劉金升 陳振婭 霍毅欣 郭淑元

（北京理工大學生命學院，北京 100081）

流式細胞術（flow cytometry，F(xiàn)CM）是一種廣泛應用于生物學、醫(yī)學和藥物研發(fā)等領域的重要技術。FCM可以快速、高通量地分析溶液中的單個細胞，并且能同時獲取多個參數(shù)信息，例如細胞大小、形態(tài)、表面標記、代謝狀態(tài)、DNA含量等。這些信息對于了解細胞的生物學特性、疾病發(fā)生機制、藥物篩選和療效評估等都具有重要的意義。目前，F(xiàn)CM與質譜、顯微成像等技術結合，形成了多種功能的組合技術，已廣泛應用于免疫學、分子生物學、細菌學、病毒學、癌癥生物學和傳染病監(jiān)測等領域［1-7］。其中，熒光激活細胞分選術（fluorescence?activated cell sorting，F(xiàn)ACS）是基于FCM建立的一種可以實現(xiàn)熒光標記單細胞分選的技術［8］。

由于溫度、pH和溶劑穩(wěn)定性，以及底物特異性和活性的限制，天然酶通常不是工業(yè)生產(chǎn)的最佳選擇。定向進化是改善酶催化活性和熱穩(wěn)定性的常用方法［9-10］，利用易錯PCR等技術［10-12］能夠大量增加目標酶基因的多樣性，例如，對一個酶的5個氨基酸進行飽和突變，其理論突變文庫大小能達到205，那么如何從此大型文庫中獲得目標單一突變體是關鍵問題。如果利用傳統(tǒng)微孔板篩選［13］，需耗費大量的成本和時間，因此高通量篩選方法在酶定向進化中顯得尤為重要。

近幾年來，具有高通量、耗費低、誤差小、精度高等優(yōu)勢的FACS，已經(jīng)廣泛應用于大型突變文庫的篩選，其篩選通量從傳統(tǒng)篩選方法的1/s提高到104/s［8］，并且在篩選流程中的培養(yǎng)基消耗量相較于傳統(tǒng)篩選可以忽略不計。利用傳統(tǒng)微孔板篩選約105大小的突變庫，至少需要104mL培養(yǎng)基，而FACS僅需數(shù)毫升。同時，F(xiàn)ACS可以減少培養(yǎng)過程中人工干預所帶來的誤差，并且相較于傳統(tǒng)酶標儀檢測具有更高的熒光檢測精度。由此，本文首先概述了FCM的發(fā)展歷程和原理，并簡述了基于FACS技術建立的流式細胞分選儀。隨后，詳細討論了FACS在酶定向進化中的應用現(xiàn)狀及局限，并展望了FACS在該領域中的發(fā)展方向和前景。

1 FCM和FACS

1.1 FCM的發(fā)展及應用

FCM是一種用于分析、計數(shù)、分類單個細胞的技術，具有高分辨率、高通量和多參數(shù)分析等優(yōu)點，廣泛應用于生命科學領域，例如免疫學、細胞學、腫瘤學、生殖學、遺傳學、神經(jīng)科學等。其發(fā)展歷史可以追溯到20世紀50年代，主要經(jīng)歷了3個階段。早期流式細胞術：FCM主要被用于血細胞計數(shù)。1969年，Leonard Herzenberg和他的團隊成功地使用基于FCM搭建的流式細胞儀對免疫細胞進行分析，主要使用光散射和熒光染色等技術來對細胞進行分類和計數(shù)，證明了FCM在免疫學研究中的潛力［14］。多參數(shù)流式細胞術：在20世紀80年代和90年代，隨著熒光染料和光學檢測技術的發(fā)展，F(xiàn)CM實現(xiàn)了多參數(shù)分析［15］?，F(xiàn)代流式細胞術：隨著20世紀末期和21世紀初期生物技術的迅速發(fā)展，F(xiàn)CM開始往單細胞基因表達分析［16］、細胞分選［17］和多模態(tài)成像［18］等方向發(fā)展，并衍生出光譜流式細胞術［18］、成像流式細胞術［19］和質譜流式細胞術［20］等技術。

FCM在全血細胞計數(shù)［21］、循環(huán)腫瘤細胞檢測［22］、熒光原位雜交［23］、抗原檢測［24］和細胞增殖和凋亡測定［25］等領域有著廣泛的應用［26-27］。目前，基于FCM開發(fā)了各種市場化的流式細胞儀，主要分為有聲聚焦流式細胞儀、細胞分選儀、成像流式細胞儀、質譜流式細胞儀、全光譜流式細胞分析儀、基于微珠矩陣分析細胞儀和納米流式細胞儀等［27-33］。

1.2 FACS的原理及相關儀器

1.2.1 FACS的原理 FACS的基本原理是單個細胞依次通過一個細管，并對攜帶熒光信號的細胞進行定量檢測、數(shù)據(jù)分析和細胞分選［8］。主要流程包括：（1）樣品制備，制備單細胞懸液；（2）標記細胞，利用熒光染料標記單細胞；（3）信號檢測，通過流式細胞儀獲取前向散射光（forward scatter，F(xiàn)SC）、側向散射光（side scatter，SSC）和熒光信號等數(shù)據(jù)；（4）分析和數(shù)據(jù)處理，電子器件對檢測到的信號進行處理，將其轉換成數(shù)字信號，計算機軟件對數(shù)字信號進行分析和處理，例如數(shù)據(jù)統(tǒng)計、細胞計數(shù)、細胞排序和可視化顯示等；（5）細胞分選，對細胞群體進行數(shù)據(jù)分析后，可依據(jù)熒光信號強度或細胞大小等選擇性地對包裹單細胞的液滴進行加電，并通過電場力的作用收集單細胞到指定容器中。

1.2.2 熒光信號 FACS依賴于熒光信號，熒光是一種光致發(fā)光的現(xiàn)象，即某種物質經(jīng)入射激光（激發(fā)光）照射后，吸收光能并瞬間進入激發(fā)態(tài)，隨后立即退出激發(fā)態(tài)并發(fā)射出比激發(fā)光波長長的發(fā)射光，該發(fā)射光的波段通常為可見光。計算機軟件將檢測到的熒光信號數(shù)字化，這些數(shù)據(jù)用于分析細胞的熒光特性，例如熒光強度的分布、熒光峰值的位置和形狀等。

通常，可采用如下方法使細胞攜帶熒光信號：熒光染料染色、表達熒光蛋白和添加熒光標記底物。常用熒光染料包括小分子有機染料［34］、量子點［35-36］、藻膽蛋白［37］和熒光示蹤染料（核酸染料、細胞質染料和膜結合染料）［17］等。細胞表達的不外泌熒光蛋白包括藍色熒光蛋白（BFP）、青色熒光蛋白（CFP）、綠色熒光蛋白（GFP）、黃色熒光蛋白（YFP）、紅色熒光蛋白（RFP）及其各種衍生物，如eGFP、Super?folder GFP、eCFP和eYFP等［38］。添加可溶性熒光標記底物的方法主要包括：首先將底物進行熒光標記，隨后通過液滴微流控芯片將熒光標記底物和細胞一起封裝在均勻分散的液滴內，每個液滴的體積及其內部的熒光標記底物濃度均是相同的。細胞表達的酶可將熒光標記底物轉化為熒光產(chǎn)物來作為細胞的熒光信號［39-40］。

1.2.3 流式細胞分選儀 流式細胞分選儀是一種基于FACS技術而設計的單細胞分析和分選設備，其已廣泛應用于生物學、醫(yī)學和生物技術領域。該設備能夠快速地分析細胞或顆粒的多個參數(shù)，包括大小、復雜度、表面標記和熒光信號等，以獲取大量的細胞特征信息。流式細胞分選儀的工作原理是利用細胞或顆粒在鞘液中流動時，通過檢測激光照射后發(fā)射出的熒光信號和散射光信號來識別和分析細胞或顆粒的特征，通過計算機控制選擇性地收集具備一定特征的目標細胞。流式細胞分選儀的基本組成部分包括液流系統(tǒng)（產(chǎn)生單液滴）、光學系統(tǒng)（信號檢測）、電子控制系統(tǒng)（分選細胞）和計算機系統(tǒng)（分析信號數(shù)據(jù)）等。

2 酶定向進化

天然酶具有豐富的結構和生化特性，但由于其催化性能的局限性，導致僅有少部分天然酶能直接用于工業(yè)生產(chǎn)［40-41］。為了提高天然酶的催化性能，擴大其工業(yè)生產(chǎn)范圍，定向進化方法應運而生，利用此方法可以改善酶的耐受性、特異性和穩(wěn)定性等［42］，以適應工業(yè)生產(chǎn)。定向進化主要有3個步驟：（1）構建突變文庫。通過隨機突變、定點突變、飽和突變和DNA重組等技術手段［10-12］對目標酶基因造成大量突變，以此構建目標酶基因的突變文庫；（2）篩選突變文庫。利用特定的篩選方法對具有一定表型的突變體進行高通量篩選，例如熒光信號、吸光度等；（3）迭代。將回收的優(yōu)勢突變體再次構建突變文庫，并篩選突變文庫，這種循環(huán)迭代的方法能夠提高酶定向進化的效率。

目前，主要用于酶定向進化的篩選方法有平板或微孔板、FACS［8］和熒光激活液滴分選（fluorescence?activated droplet sorting，F(xiàn)ADS）［43］等技術。相較于平板或微孔板篩選，F(xiàn)ACS和FADS不僅具有通量更高的優(yōu)點，同時具有培養(yǎng)體系簡便、培養(yǎng)基使用量少、選擇壓力均衡等優(yōu)勢。例如，在構建文庫后可直接混合宿主細胞進行培養(yǎng)，無需建立單個突變體的單反應培養(yǎng)體系，而且每個突變體受到的選擇壓力是完全相同的，極大減少了人工干預造成的誤差。FACS和FADS在鞘液、分選方式和假陽性方面存在一些差異。FACS是使用經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后的PBS或蒸餾水作為鞘液，無法使用腐蝕性或黏稠性液體作為鞘液，而FADS通常使用黏性較大的油作為鞘液。FACS主要通過對包含細胞的液滴加電，隨后在電場力的作用下將細胞收集到指定容器中來實現(xiàn)細胞分選，而FADS則是在液滴流動通道的一側利用介電泳力來實現(xiàn)細胞分選。當將熒光產(chǎn)物固定在細胞表面時，由于FACS分選前細胞是混合培養(yǎng)的，存在熒光產(chǎn)物可能會轉移到其他細胞表面的風險，容易產(chǎn)生假陽性結果，而FADS采用液滴間隔單細胞培養(yǎng)的方法，極大地降低了假陽性的風險。本文總結了定向進化中的傳統(tǒng)篩選（平板、微孔板）、FACS和FADS篩選方法的通量、突變文庫大小、優(yōu)缺點等信息，如表1所示。

表1 篩選方法比較Table 1 Comparison of screening methods

FACS應用于酶定向進化的主要流程如圖1所示［8,52］。首先，需構建含有目標酶基因的質粒突變文庫，并通過熒光標記底物、生物傳感器偶聯(lián)酶自產(chǎn)熒光蛋白等建立熒光表型，然后將質粒文庫轉化進宿主細胞中，如大腸桿菌（Escherichia coli）、酵母細胞（Saccharomyces cerevisiae）、桿狀病毒、哺乳動物細胞等；隨后，培養(yǎng)宿主細胞以產(chǎn)生熒光信號表型；最后，利用FACS對有熒光信號表型的宿主細胞進行高通量篩選，基于熒光強度的高低分選目標宿主細胞，對分選得到的目標宿主細胞進行富集培養(yǎng)，測序驗證目標酶的突變位點，同時可進行重復分選或定向進化。本文以大腸桿菌自產(chǎn)GFP熒光蛋白為例，說明FACS在酶定向進化中的應用原理（圖1），詳細熒光信號表型在下文中概述。

圖1 FACS與酶定向進化的結合Fig. 1 Incorporation of FACS and directed evolution of enzyme

細胞表達酶后，酶的位置可以分布在細胞表面、細胞內和細胞外，分別形成細胞表面酶、胞內酶和分泌酶，如何將不同位置酶的活性與熒光信號偶聯(lián)是FACS進行高通量篩選的關鍵問題，同時為提高單細胞熒光信號檢測的準確性，需保證突變文庫中不同細胞的熒光信號互不干擾。本文將從細胞表面酶、胞內酶、分泌酶與熒光信號的偶聯(lián)關系出發(fā)，闡述了FACS高通量篩選的設計原則，并列舉相關應用實例。

3 FACS在非分泌酶定向進化中的應用

在非分泌酶（細胞表面酶和胞內酶）的定向進化篩選中，基于酶的存在位置和熒光信號來源，可以將其篩選分為3種方式：第1種是熒光標記底物（如熒光素、BODIPY、香豆素等熒光基團［53］）篩選細胞表面酶，此方法的目標酶通常暴露于細胞表面，其催化底物后產(chǎn)生的熒光產(chǎn)物會通過靜電力作用、共價或非共價鍵的方式保留在細胞表面；第2種是熒光標記底物篩選胞內酶，此方法的目標酶存在于細胞內，其熒光產(chǎn)物不能擴散出細胞；第3種是生物傳感器篩選胞內酶，此方法通過使用對底物或產(chǎn)物有響應的生物傳感器，并由此驅動熒光蛋白表達，通過檢測熒光強度來衡量目標酶活性，本文主要以轉錄因子調控的生物傳感器舉例。因此，對于非分泌酶的突變文庫篩選，F(xiàn)ACS可直接對單細胞進行多指標評價，然后將符合一定指標數(shù)值的細胞挑選出來。在篩選前無需對樣品進行特殊處理，僅稀釋到合適濃度即可。一般情況下，生成封裝單細胞液滴的縮流管（噴嘴）的孔徑應大于細胞顆粒直徑的5倍，同時需根據(jù)縮流管的堵塞情況來調節(jié)鞘液流速和樣品稀釋倍數(shù)。基于FACS篩選細胞表面酶和胞內酶的應用實例如表2所示。

表2 FACS在非分泌酶中的應用Table 2 Application of FACS in non-secretory enzymes

3.1 熒光標記底物篩選細胞表面酶

細胞表面酶是一類嵌入細胞膜中的酶，具有廣泛生物學功能。FACS篩選細胞表面酶的主要步驟包括：首先將熒光標記基團結合到底物上，制備出熒光標記底物，并將其結合到細胞表面，表面酶催化熒光標記底物后釋放的熒光基團被保留在細胞膜上，以此通過熒光強度來表征目標酶的活性；隨后，通過FACS檢測熒光信號并篩選出具有特定功能的突變體；最后，通過DNA測序確定優(yōu)勢突變體的突變位點，具體流程如圖2?a所示［31,69］。目前，此方法已經(jīng)實現(xiàn)多種細胞表面酶的篩選。例如，Olsen等［54］設計了具有Arg?Val切割序列的FRET?肽底物，此底物攜帶正電荷，能夠吸附在帶負電的細胞膜表面，經(jīng)絲氨酸蛋白酶OmpT裂解后可釋放帶正電的熒光產(chǎn)物，此產(chǎn)物同樣會吸附在細胞表面。此研究利用該機制，通過FACS篩選了大小為6×105的OmpT酶突變文庫，并獲得了催化活性比野生型高60倍的OmpT突變體。Chen等［55］通過整合酵母表面展示和酶介導的生物偶聯(lián)技術，并結合FACS建立一種用于分選酶A定向進化的高通量篩選方法。通過FACS成功地實現(xiàn)分選酶A轉肽活性的6 000倍富集，證明了此方法的實用性。同時利用FACS篩選大小為7.8×107的分選酶A突變文庫，并獲得了相對于野生型分選酶A催化活性提高140倍的分選酶A突變體。

圖2 FACS篩選非分泌酶Fig. 2 FACS screening of non-secretory enzymes

在FACS高通量篩選細胞表面酶的方法中，一般使用FRET技術［52］將熒光基團標記后的熒光底物保留在細胞膜上，酶催化釋放后的熒光基團能夠保留在細胞表面，從而構建基因型與表型的聯(lián)系，但該方法仍有技術局限，例如，F(xiàn)RET標記后的底物有可能會影響酶的催化活性；細胞膜上的熒光信號容易發(fā)生漂移；適合熒光標記底物的酶大多為水解酶和氧化還原酶。

3.2 熒光標記底物篩選胞內酶

胞內酶是不分泌到細胞外的一類酶，其作用是催化和調節(jié)細胞內的代謝和信號傳遞過程。胞內酶可分為多種類型，例如水解酶、氧化還原酶、脫羧酶、轉移酶等，還有一些重組酶、熒光蛋白、絲氨酸蛋白酶等外源基因表達的酶，不同類型的酶參與不同代謝途徑和信號轉導通路，具有重要生物學功能。

利用熒光標記底物篩選胞內酶，首先需要將熒光標記結合到底物上，隨后將熒光標記的底物添加到培養(yǎng)基中，熒光標記底物進入細胞后，被胞內酶催化生成帶有熒光的產(chǎn)物或與胞內酶結合，形成熒光標記的胞內酶復合物，產(chǎn)物或復合物無法擴散出細胞，通過熒光信號檢測，篩選出具有特定功能的突變體，如圖2?b。目前，已有研究應用該方法對多種胞內酶實現(xiàn)了定向進化。例如，Yang等［57］利用FACS對中性糖轉移酶β-1,3?半乳糖基轉移酶（CgtB）的突變文庫（＞107）進行了篩選，使用兩種熒光基團（綠色熒光基團和藍色熒光基團）來標記底物（GalNAc類似物），分別獲得綠色熒光標記底物和藍色熒光標記底物，這兩種底物可以自由穿過細胞膜。這兩種熒光標記底物進入細胞后，會被胞內CgtB催化產(chǎn)生的相應產(chǎn)物，這些產(chǎn)物無法進出細胞，通過檢測細胞的綠色熒光和藍色熒光來判斷CgtB的催化活性高低，從而進行后續(xù)的檢測和篩選。最終，通過FACS篩選獲得了比天然CgtB活性提高了300倍的突變體。Kova?evi?等［61］通過酪酰胺熒光標記和酵母增強型GFP（yGFP）來量化葡萄糖氧化酶的催化活性，yGFP具有保留在酵母細胞表面的特性。在對葡萄糖氧化酶突變文庫進行FACS篩選后，獲得了兩個相較于野生型葡萄糖氧化酶催化活性分別提高1.3和2.3倍的葡萄糖氧化酶突變體。Meister等［64］設計了一個N端為Aβ1?42肽，中間是一個蛋白酶裂解位點，C端是增強型綠色熒光蛋白（eGFP）的報告蛋白，此報告蛋白能夠被3C蛋白酶裂解從而釋放eGFP產(chǎn)生熒光信號，且酶活與熒光強度成正比?；谠摲椒?，通過FACS從大小為2.3×107的3C蛋白酶突變文庫中獲得了對底物LEVLFQ↓GP分解活性提高4倍的3C蛋白酶突變體。

基于熒光標記底物的FACS高通量篩選方法雖然簡單易行，但其存在熒光標記底物和熒光產(chǎn)物限制的問題。首先，酶促反應底物需要具有可自由滲透細胞的特性。其次，酶對于熒光標記底物的催化性能可能會降低，容易出現(xiàn)假陰性的問題。最后，酶促反應生成的熒光產(chǎn)物應無法擴散至胞外。然而，僅有少量符合這些要求的熒光標記底物和熒光產(chǎn)物，因此需根據(jù)實際需求人工設計合理的熒光標記底物。

3.3 生物傳感器篩選胞內酶

利用生物傳感器篩選胞內酶是通過構建響應底物或產(chǎn)物的生物傳感器，利用生物傳感器驅動熒光蛋白表達來衡量目標酶的活性高低。常見的有轉錄因子調控和核糖開關調控的生物傳感器，本文以基于轉錄因子的生物傳感器為例，目標酶的底物或產(chǎn)物首先結合轉錄因子，形成復合體，復合體結合到熒光蛋白基因的啟動子上游序列，激活熒光蛋白的表達，熒光蛋白表達量通常與底物或產(chǎn)物濃度成正比，底物和產(chǎn)物濃度的變化直接反映出酶活性的變化［70］，基于此，實現(xiàn)后續(xù)的FACS篩選步驟，如圖3［31,69］?；谏飩鞲衅?，F(xiàn)ACS已實現(xiàn)對多種胞內酶的篩選。例如，Della等［62］對轉錄因子LysG進行了半理性設計，獲得了LysG突變體，此突變體不與L?賴氨酸結合，但對L?組氨酸和L?精氨酸有顯著結合能力。隨后，利用LysG突變體構建了生物傳感器pSenHis，LysG突變體與L?組氨酸或L?精氨酸結合后，能夠激活相應啟動子，驅動熒光蛋白EYFP的合成，由此在細胞內建立熒光篩選標記，可用于胞內酶的高通量篩選?；诖耍肍ACS從107個化學誘變的谷氨酸棒狀桿菌突變文庫中篩選獲得了多個高產(chǎn)L?組氨酸的突變株，其中217個突變株可生產(chǎn)超過0.1 mmol/L L?組氨酸。通過測序發(fā)現(xiàn)所有突變株在編碼ATP?磷酸核糖轉移酶的hisG基因上都發(fā)生了突變。Michener等［65］開發(fā)了能夠響應代謝物茶堿的RNA開關調控的生物傳感器，此生物傳感器表達產(chǎn)生GFP作為熒光信號，在釀酒酵母體內咖啡因可被咖啡因去甲基化酶分解產(chǎn)生茶堿，從而激活RNA開關表達GFP。基于此方法，通過FACS篩選獲得了酶活提高33倍和底物專一性提高22倍的咖啡因去甲基化酶突變體。Zhang等［68］使用響應L?絲氨酸的轉錄因子NCgl0581，此轉錄因子可啟動增強型黃色熒光蛋白（eYFP）的表達作為熒光信號，并結合FACS建立L?絲氨酸生產(chǎn)菌株的高通量篩選體系。此研究首先對谷氨酸棒狀桿菌進行常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變建立突變文庫，隨后使用FACS篩選此突變文庫，最終獲得了一株L?絲氨酸高產(chǎn)菌株A36?pDser，其L?絲氨酸產(chǎn)量達到34.78 g/L，相對于出發(fā)菌株的提高了35.9倍。

基于生物傳感器的高通量篩選方法依賴于生物傳感器。生物傳感器是一種靈敏度高、特異性強、可重復性高且能夠實時監(jiān)測的篩選工具，尤其對于低表達量的酶，能明顯降低假陰性的發(fā)生概率。但目前適用于酶篩選的天然生物傳感器數(shù)量有限且特異性不高，而且在底物和產(chǎn)物的結構變化很小時無法區(qū)分底物和產(chǎn)物，導致高通量篩選中可能會出現(xiàn)假陽性。為了解決這些問題，需從啟動子、轉錄因子或DNA 結合位點等方面改造生物傳感器，以使其具有更高的特異性和靈敏性。

4 FACS在分泌酶定向進化中的應用

傳統(tǒng)篩選分泌酶的方法主要有微孔板篩選和平板篩選，這些方法設備相對便宜，操作簡單。平板篩選主要是在培養(yǎng)平板上添加底物，隨著培養(yǎng)時間的增加，細胞分泌目標酶到平板上，菌落周圍會呈現(xiàn)出區(qū)別于普通菌落的顏色或熒光。平板篩選具有材料成本低和快速篩選的優(yōu)點，但其通量低，能夠篩選的突變體數(shù)量少，菌落顏色比較僅是一種定性和半定量分析，人工誤差大［45］。微孔板篩選是挑取每一個突變體菌落至微孔中培養(yǎng)，培養(yǎng)至一定時間后裂解細胞釋放酶并添加底物，隨后對產(chǎn)物進行檢測。微孔板篩選相較于平板篩選，有更寬的動態(tài)范圍，在定量分析上優(yōu)于平板篩選。但其也有通量低、操作繁瑣、材料成本高、設備昂貴的缺點。微孔板篩選還存在一些局限性。首先，由于微孔的體積和表面積有限，通氣性差，不適用于需要長時間生長或需要復雜培養(yǎng)條件的菌株。其次，由于每個微孔中只能容納有限數(shù)量的細胞，對于某些低表達量的酶，可能會出現(xiàn)假陰性的情況。分泌酶的FACS篩選，具有通量高、易定量、操作簡單、材料成本低的優(yōu)點，突破了傳統(tǒng)方法的局限，在分泌酶定向進化領域具有巨大的潛力［13］。目前，常用雙乳化液滴法和水凝膠微珠法來輔助FACS篩選分泌酶，生成液滴的方法通常為：T型通道法、流動聚焦法和共流聚焦法等［71］。為符合大多數(shù)流式細胞分選儀對分析和分選顆粒的標準直徑要求，這兩種方法應控制生成的液滴或微珠直徑約為50 μm左右［71-73］。基于FACS的分泌酶篩選實例如表3所示。

表3 FACS在分泌酶中的應用Table 3 Application of FACS in secretory enzymes

4.1 雙乳化液滴法

該方法主要使用液滴微流控芯片通過油（礦物油、氟化油和植物油等）包水的方式將熒光標記底物和表達酶突變體的細胞共同封裝在一起，在外部進行培養(yǎng)后使用微流控芯片以水為流動相去包裹上述的油包水液滴，從而形成水包油包水的雙乳化液滴，具體流程如圖4?a［76］。雙乳化液滴的最外層是水相，因此FACS可直接篩選此雙乳化液滴，從而能夠從數(shù)百萬甚至更多的突變體文庫中快速、定量地分離目標突變體。Bernath等［83］率先證明了雙乳化液滴可在FACS上分選并能夠實現(xiàn)正確結果的富集。Aharoni等［74］構建了包含超過107個表達血清對氧磷酶（PON1）突變體的大腸桿菌文庫，這些突變體被封裝在雙乳液中，通過FACS篩選，獲得了活性提高100倍的PON1突變體。Menghiu等［77］在大腸桿菌中建立幾丁質酶A的突變文庫，幾丁質酶A可分解底物4?甲基傘形酮基β-d?N, N′, N′?三乙?；鶜と擒諡??甲基傘形酮，此產(chǎn)物在激發(fā)光波長為365 nm下發(fā)射出波長為460 nm的信號，以此衡量幾丁質酶A的活性。最終，通過FACS篩選幾丁質酶A突變文庫，獲得了12個酶活提高兩倍的幾丁質酶A突變體。

圖4 FACS篩選分泌酶Fig. 4 FACS screening secretases

雙乳化液滴法具有高穩(wěn)定性、高可控性、可重復性強的優(yōu)點，有助于保持液滴內酶的活性和穩(wěn)定性，通過控制液滴尺寸可提高篩選效率。雙乳化液滴存在以下限制：因雙乳化液滴不如單乳化液滴穩(wěn)定，因此需要在第二次包埋液滴時平衡流動相和分散相的流速以及表面張力等參數(shù)以生成穩(wěn)定、尺寸均一和單分散性好的雙乳化液滴；雖然液滴之間的體系是相對封閉的，但當參與反應的底物或產(chǎn)物具有揮發(fā)特性時，雙乳化液滴的定量分析將會受到干擾。

4.2 水凝膠微珠法

利用液滴微流控技術可生成各種形狀的微凝膠體，包括中空和圓柱形凝膠纖維、球體、圓盤和膠囊（核-殼結構）等。常用的水凝膠分為兩類：天然水凝膠和合成水凝膠，如表4所示。

表4 水凝膠類型Table 4 Types of hydrogels

水凝膠微珠法需要利用液滴微流控和膠凝基質（如瓊脂糖）將熒光標記底物、培養(yǎng)基等和表達酶的單細胞包裹在微珠中，然后利用FACS進行高通量分選。首先將細胞和瓊脂糖溶液混合，隨后利用液滴微流控芯片生成包裹細胞的瓊脂糖微珠，微珠懸浮在含有酶促底物的油相中。在過夜培養(yǎng)后，熒光標記底物被分泌酶催化后生成熒光產(chǎn)物。因油相的隔絕，熒光產(chǎn)物不會擴散到其他微珠中。最后進行變溫和洗滌等多個步驟形成不會形變且大小均一的固體微珠，并利用FACS對這些微珠進行篩選，如圖4?b［87］。Eun等［79］利用此方法將大腸桿菌封裝在瓊脂糖微珠中，首先確定了利福霉素對大腸桿菌的最小抑制生長濃度。隨后，此研究將大腸桿菌MG1655?ptetEGFP包裹在瓊脂糖微珠中，并將其與利福霉素混合，MG1655?ptetEGFP在代謝過程中會表達eGFP熒光蛋白。具有耐藥性的MG1655?ptetEGFP單細胞會在瓊脂糖微珠中生長形成發(fā)出綠色熒光的單菌落。利用FACS篩選到具有綠色熒光的微珠，通過測序發(fā)現(xiàn)自發(fā)耐藥性突變靶點是RNA聚合酶的β亞基RpoB，集中的突變位點是Q513L。使用水凝膠微珠法獲得自發(fā)耐藥突變體所需的時間和檢測單細胞數(shù)量比傳統(tǒng)的平板篩選分別減少了8倍和150倍。Ma等［81］利用此方法將生產(chǎn)木聚糖酶的畢赤酵母和熒光標記的木聚糖底物共同封裝在瓊脂糖水凝膠微珠中，木聚糖酶水解底物后產(chǎn)生熒光信號。存在優(yōu)勢木聚糖酶突變體的凝膠微珠具有更高的熒光強度，經(jīng)過對大約108個突變體進行3輪FACS篩選和誘變后,獲得了一個木聚糖酶活性提高1.3倍的畢赤酵母菌株突變體。此研究證明基于水凝膠微珠法的FACS篩選相對于機器人輔助的微孔板篩選通量至少提高103倍，試劑消耗量減少了106倍，并且篩選前的孵化時間大大縮短，極大地加速了酶定向進化的進程。

水凝膠微珠法在FACS高通量篩選酶中具有高通量、適用于復雜反應體系、篩選效率高、篩選準確性高等優(yōu)點。但水凝膠微珠法也存在一些局限性，例如，制備過程中使用的膠凝物質可能對細胞產(chǎn)生毒性；水凝膠微珠可能會受到機械剪切的影響，導致破裂或形狀變化，微珠尺寸不均勻可能導致分離效率低下和篩選結果不理想；微珠尺寸較大，需要調整FACS儀器參數(shù)和流速以確保準確分選和統(tǒng)計分析。

5 總結與展望

近年來，隨著熒光標記、生物傳感器、液滴微流控等技術的快速發(fā)展，基本滿足了大多數(shù)酶基因型和熒光表型偶聯(lián)的需求，也因此FACS在酶定向進化領域的應用范圍日益擴大。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，F(xiàn)ACS對熒光信號表型的篩選已經(jīng)從單色熒光檢測發(fā)展到多色熒光同時檢測，通量達到了104/s以上。本文首先簡要概述了FACS的基本理論、流式細胞分選儀的組成和原理。隨后重點探討了FACS高通量篩選不同酶的方法及相關問題。通過本文的闡述，旨在為酶定向進化過程中建立高通量篩選方法提供參考，以加快酶定向進化的進程。

雖然FACS是一種加速酶定向進化獲得優(yōu)勢突變酶的有效方法［88］，但現(xiàn)有的FACS相關方法仍然存在一些問題。例如，雙乳化液滴和水凝膠微珠方法易發(fā)生液滴合并，且工藝高度復雜等問題［89］；采用液滴微流控直接生成包含DNA或者RNA文庫的液滴，會造成文庫中遺傳信息多樣性的損失。此外，偶聯(lián)基因型和熒光表型的方法存在局限性，例如，底物熒光標記法或生物傳感器仍無法涵蓋所有酶，因此需開發(fā)不依賴熒光的高通量篩選方法。目前，液滴微流控領域建立了吸光度激活液滴分選技術（absorbance?activated droplet sorting，AADS），通過檢測吸光度來實現(xiàn)細胞分選，相關研究已證明了AADS對于酶定向進化的實用性［90］。盡管其通量為每秒1 000個液滴，但這種方法擺脫了分選過程中對于熒光信號的依賴。未來，將AADS技術與FACS技術進行交叉融合，可提高AADS技術的分選通量，同時使FACS技術不再受限于熒光信號，從而進一步擴大FACS技術的應用范圍。

此外，對于未知結構和機理的酶，定向進化通常會使用隨機突變構建突變文庫。酶的突變文庫能夠達到20N（N為蛋白質一級序列長度）量級［91］。對于這種巨型文庫，F(xiàn)ACS對其篩選也需耗費大量時間。近年來，機器學習、深度學習等人工智能技術已被應用于酶定向進化領域，其能夠快速找到未知結構和機理酶的合理突變序列空間，從而對酶的突變進行理性設計，減小突變文庫的規(guī)模，實現(xiàn)小而精突變文庫的構建［91-94］。將人工智能與FACS結合，能夠減小FACS對上述巨型文庫篩選的難度，同時使得FACS快速準確地從小而精突變文庫中篩選出優(yōu)勢酶突變體。新技術的發(fā)展和不同技術之間的交叉融合，為FACS技術在酶定向進化中的應用提供了更多可能性和潛力。隨著這些技術的不斷發(fā)展和改進，我們可以期待更高效、更準確的高通量篩選方法。

致謝

感謝北京理工大學生物與醫(yī)學工程公共實驗中心提供的流式細胞分選儀FACS BD Aria II，感謝孫立權、羅茂國等在技術上提供的幫助。