蒸餾水）充分研磨，離心提取上清液。將0.1 mL樣品上清液與1.5 mL試劑（6 mol/L硫酸∶蒸餾水∶2.5%鉬酸銨水溶液∶1%抗壞血酸=1∶4∶2∶2配置）混勻置于45℃水浴保溫30 min，室溫冷卻10 min后于660 nm測定吸光度。由于鉬藍(lán)與磷酸根生成660 nm有特征吸收峰的物質(zhì)，即可計算無機(jī)磷含量。隨機(jī)稱取約0.3 g凍樣，加提取液8 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（pH 5.8）冰浴充分磨樣，高速冷凍離心提取上清液。將0.2 mL樣品上清液與5 mL 5 mmol/L對硝基苯磷酸二鈉，37℃水浴30 min后加入1 mL 1 mol/L的NaOH溶液結(jié)束反應(yīng)。酸性磷酸酶（ACP）活性通過測量對硝基苯酚在405 nm下的吸光值來評估，一個單位的ACP活性即每克組織在405 nm處每分鐘吸光度單位的變化量［17］。

1.2.6 根系有機(jī)酸含量的測定 隨機(jī)選取同一處理下3株幼苗的根系用蒸餾水沖洗干凈，加適量液氮研磨成粉末，加入適量的超純水定容到5 mL，室溫水浴超聲提取30 min，離心提上清液，用0.45 μm微孔濾膜，每個處理重復(fù)3次，采用高效液相色譜（HPLC）測定根系中的有機(jī)酸含量。高效液相色譜條件：安捷倫C18柱（XDB?C18，5 μm，4.6 mm ×250 mm）；流動相為0.01 mol/L KH2PO4，pH為2.5（磷酸調(diào)節(jié)）；流速0.5 mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長215 nm［18］。

1.2.7 根系與葉片總磷含量的測定 隨機(jī)選取同一處理下4株幼苗的根系和葉片，用蒸餾水沖洗干凈稱其鮮重記錄，105℃殺青2 h，75℃烘干至恒重后先稱其干重記錄，再磨成粉末過0.25 mm篩。每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)稱取0.1-0.2 g樣品。參照梁穎等［19］的方法，采用H2SO4?H2O2消煮。首先將已稱取干樣用5 mL濃H2SO4過夜酸解，第2天將其在消煮爐上先120℃加熱30 min，再380℃加熱1 h后加4-5滴H2O2過氧化氫，重復(fù)此操作直至溶液清澈透明，最后380℃煮20 min以上消除多余H2O2，消解完成。參照梁穎等［19］的方法，采用鉬銻抗比色法測總磷含量。吸取消煮液0.2 mL定容至10 mL，加入兩滴2,4?二硝基苯酚指示劑，滴加4 mol/L NaOH溶液至液體變?yōu)辄S色，再加2 mol/L H2SO4溶液使黃色剛剛褪去，加鉬銻抗顯色劑2 mL后定容至50 mL，室溫?fù)u勻30 min后于700 nm測定吸光度。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理分析 為了獲得可重復(fù)性的結(jié)果，每個處理進(jìn)行3個生物重復(fù)。數(shù)據(jù)采用方差分析（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，均數(shù)比較采用Duncan’s在SPSS 20.0（SPSS Inc., Chicago, IL, USA）中P＜0.05水平下進(jìn)行。圖表繪制采用GraphPad prism8.0繪制（GraphPad Software, San Diego,California USA, www. graphpad. Com）。

2 結(jié)果

2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄遺傳轉(zhuǎn)化以及陽性植株的鑒定

獲得T0代番茄的過程如圖1?A-C和 E-F所示，經(jīng)傳代培養(yǎng)后獲得T2代轉(zhuǎn)基因植株，在三葉一心時對部分T2代番茄運(yùn)用PCR和qPCR技術(shù)進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖1?D, H和圖2所示，共獲得T2代轉(zhuǎn)基因番茄過表達(dá)7株、干擾8株，最終選擇其中表達(dá)量最高的過表達(dá)株系和表達(dá)量最低的干擾株系用于后續(xù)研究。

圖1 番茄的遺傳轉(zhuǎn)化和T2代番茄的 PCR 驗證Fig. 1 Genetic transformation in tomato and PCR validation in the tomato with the T2 generation

圖2 RT-qPCR檢測T2代轉(zhuǎn)基因番茄植株RNAi-WRKY6和OE-WRKY6中WRKY6的表達(dá)量Fig. 2 Expressions of WRKY6 in RNAi-WRKY6 and OEWRKY6 in T2 generation transgenic tomato plants detected by RT-qPCR

2.2 在低磷脅迫下轉(zhuǎn)基因番茄的表型觀察和生理生化指標(biāo)的測定

2.2.1 在低磷脅迫下轉(zhuǎn)基因番茄的表型變化 低磷處理18 d后，過表達(dá)株系莖稈粗壯、葉片伸展且色澤鮮艷、生長趨勢良好；而干擾株系莖稈細(xì)弱、葉片卷曲枯黃、生長勢較弱（圖3）。從表型觀察可得，SlWRKY6過表達(dá)顯著提高了番茄植株的耐低磷性。在低磷條件下，與WT相比，OE?WRKY6的各項生長指標(biāo)都有顯著變化，其中莖粗、地上鮮重、地下鮮重、地上干重、地下干重、總鮮重、總干重均顯著增加，OE?WRKY6?1分別提高了35.29%、79.75%、104.47%、112.82%、66.82%、88.04%、100.12%；OE?WRKY6?2分別提高了80.58%、102.74%、110.27%、67.13%、88.01%、98.35%。與OE?WRKY6相比，RNAi?WRKY6的各項生長指標(biāo)除株高顯著提高外，莖粗、地上鮮重、地下鮮重、地上干重、地下干重、總鮮重和總干重等均顯著降低（表2）。

圖3 低磷條件下轉(zhuǎn)基因番茄植株RNAi-WRKY6和OE-WRKY6的表型觀察Fig. 3 Phenotypes of transgenic tomato plant RNAi-WRKY6 and OE-WRKY6 under low phosphorus conditions

2.2.2 低磷脅迫下不同轉(zhuǎn)基因番茄植株無機(jī)磷含量和酸性磷酸酶活性的測定 在處理0 d時，WT和RNAi?WRKY6葉片的無機(jī)磷含量顯著低于OE?WRKY6；而WT和OE?WRKY6根系的無機(jī)磷含量顯著高于RNAi?WRKY6。低磷脅迫處理后，不同基因型番茄植株葉片和根系的無機(jī)磷含量均呈下降趨勢，其與處理時間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。在處理18 d時，OE?WRKY6葉片和根系的無機(jī)磷含量仍然顯著高于WT和RNAi?WRKY6，與WT相比，RNAi?WRKY6葉片的無機(jī)磷含量較少但未形成顯著差異，但根系無機(jī)磷顯著增高。低磷脅迫下，OE?WRKY6?1和OE?WRKY6?2葉片和根系的無機(jī)磷含量較WT分別顯著增加了13.25%、13.39%和46.65%、38.79%（圖4）。

圖4 低磷條件下轉(zhuǎn)基因番茄植株RNAi-WRKY6和OEWRKY6無機(jī)磷含量的測定Fig. 4 Determination of inorganic phosphorus content in transgenic tomato plants RNAi-WRKY6 and OEWRKY6 under low phosphorus condition

在未處理時，WT和RNAi?WRKY6葉片與根系的酸性磷酸酶活性顯著低于OE?WRKY6，其中RNAi?WRKY6?2根系的酸性磷酸酶活性顯著低于OE?WRKY6?1，且降低了28.75%。低磷脅迫后，不同基因型番茄幼苗葉片與根系的酸性磷酸酶活性均顯著提高，其與處理時間呈正相關(guān)關(guān)系。在低磷處理18 d時，WT和RNAi?WRKY6葉片的酸性磷酸酶活性顯著高于OE?WRKY6，而WT和RNAi?WRKY6根系的酸性磷酸酶活性顯著低于OE?WRKY6。其中與RNAi?WRKY6?2相比，OE?WRKY6?1葉片的酸性磷酸酶活性顯著降低了27.23%；與RNAi?WRKY6?1相比，OE?WRKY6?1根系的酸性磷酸酶活性顯著提高了17.53%（圖5）。

圖5 低磷條件下轉(zhuǎn)基因番茄植株RNAi-WRKY6和OEWRKY6酸性磷酸酶活性的測定Fig 5 Determination of acid phosphatase activity in transgenic tomato plant RNAi-WRKY6 and OEWRKY6 under low phosphorus condition

2.2.3 低磷脅迫下不同轉(zhuǎn)基因番茄植株全磷含量的測定 處理0 d時，WT、RNAi?WRKY6和OE?WRKY6的葉片全磷含量均無顯著差異；處理18 d后，3種基因型番茄植株葉片的全磷含量均呈下降趨勢。低磷脅迫下，與RNAi?WRKY6?2相比，OE?WRKY6?1葉片的全磷含量顯著提高了18.50%。處理0 d時，與OE?WRKY6相比，RNAi?WRKY6根系的全磷含量均顯著提高；在處理18 d后，3種基因型番茄植株的根系全磷含量均呈下降趨勢。與WT相比，OE?WRKY6根系的全磷含量顯著提高，OE?WRKY?1和OE?WRKY?2分別提高了21.23%、23.80%；而RNAi?WRKY6根系的全磷含量卻顯著下降，RNAi?WRKY6?1和RNAi?WRKY6?2分別下降了25.82%、26.71%。在處理18 d后，RNAi?WRKY6?2相較于OE?WRKY6?2的根系全磷含量降低更為顯著，降低了40.80%（圖6）。

圖6 低磷條件下轉(zhuǎn)基因番茄植株RNAi-WRKY6和OEWRKY6全磷含量的測定Fig. 6 Determination of total phosphorus content of RNAi-WRKY6 and OE-WRKY6 transgenic tomato plants under low phosphorus condition

2.2.4 低磷脅迫下不同轉(zhuǎn)基因番茄植株根系有機(jī)酸含量的測定 處理0 d時，與WT相比，OE?WRKY6根系中4種有機(jī)酸含量無顯著差異，而RNAi?WRKY6根系中檸檬酸和琥珀酸顯著降低，RNAi?WRKY6?1和RNAi?WRKY6?2分別降低了31.58%、25.34%和34.23%、27.46%。低磷脅迫后，不同基因型番茄幼苗根系中4種有機(jī)酸含量大部分都呈下降趨勢，只有OE?WRKY6根系中的琥珀酸含量處理后較未處理前顯著增加，其中OE?WRKY6?1和OE?WRKY6?2分別提高了27.95%和25.23%。在處理18 d時，草酸和琥珀酸的含量在WT和OE?WRKY6根系中有顯著差異。低磷條件下，與WT相比，OE?WRKY6?1和OE?WRKY6?2根系中草酸、琥珀酸的含量分別顯著提高了23.43%、81.77%和23.83%、81.04%。與低磷脅迫后的WT相比，RNAi?WRKY6?1中的草酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸含量分別顯著降低了57.56%、57.99%、30.96%、51.59%，RNAi?WRKY6?2中的含量分別顯著降低了58.90%、63.91%、37.62%、56.56%（表3）。

表3 低磷條件下轉(zhuǎn)基因番茄植株RNAi-WRKY6和OE-WRKY6根系有機(jī)酸含量的測定Table 3 Determination of organic acid content in the roots of transgenic tomato plant RNAi-WRKY6 and OE-WRKY6 under low phosphorus condition

2.2.5 低磷脅迫下不同轉(zhuǎn)基因番茄植株根系磷轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)量的測定 在未處理時，LePT1、LePT2和LePT3在WT、RNAi?WRKY6和OE?WRKY6植株中的相對表達(dá)量均呈現(xiàn)：OE?WRKY6＞W(wǎng)T＞RNAi?WRKY6；在低磷處理18 d后，LePT2在WT、RNAi?WRKY6和OE?WRKY6植株中的表達(dá)量相較于0 d時均有大幅度的提高，而LePT3在3種基因型植株中的表達(dá)量卻均呈下降趨勢。與LePT2、LePT3不同，低磷處理18 d后，LePT1的表達(dá)量在WT和RNAi?WRKY6植株中顯著增加，呈上升趨勢，而在OE?WRKY6中卻顯著降低，呈下降趨勢（圖7）。

圖7 RNAi-WRKY6和OE-WRKY6轉(zhuǎn)基因番茄根系中磷轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)量的測定Fig. 7 Determination of phosphorus transporter expressions in the roots of transgenic tomato plant RNAi-WRKY6 and OE-WRKY6

3 討論

3.1 低磷脅迫下SlWRKY6影響番茄幼苗表型變化和生物量分配

植株表型和生長特性的變化是植株主動適應(yīng)逆境脅迫最顯著的表現(xiàn)。低磷脅迫下，植株會根據(jù)外界環(huán)境缺磷的程度調(diào)節(jié)地上部、地下部生物積累量，而根系是最先受到脅迫影響的器官［20］。研究表明，在適應(yīng)低磷脅迫的過程中，小麥（Triticum aestivum L.）、玉米（Zea mays L.）等作物可通過增強(qiáng)根部能量物質(zhì)代謝和促進(jìn)地上部光合產(chǎn)物的轉(zhuǎn)移來維持地上部的生長發(fā)育［21］。本研究中，低磷脅迫下過表達(dá)植株長勢較為粗壯，干擾植株較為細(xì)弱；生物量方面更是差異顯著，過表達(dá)植株的地下部、地上部生物量均顯著高于野生型和干擾株系。這說明過表達(dá)WRKY6植株具有較強(qiáng)適應(yīng)低磷環(huán)境的能力，可將較多能量物質(zhì)優(yōu)先分配到根系，促使根系生長發(fā)育，改善根冠結(jié)構(gòu)，從而吸收更多的磷素供地上部正常生長發(fā)育［20］。然而當(dāng)植株體內(nèi)磷積累較多時，會造成幼苗生長遲緩，部分出現(xiàn)矮化現(xiàn)象。例如，在敲除FvPHO2基因后草莓（Fragaria×ananassa Duch.）葉片中磷含量升高且株高降低，在擬南芥和水稻（Oryza sativa L.）等模式植物中也有此類現(xiàn)象發(fā)生。本研究中，低磷脅迫下OE?SlWRKY6植株葉片與根系的全磷含量顯著高于RNAi?SlWRKY6，導(dǎo)致OE?SlWRKY6植株矮小粗壯，具有較強(qiáng)適應(yīng)低磷環(huán)境的能力［22］。

3.2 低磷脅迫下SlWRKY6增強(qiáng)番茄幼苗酸性磷酸酶活性和無機(jī)磷含量

低磷脅迫下植物為了提高對磷吸收利用的能力，不僅在根系形態(tài)結(jié)構(gòu)上產(chǎn)生變化，而且在生理代謝中也會主動提高獲得介質(zhì)中磷素的能力，以緩解低磷脅迫造成的損傷［23］。其中，酸性磷酸酶活性的增加被認(rèn)為是植物適應(yīng)低磷脅迫的普遍反應(yīng)，酸性磷酸酶能將復(fù)雜的有機(jī)磷化合物水解為可被吸收利用的無機(jī)磷，促進(jìn)有機(jī)磷源的再利用，進(jìn)而提高磷素的利用率［24］。本研究結(jié)果顯示，番茄植株中酸性磷酸酶活性變化與其他植株類似，受低磷信號誘導(dǎo)而升高，低磷脅迫下野生型、過表達(dá)、干擾植株中根系與葉片酸性磷酸酶活性均逐漸增加，表明低磷環(huán)境下植物體內(nèi)的酸性磷酸酶直接參與了植物體內(nèi)各種磷化合物的再利用。由于基因型不同，低磷誘導(dǎo)的酸性磷酸酶活性也存在較大差異［25］。當(dāng)磷正常培養(yǎng)時，不同基因型植株體內(nèi)均積累了較多的無機(jī)磷，其中OE?SlWRKY6植株中無機(jī)磷含量最高且酸性磷酸酶活性最強(qiáng)，而在轉(zhuǎn)移至低磷處理18 d后，由于OE?SlWRKY6植株前期未脅迫時自身儲備較多無機(jī)磷且葉片有較強(qiáng)的磷儲存能力，因此過表達(dá)株系中葉片的酸性磷酸酶活性較低、變化幅度較小。但隨著植株體內(nèi)積累無機(jī)磷的逐漸消耗和外界環(huán)境中較少的磷素供應(yīng)，強(qiáng)烈的低磷信號觸發(fā)了根系適應(yīng)低磷脅迫的機(jī)制，最終引起根系酸性磷酸酶活性的升高。其中，在低磷脅迫下OE?SlWRKY6植株根系的酸性磷酸酶活性最高，表明OE?SlWRKY6植株根系能有效促進(jìn)有機(jī)磷化合物水解，將水解得到的無機(jī)磷轉(zhuǎn)運(yùn)到地上部分，從而提高磷的吸收利用率。綜上可得，低磷脅迫下過表達(dá)株系酶活的增加幅度、活性以及無機(jī)磷含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生型和干擾株系，表明SlWRKY6超量表達(dá)能提高體內(nèi)酸性磷酸酶活性，有機(jī)磷庫中磷脂等有機(jī)物的磷素會被高活性的酸性磷酸酶高效水解活化，產(chǎn)生更多的無機(jī)磷應(yīng)對低磷脅迫，有效提高植株磷的再利用效率，緩解植株缺磷的狀況，保證其正常生長發(fā)育。因此，過表達(dá)SlWRKY6在低磷脅迫下，對磷的循環(huán)利用具有明顯的優(yōu)勢，是其有效應(yīng)對低磷脅迫中的一個重要機(jī)制。

3.3 低磷脅迫下SlWRKY6增強(qiáng)番茄幼苗根系的有機(jī)酸含量

外界不利的環(huán)境因素和植物體內(nèi)養(yǎng)分的豐缺，都能一定程度上影響有機(jī)酸的合成和積累［26］。有機(jī)酸作為三羧酸循環(huán)的主要產(chǎn)物，也是植物體物質(zhì)和能量代謝的重要中間產(chǎn)物，不僅可以反映植物的磷素吸收、運(yùn)輸、積累等代謝過程，而且在應(yīng)對營養(yǎng)脅迫中扮演著重要角色［27］。本研究中，低磷下番茄根系除琥珀酸外，其余3種有機(jī)酸含量均顯著下降，這是由于已適應(yīng)低磷環(huán)境的番茄根系對有機(jī)酸的合成和積累表現(xiàn)出明顯的抑制作用［28］。OE?SlWRKY6植株根系的4種有機(jī)酸含量均顯著高于RNAi?WRKY6株系，說明低磷脅迫下，OE?SlWRKY6植株通過提高根系有機(jī)酸的合成能力以適應(yīng)低磷脅迫。有研究表明，酸性磷酸酶活性與有機(jī)酸含量呈正相關(guān)關(guān)系［29］，本研究中低磷脅迫下OE?SlWRKY6植株根系的酸性磷酸酶活性和有機(jī)酸含量均最高，更加充分驗證SlWRKY6超表達(dá)后可提高植株對低磷脅迫的適應(yīng)性。蘋果酸是過表達(dá)株系與干擾株系中含量差異較為懸殊的有機(jī)酸之一，其不僅能活化難溶性磷酸鹽釋放無機(jī)磷，還能作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)提高細(xì)胞液濃度，在增強(qiáng)植株抗逆性方面發(fā)揮作用；這也充分印證了OE?SlWRKY6植株在應(yīng)對低磷脅迫時自身具有較高的適應(yīng)性［30］。TCA循環(huán)中琥珀酸主要是由琥珀酰CoA受琥珀酰CoA合成酶催化生成的，這一過程中同時還生成了GTP或ATP，因此其也是TCA循環(huán)中唯一一次底物水平磷酸化［31］。OE?SlWRKY6植株根系在低磷脅迫后琥珀酸含量顯著增加，而野生型與RNAi?WRKY6的含量顯著降低，與此同時，OE?SlWRKY6植株細(xì)胞能量狀態(tài)指示劑ATP也會隨之增加。植物體代謝過程中的細(xì)胞高能狀態(tài)指示劑除ATP外還有NADH和檸檬酸等，他們能反映出植物體在應(yīng)對不良外界環(huán)境時自身能量充足或匱乏的狀態(tài)［32］。低磷脅迫下，過表達(dá)SlWRKY6植株根系中檸檬酸的含量也是3種基因型中最高的，表明OE?SlWRKY6株系在外界磷供給不足時，自身具有強(qiáng)大的能量代謝循環(huán)系統(tǒng)和適應(yīng)低磷脅迫機(jī)制，通過協(xié)同調(diào)控根系有機(jī)酸的合成來保證植物體正常的能量供給，進(jìn)而適應(yīng)低磷脅迫。

3.4 低磷脅迫下SlWRKY6影響番茄幼苗根系磷轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)

研究表明，外界磷素供應(yīng)濃度可直接影響植株體內(nèi)的磷素水平，進(jìn)而誘導(dǎo)磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，而磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控直接或間接地調(diào)控著磷的獲得，對植株在低磷條件下生理代謝平衡起著重要作用［33］。當(dāng)外界磷素供應(yīng)不足時，植株自身進(jìn)化出一系列生理生化機(jī)制實現(xiàn)磷的活化、轉(zhuǎn)運(yùn)以及再利用，例如大分子物質(zhì)核酸、磷脂中的有機(jī)磷被酸性磷酸酶等水解活化、液泡中暫儲多余的無機(jī)磷被轉(zhuǎn)運(yùn)以及營養(yǎng)器官中活化的無機(jī)磷被轉(zhuǎn)運(yùn)到新生長中心再利用［34］。高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)體在介導(dǎo)這些植株磷素吸收運(yùn)輸過程中發(fā)揮著重要的作用，研究表明低磷下，番茄植株中負(fù)責(zé)體內(nèi)磷素轉(zhuǎn)運(yùn)分配的LePT1和負(fù)責(zé)根系吸收磷素的LePT2表達(dá)量均顯著增加［35］，與本研究結(jié)果一致，低磷脅迫后，野生型和RNAi?SlWRKY6根系的LePT1、LePT2表達(dá)量顯著升高進(jìn)而提高磷的吸收利用率，但過表達(dá)植株根系中的LePT1、LePT3的表達(dá)量卻在低磷脅迫后顯著降低。這是由于過表達(dá)植株在正常條件下，根系磷轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)量和酸性磷酸酶活性較高，能水解出較多的無機(jī)磷供利用，且自身有較充足的無機(jī)磷儲備。因此，OE?SlWRKY6植株在面臨低磷脅迫時體內(nèi)的磷素水平所受影響較小，其根系與葉片的全磷含量顯著高于野生型和RNAi?WRKY6植株，同時也表明過表達(dá)植株內(nèi)部具有高效調(diào)節(jié)利用磷素機(jī)制可有效應(yīng)對低磷脅迫的發(fā)生。有研究證實，WRKY21和WRKY108可作為磷饑餓條件下植株自身的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器，與OsPht1;1的W?box區(qū)域結(jié)合，正向調(diào)控植株耐低磷性［13］。這與本研究中WRKY6基因相對表達(dá)量較高的植株具有較強(qiáng)吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和再利用磷酸鹽能力的表現(xiàn)一致，但WRKY6是否直接調(diào)控PHT家族基因的表達(dá)，進(jìn)而對番茄植株磷素穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生影響仍有待進(jìn)一步試驗驗證。最終可得，低磷條件下過表達(dá)SlWRKY6基因能增強(qiáng)番茄植株的耐低磷性，提高磷的再活化、再轉(zhuǎn)運(yùn)和再利用，緩解外界磷素供應(yīng)不足造成的損傷。該研究也為進(jìn)一步揭示番茄根系適應(yīng)低磷脅迫的分子機(jī)制提供了重要理論依據(jù)。

4 結(jié)論

番茄中WRKY6基因在響應(yīng)低磷脅迫過程中起著重要作用，其可通過增強(qiáng)酸性磷酸酶活性、提高有機(jī)酸合成量和改善根系與葉片磷素轉(zhuǎn)運(yùn)分配等途徑，增強(qiáng)番茄植株對外界磷素的吸收和體內(nèi)磷營養(yǎng)的重分配再利用，最終實現(xiàn)磷的高效吸收利用。