支添添 周舟 陳紀(jì)鵬 韓成云

（1. 宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院 宜春學(xué)院江西省作物生長發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，宜春 336000；2. 宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，宜春 336000）

酪氨酸降解途徑在動物中必不可少，若中斷將導(dǎo)致嚴(yán)重的代謝疾?。?-3］。這條途徑首先在動物和細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)［4-5］，是一條非常重要的代謝途徑。Dixon等［6］證明擬南芥（Arabidopsis thaliana）中存在酪氨酸降解途徑的關(guān)鍵酶，并且和動物中有相同的功能。越來越多的證據(jù)表明，植物具有典型的酪氨酸分解代謝途徑［7-13］。延胡索酰乙酰乙酸酶（fumarylacetoacetate hydrolase, FAH）是酪氨酸代謝途徑的最后一個酶，F(xiàn)AH（SSCD1）基因的突變導(dǎo)致擬南芥在短日照下產(chǎn)生模擬病斑并激活植物防御［11-12］。

模擬病斑突變體是一類在沒有明顯的逆境、損傷或病原物侵害時，在葉片上能自發(fā)地形成類似病原物侵染后的壞死斑的突變體，這類突變體在植物中廣泛存在，如擬南芥、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）、小麥（Triticum aestivum）、大麥（Hordeum vulgare）等中均有報道［14-19］。這些突變體往往能激活植物體的系統(tǒng)獲得性抗性，通常具有與抗病反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞學(xué)和生物化學(xué)特征，對許多病原物表現(xiàn)出局部和系統(tǒng)抗性，是研究植物抗病機(jī)理的理想材料［20］，如bon1（bonzai1）和cpr1/cpr30模擬病斑突變體對丁香假單胞菌有抗性［21-22］。水稻模擬病斑突變體oscul3a對稻瘟病菌和黃單胞菌均有很強(qiáng)的抗性［23］，大麥mlo突變體對白粉病具有非特異性抗性［24］，小麥模擬病斑突變體Ning7840和lm3分別對葉銹病和白粉病具有抗性［25-26］。

研究表明模擬病斑突變體的抗病性與植物抗病信號中的水楊酸（salicylic Acid, SA）、茉莉酸（jasmonic acid, JA）、乙烯（ethylene, ET）等信號分子均有相關(guān)，這些植物激素不同程度地參與了抗病過程中的不同環(huán)節(jié)，起著非常重要的作用［27-32］。前期研究證實(shí)sscd1突變體產(chǎn)生模擬病斑的同時積累JA，同時激活調(diào)控JA/ET信號途徑的部分病程相關(guān)基因PDF1.2，VSP1和SA病程相關(guān)基因PR1［12］。盡管sscd1中的模擬病斑的產(chǎn)生伴隨著SA誘導(dǎo)基因PR1的上調(diào)，但與SA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)無關(guān)；而JA信號通路的中斷顯著抑制sscd1模擬病斑的產(chǎn)生［12］。這些結(jié)果說明FAH基因突變在短日照下激活擬南芥抗病信號途徑從而調(diào)控植物抗病。

甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）是我國重要的油料作物，是第一大國產(chǎn)食用植物油來源和我國第二大飼用蛋白源［33］。然而，各種病害的頻繁發(fā)生嚴(yán)重影響著油菜的產(chǎn)量和品質(zhì)［34］。因此，挖掘油菜抗病相關(guān)遺傳資源、提高油菜抗病性對于油菜生產(chǎn)具有重要意義。甘藍(lán)型油菜是白菜（Brassica rapa, AA, 2n=20）和甘藍(lán)（Brassica oleracea, CC,2n=18）通過自然雜交形成的異源四倍體作物（AACC,2n=4X=38）［35-36］，白菜和甘藍(lán)的基因組在古老的多倍化事件中都經(jīng)歷了3倍化的過程［37］。因此，甘藍(lán)型油菜相比擬南芥，具有更加復(fù)雜的基因組特征并且大多數(shù)基因具有多個同源拷貝，具有冗余或不同的功能［38］。盡管在擬南芥中已證實(shí)FAH基因突變在短日照下產(chǎn)生模擬病斑并激活抗病反應(yīng)，但鑒于甘藍(lán)型油菜相比擬南芥基因組更復(fù)雜，仍需要鑒定不同F(xiàn)AH基因在甘藍(lán)型油菜中的功能并分析其各自的表達(dá)模式。

本研究從甘藍(lán)型油菜克隆了2個與擬南芥高度同源的FAH基因BnaA06g38260D（BnaA06FAH）和BnaC05g49430D（BnaC05FAH），通過生物信息學(xué)分析其編碼的蛋白質(zhì)序列和進(jìn)化關(guān)系；構(gòu)建過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥突變體sscd1進(jìn)行功能驗(yàn)證；進(jìn)一步對BnaA06FAH和BnaC05FAH啟動子進(jìn)行克隆，探究其序列特征和潛在的響應(yīng)元件，構(gòu)建含有報告基因GUS的植物表達(dá)載體，通過GUS染色揭示其表達(dá)模式，為深入研究BnaA06FAH 和BnaC05FAH在甘藍(lán)型油菜中的作用和功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

甘藍(lán)型油菜品種為‘westar’、擬南芥（Arabidopsis thaliana）生態(tài)型為哥倫比亞（Columbia, Col?0），突變體sscd1、大腸桿菌菌株DH5α、農(nóng)桿菌菌株GV3101、啟動子分析載體pCAMBIA1301和過表達(dá)載體pBI121均由宜春學(xué)院江西省作物生長發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。擬南芥sscd1突變體在短日照下產(chǎn)生模擬病斑［11］。

1.2 方法

1.2.1 DNA、RNA的提取及cDNA合成 待甘藍(lán)型油菜長到四葉期，取適量的新鮮的葉片用液氮研磨，用高效植物基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取葉片基因組DNA，使用分光光度計（ND?1000, NanoDrop, Thermo Fisher Scientific）檢測濃度后儲存于?20℃，用作克隆啟動子序列的模板；用Trizol（RNAiso Plus, 寶生物工程有限公司）提取總RNA，進(jìn)一步用DNase I（RNase Free,Thermo Fisher Scientific）去除基因組DNA后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTraAce qPCR RT試劑盒（perfect real time, Toyobo），將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用作克隆CDS序列的模板。

1.2.2 BnaA06FAH和BnaC05FAH的CDS序列和啟動子的克隆以及載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

1.2.2.1 引物設(shè)計及目的片段的擴(kuò)增 在甘藍(lán)型油菜數(shù)據(jù)庫（https://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/）中獲得BnaA06FAH和BnaC05FAH的cDNA預(yù)測序列。利用軟件Primer premier 5.0在2個基因非編碼區(qū)設(shè)計特異引物（表1），用TaKaRa高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以擴(kuò)增得到的cDNA為模板，在BnaA06FAH和BnaC05FAH上游引物的5′添加Xba I（TCTAGA）限制性內(nèi)切酶和保護(hù)堿基（GC）以及下游引物5′添加Sac I（GAGCTC）限制性內(nèi)切酶和保護(hù)堿基（C）（引物見表1），再次進(jìn)行CDS序列的PCR擴(kuò)增，目的片段大小預(yù)期為1 266 bp，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收并純化，測序。

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in the experiment

在NCBI中獲得BnaA06FAH和BnaC05FAH翻譯起始位點(diǎn)ATG上游1.8 kb左右的DNA序列，根據(jù)啟動子序列，利用軟件Primer premier 5.0分別設(shè)計擴(kuò)增引物（表1），在上下游引物的5′端分別加上Xba I和Bgl II酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基，以‘westar’總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的片段大小預(yù)期為1 980 bp（BnaA06FAH）和1 708 bp（BnaC05FAH），經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收并純化，測序。

1.2.2.2 35S∷BnaC05FAH和35S∷BnaA06FAH重組載體的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶Xba I和Sac I對已測序驗(yàn)證的BnaA06FAH和BnaC05FAH的CDS序列和pBI121載體分別進(jìn)行雙酶切，然后將目的片段和載體進(jìn)行連接，使目的基因替換原載體上的GUS，構(gòu)建35S∷BnaC05FAH和35S∷BnaA06FAH過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取菌落進(jìn)行PCR鑒定，對鑒定的陽性菌落進(jìn)行測序，以確保載體構(gòu)建的準(zhǔn)確性。

1.2.2.3 pBnaC05FAH∷GUS和pBnaA06FAH∷GUS重組載體的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶Xba I和Bgl II對已測序驗(yàn)證的BnaA06FAH和BnaC05FAH的啟動子序列及pCAMBIA1301載體進(jìn)行雙酶切，然后進(jìn)行連接，用BnaA06FAH和BnaC05FAH啟動子替換pCAMBIA1301載體上原有35S啟動子。通過熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，隨機(jī)挑選陽性克隆進(jìn)行菌落PCR及酶切檢測，測序。將測序驗(yàn)證正確的陽性克隆進(jìn)行搖菌和質(zhì)粒提取。

1.2.2.4 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化及篩選 用CaCl2凍融法將已驗(yàn)證的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，挑選菌落PCR驗(yàn)證正確的農(nóng)桿菌單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，28℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)18-24 h。7 352 r/min離心活化菌液2 min，棄上清，用農(nóng)桿菌懸浮液（5%蔗糖+1/2 MS+0.02% Silwet?L77+0.01% 6?BA）將菌體重懸至OD600為0.6-1.0。利用浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥，收取T0代種子，在含有潮霉素（25 mg/L）或卡那霉素（50 mg/L）的MS培養(yǎng)基上篩選成功轉(zhuǎn)入表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株，將篩選到的轉(zhuǎn)基因植株T0代抗性苗移入土中，后代單株收種。挑選T2代抗性符合3∶1分離比的轉(zhuǎn)基因株系，用GUS組織化學(xué)法檢測啟動子活性。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 PLANTCARE在線分析啟動子序列包含的順式作用元件（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）。用Bioxm2.7軟件分析BnaA06FAH和BnaC05FAH序列的開放閱讀框（open reading frame, ORF）。從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載不同物種FAH蛋白的氨基酸序列，用DNAMAN 6.0軟件對氨基酸序列進(jìn)行比對，用MEGA 11.0軟件對氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

1.2.4 GUS組織染色 根據(jù)潮霉素抗性在MS固體培養(yǎng)基上篩選pBnaC05FAH∷GUS和pBnaA?06FAH∷GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥至T3代，用GUS染色液（GUS Blue KIT, 北京華越洋生物科技有限公司）對MS培養(yǎng)基上9和14 d的擬南芥進(jìn)行GUS染色，并將14 d幼苗移栽到土中生長至抽薹開花，剪下莖前端進(jìn)行染色：將擬南芥被配置好的染色液完全覆蓋，抽真空2-3次，每次10 min后，用錫箔紙包好，37℃孵育24 h，70%乙醇脫色3 d，每天更換到脫色完全。染色結(jié)束后將植株置于體式顯微鏡下（Nikon SMZ800N）觀察并拍照記錄。

1.2.5 RT?qPCR 采用SYBR qPCR混合試劑盒（Toyobo）和ABI 7300序列檢測系統(tǒng)（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）按照說明書進(jìn)行實(shí)時定量PCR。RT?qPCR檢測的基因引物見表1，以ACTIN2作為內(nèi)參。每個樣本的基因表達(dá)量在3次分析重復(fù)中計算，相對表達(dá)量用2-ΔΔCt方法定量。所有試驗(yàn)至少重復(fù)3次。表中的數(shù)據(jù)表示為RT?qPCR中3次生物重復(fù)的平均值±SE。

2 結(jié)果

2.1 BnaA06FAH和BnaC05FAH的CDS序列擴(kuò)增

根據(jù)AtFAH氨基酸序列，通過BnIR（Brassica napus multi?omics information resource）進(jìn)行BLAST比對，獲得同源性最高的2個甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）FAH基因：BnaA06g38260D（BnaA06FAH）和BnaC05g49430D（BnaC05FAH）。根據(jù)基因cDNA序列設(shè)計引物，以甘藍(lán)型油菜品種‘westar’葉片cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得BnaA06FAH和BnaC05FAH的CDS序列（圖1），測序。

圖1 BnaA06FAH和BnaC05FAH CDS序列的PCR擴(kuò)增Fig. 1 PCR products of CDS sequences of BnaA06FAH and BnaC05FAH

2.2 BnaA06FAH和BnaC05FAH的CDS序列生物信息學(xué)分析

測序后的CDS序列翻譯成氨基酸序列，與擬南芥AtFAH（NP 172669.2）進(jìn)行同源比對，同源性分別為93.11%和92.40%（圖2?A）。基于BnaA06FAH和BnaC05FAH的氨基酸序列，與蘿卜、擬南芥、薺菜、亞麻芥、玉米和短花藥野生稻的FAH基因全長預(yù)測氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果（圖2?B）顯示，甘藍(lán)型油菜中該基因與白菜和甘藍(lán)的親緣關(guān)系最近，其次是蘿卜，再而是擬南芥，與單子葉植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 BnaA06FAH和BnaC05FAH氨基酸序列比對（A）和進(jìn)化樹分析（B）Fig. 2 Amino acid sequences alignment（A）and phylogenetic tree（B）of BnaA06FAH and BnaC05FAH

2.3 BnaA06FAH和BnaC05FAH的功能驗(yàn)證

為了驗(yàn)證BnaA06FAH和BnaC05FAH的功能，構(gòu)建35S∷BnaA06FAH和35S∷BnaC05FAH過表達(dá)載體，通過浸花法轉(zhuǎn)入擬南芥sscd1突變體，以T2代純合株系的蓮座葉cDNA為模板，分別選擇4個獨(dú)立株系進(jìn)行熒光定量PCR分析，結(jié)果（圖3）顯示，BnaA06FAH和BnaC05FAH在sscd1突變體中本身無表達(dá)，其相對表達(dá)量為0；擬南芥突變體sscd1轉(zhuǎn)基因植株中35S∷BnaA06FAH?sscd17?2和35S∷BnaC05FAH?sscd14?11的相對表達(dá)量最高，作為后續(xù)試驗(yàn)的研究材料。

圖3 過表達(dá)擬南芥株系中BnaA06FAH和BnaC05FAH的相對表達(dá)量Fig 3 Relative expressions of BnaA06FAH and BnaC05?FAH in overexpressed A. thaliana line

當(dāng)在擬南芥sscd1突變體中過表達(dá)甘藍(lán)型油菜BnaA06FAH和BnaC05FAH，sscd1突變體在短日照下的模擬病斑完全被抑制（圖4）。結(jié)果表明，甘藍(lán)型油菜BnaA06FAH和BnaC05FAH的功能都與擬南芥AtFAH相似。

圖4 短日照下過表達(dá)BnaA06FAH和BnaC05FAH抑制擬南芥突變體sscd1的模擬病斑Fig. 4 Overexpressions of BnaA06FAH and BnaC05FAH repress the simulated disease spot in Arabidopsis mutant sscd1 under short-day condition

2.4 BnaA06FAH和BnaC05FAH啟動子序列的擴(kuò)增和生物信息學(xué)分析

在甘藍(lán)型油菜數(shù)據(jù)庫和NCBI中獲得BnaA?06FAH和BnaC05FAH對應(yīng)的基因組序列，選取ATG上游1.8 kb左右的序列。以甘藍(lán)型油菜‘westar’基因組DNA為模板，設(shè)計特異性的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（表1），分別獲得BnaA06FAH和BnaC05FAH的啟動子片段（圖5）。在TAIR（http://www.arabi?dopsis.org/）網(wǎng)站獲得擬南芥AtFAH基因（AT1G12050）ATG上游1.8 kb的啟動子序列，通過PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）數(shù)據(jù)庫在線分析，并與BnaA06FAH和BnaC?05FAH啟動子順式作用元件進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BnaA06FAH、BnaC05FAH和AtFAH啟動子序列除了都含有基本轉(zhuǎn)錄元件CAAT?box、TATA?box外，還含有多種應(yīng)答元件。應(yīng)答元件又可分為生長發(fā)育、光響應(yīng)、脅迫響應(yīng)和激素響應(yīng)4類元件（圖6），說明甘藍(lán)型油菜BnaA06FAH和BnaC05FAH和擬南芥AtFAH的表達(dá)都可能響應(yīng)光、植物激素和脅迫的誘導(dǎo)。生長發(fā)育類別中，涉及胚乳表達(dá)（AAGAA?mo?tif）、晝夜節(jié)律（circadian）和玉米醇溶蛋白代謝（O2?site）等，其中O2?site占比例最高，為43%。光響應(yīng)有12種順式作用元件，包括AE?box、AT1?motif、ATCT?motif、Box 4、G?Box、G?box、GA?motif、GT1?motif、Sp1、TCT?motif和MRE，其中G?box占比最大，為21%。脅迫響應(yīng)類別有6種順式作用元件，分別與防御應(yīng)激（STRE、as?1）、厭氧誘導(dǎo)（ARE）、脫水（DRE core）、創(chuàng)傷（WRE3和WUN?motif）和病原誘導(dǎo)（W?box）相關(guān)，其中as?1和WRE3所占的比例最高，為32%。激素響應(yīng)類別中的元件包括脫落酸（ABRE、ABRE3a、ABRE4）、生長素（TGA?element、TGA?box）、赤霉素（GARE?motif）、茉莉酸甲酯（CGTCA?motif、TGACG?motif）應(yīng)答元件，其中響應(yīng)茉莉酸甲酯的順式作用元件占比最大，為25%。另外，這些應(yīng)答元件還參與抗病響應(yīng)，如W?box、ERE、GT1?motif、G?box、as?1、TGACG?motif和CGTCA?motif，其中BnaA06FAH、BnaC05FAH和擬南芥AtFAH共有的啟動子順式作用元件有as?1、GT1?motif、TGACG?motif和CGTCA?motif，說明無論擬南芥還是甘藍(lán)型油菜FAH基因的表達(dá)很可能與植物抗病性相關(guān)。

圖5 BnaA06FAH和BnaC05FAH啟動子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig. 5 PCR products of BnaA06FAH and BnaC05FAH promotors

圖6 AtFAH、BnaC05FAH和BnaA06FAH啟動子應(yīng)答元件分析Fig. 6 Analysis of promoter response elements of AtFAH, BnaC05FAH and BnaA06FAH

BnaA06FAH相比BnaC05FAH與擬南芥AtFAH啟動子共同擁有更多順式作用元件，如激素響應(yīng)順式作用元件（ABRE、ABRE3a、ABRE4）、光響應(yīng)元件（Sp1和G?box）、脫水響應(yīng)元件（DRE core）和創(chuàng)傷響應(yīng)元件（WRE3, 表2）。除了兩者共同的啟動子順式元件，兩者都存在特異的啟動子順式作用元件：BnaC05FAH特異的大部分都是光響應(yīng)元件（如AE?box、GA?motif和AT1?motif）；而BnaA06FAH沒有光響應(yīng)元件，有激素防御相關(guān)（GARE?motif、TGA?element、W?box）誘導(dǎo)和與生長發(fā)育相關(guān)的順式調(diào)控元件（表3）。說明甘藍(lán)型油菜BnaA06FAH和BnaC05FAH的表達(dá)調(diào)控可能存在差異。

表2 BnaC05FAH、BnaA06FAH和AtFAH啟動子區(qū)共同順式作用元件Table 2 Common cis-acting elements in BnaC05FAH, BnaA06FAH and AtFAH promoter regions

表3 BnaC05FAH、BnaA06FAH和AtFAH啟動子區(qū)包含的不同順式作用元件Table 3 Different cis-acting elements in BnaC05FAH, BnaA06FAH and AtFAH promoter regions

2.5 BnaA06FAH和BnaC05FAH表達(dá)模式分析

為了探明BnaA06FAH和BnaC05FAH的表達(dá)模式，構(gòu)建BnaA06FAHPro∷GUS和BnaC05FAH?Pro∷GUS融合表達(dá)載體，通過電擊法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101中，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col?0，利用潮霉素抗性篩選轉(zhuǎn)基因擬南芥至T3代，同時以未轉(zhuǎn)入任何載體的GV3101菌株侵染的擬南芥作為陰性對照（CK）。分別對生長9和14 d的T3代陽性和陰性植株幼苗、花和角果進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，在實(shí)體顯微鏡下觀察染色情況。結(jié)果（圖7）顯示，在9 d的幼苗中，轉(zhuǎn)化BnaC05FAHPro∷GUS和BnaA06FAHPro∷GUS的陽性植株都在子葉、葉柄、下胚軸和根部位檢測到GUS的表達(dá)；待植株生長至14 d，BnaC05FAHPro驅(qū)動的GUS幾乎在所有部位都有表達(dá)，而BnaA06FAHPro∷GUS轉(zhuǎn)基因植株中GUS表達(dá)集中在子葉、幼嫩的真葉、下胚軸以及根。對花的染色結(jié)果顯示，BnaC05FAHPro∷GUS轉(zhuǎn)基因植株中GUS在莖稈、花萼、花絲，雌蕊的柱頭、花柱和子房中表達(dá)，相比之下，BnaA06FAHPro∷GUS轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)部位只集中在莖稈、花萼、花柱和子房，而柱頭、花藥、花絲和花瓣都沒有表達(dá)；二者幼嫩角果里的胚珠都可以染色，但BnaC05FAHPro∷GUS轉(zhuǎn)基因植株角果的心皮上也有染色。表達(dá)強(qiáng)度上，轉(zhuǎn)化BnaA06FAH啟動子的陽性苗組織藍(lán)色斑點(diǎn)顏色在所有時期均比轉(zhuǎn)BnaC05FAH啟動子的陽性苗淺，說明BnaC05FAH啟動子對GUS的驅(qū)動強(qiáng)度明顯比BnaA06FAH強(qiáng)。綜上所述，BnaA06FAH和BnaC05FAH啟動子驅(qū)動GUS在擬南芥中的表達(dá)在無論其組織部位還是強(qiáng)度上都存在明顯差異。

圖7 甘藍(lán)型油菜BnaC05FAH、BnaA06FAH啟動子驅(qū)動GUS在擬南芥中的表達(dá)Fig. 7 GUS expressions driven by BnaC05FAH and BnaA?06FAH promoters from B. napus in Arabidopsis seedlings

3 討論

油菜是僅次于玉米和油棕的第三大重要油料作物［39］。甘藍(lán)型油菜具有株型高大或較高大，單產(chǎn)高和適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)良特性，成為我國和全世界主要栽培和種植的油菜類型［40］。但是，在甘藍(lán)型油菜的生長過程中會遭受很多病害的威脅，目前，生產(chǎn)上主要釆用栽培和化學(xué)的方法防治病害，但其效果十分有限［41-42］。因此，選育抗病品種無疑成為油菜抗病育種最根本也是最有效的方法。然而，當(dāng)前栽培的甘藍(lán)型油菜品種缺少相關(guān)抗性基因，嚴(yán)重制約著油菜抗病育種進(jìn)程。近年來，植物功能基因組學(xué)和基因工程的研究發(fā)展迅猛，特別是在模式植物擬南芥中抗病相關(guān)基因以及抗病分子機(jī)制研究取得了突破性進(jìn)展。在與擬南芥同科的甘藍(lán)型油菜中，克隆和研究抗病相關(guān)基因，對提高甘藍(lán)型油菜的抗病性具有重要的理論和實(shí)踐意義。

油菜與擬南芥同屬十字花科蕓薹屬植物，研究證明二者基因組的同源性很高。課題組前期研究證實(shí)酪氨酸降解途徑在植物中具有生物功能，編碼酪氨酸降解途徑FAH的基因SSCD1突變后導(dǎo)致擬南芥在短日照下產(chǎn)生模擬病斑［8］，并激活JA/ET途徑和病程相關(guān)基因的表達(dá)［11］。本研究克隆兩個與擬南芥高度同源的甘藍(lán)型油菜FAH基因BnaA06FAH和BnaC05FAH，分析發(fā)現(xiàn)其編碼的氨基酸序列與擬南芥ATFAH的氨基酸序列相似性高達(dá)93.11%和92.40%，分子進(jìn)化分析表明，BnaA06FAH和BnaC05FAH雖然分別與白菜和甘藍(lán)同源性最高，進(jìn)化關(guān)系最近，但與擬南芥同樣具有較高同源性，并且BnaA06FAH和BnaC05FAH在雙子葉植物中親緣關(guān)系較近，而與單子葉植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。通過構(gòu)建過表達(dá)載體，進(jìn)一步驗(yàn)證2個甘藍(lán)型油菜FAH基因的過表達(dá)都能抑制擬南芥突變體sscd1在短日照下模擬病斑的形成，說明FAH基因在甘藍(lán)型油菜中的功能很可能與擬南芥非常相似。另外，對甘藍(lán)型油菜和擬南芥FAH基因啟動子區(qū)域順式作用元件的分析表明，AtFAH和BnFAH的啟動子中包含7種參與抗病響應(yīng)的順式作用元件（W?box、ERE、GT1?motif、G?box、as?1、TGACG?motif和CGTCA?motif）以及植物激素響應(yīng)元件。W?box是一類植物病原誘導(dǎo)相關(guān)基因的順式作用元件［43-44］，ERE元件能夠調(diào)控真菌誘導(dǎo)表達(dá)，分別存在于BnaA06FAH和BnaC05FAH啟動子中。G?box能與bZIP蛋白結(jié)合［45］，分別存在于BnaA06FAH和AtFAH的啟動子中。三者的啟動子中都含有GT1?motif和as?1元件，GT1?motif的表達(dá)由病原體誘導(dǎo)，部分與GT?1?like轉(zhuǎn)錄因子相互作用，GT?1?like轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合病程相關(guān)PR?1a啟動子，影響水楊酸誘導(dǎo)基因的表達(dá)水平［46］。另外，三者啟動子都含有響應(yīng)JA的TGACG?motif和CGTCA?motif。JA響應(yīng)死體型病原菌的侵入，并且能誘導(dǎo)許多植物產(chǎn)生防衛(wèi)應(yīng)答反應(yīng)。在擬南芥中，酪氨酸代謝相關(guān)基因TAT3、HGO、MAAI以及FAH（SSCD1）的表達(dá)已證實(shí)受到JA的誘導(dǎo)［11］。綜上所述，甘藍(lán)型油菜FAH基因BnaA06FAH和BnaC05FAH的功能很可能與擬南芥相似，并且都與抗病和JA相關(guān)。

蕓薹屬是十字花科中包含許多重要經(jīng)濟(jì)作物的一個屬，包括白菜、甘藍(lán)、油菜等常見的蔬菜和油料作物，是農(nóng)業(yè)育種研究中非常重要的研究材料。甘藍(lán)型油菜由二倍體祖先種白菜（B. rapa, 2n=20,AA）和甘藍(lán)（B. oleracea, 2n=18, CC）經(jīng)過自然雜交形成的［27］。蘿卜是十字花科植物中與蕓薹屬親緣關(guān)系最近的物種［47］，研究者普遍認(rèn)為蕓薹屬及其近緣屬蘿卜屬起源于一個共同的祖先種，因此在進(jìn)化樹分析中，甘藍(lán)型油菜FAH基因與白菜和甘藍(lán)親緣關(guān)系最近，其次是蘿卜，再者是擬南芥。白菜是蕓薹屬第一個完成基因組測序的栽培種，通過與擬南芥的比較基因組分析發(fā)現(xiàn)，它們有著很好的共線性關(guān)系。甘藍(lán)也是一種重要的蔬菜作物，與白菜比較發(fā)現(xiàn)其基因組局部上存在著大量的染色體重排，特定通路內(nèi)基因的保留以及同源基因的表達(dá)也存在顯著差異［48］。甘藍(lán)型油菜BnFAH基因一個來源白菜（BnaA06FAH），另一個來源甘藍(lán)（BnaC05FAH）。啟動子順式作用元件分析結(jié)果表明，與BnaC05FAH相比，BnaA06FAH和擬南芥擁有更多相同的順式作用元件，此外，它們存在各自的特異順式元件。GUS組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，BnaA06FAH和BnaC05FAH啟動子驅(qū)動GUS在不同生長時期擬南芥中表達(dá)的部位和強(qiáng)度都存在差異，BnaC05FAH在各種生長時期擬南芥中的表達(dá)都比BnaA06FAH強(qiáng)；在14 d蓮座葉、花及果莢中，不僅表達(dá)強(qiáng)而且表達(dá)的部位更多。綜上所述，甘藍(lán)型油菜BnaA06FAH和BnaC05FAH無論是啟動子順式元件還是啟動子驅(qū)動的組織表達(dá)上都存在差異，這些結(jié)果為深入研究甘藍(lán)型油菜BnaA06FAH和BnaC05FAH的功能奠定基礎(chǔ)，為油菜抗病育種工作提供種質(zhì)資源。

4 結(jié)論

克隆獲得與擬南芥AtFAH同源性最高的2個甘藍(lán)型油菜FAH基因BnaA06FAH和BnaC05FAH，其編碼的氨基酸序列與擬南芥的同源性高達(dá)93.11%和92.40%。過表達(dá)BnaA06FAH和BnaC05FAH都能夠完全抑制擬南芥sscd1突變體在短日照下的模擬病斑表型。二者可能都與模擬病斑形成相關(guān)。甘藍(lán)型油菜FAH基因BnaA06FAH和BnaC05FAH的功能與擬南芥AtFAH高度相似，但兩者的啟動子在擬南芥中對下游基因的驅(qū)動無論在強(qiáng)度還是部位上均存在顯著差異。